SnRK1的β亚基在水稻抗稻瘟病菌和白叶枯菌中的应用

snrk1的
β
亚基在水稻抗稻瘟病菌和白叶枯菌中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，涉及与植物抗病性相关的snrk1的β亚基蛋白及其编码基因与应用。


背景技术：

2.snf1-related protein kinase 1(snrk1)与酵母的snf1和哺乳动物的ampk同源，属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族。snrk1充当细胞能量传感器，在能量供应变得有限时诱导分解代谢反应并抑制消耗能量的合成代谢过程。植物snrk1是一种异源三聚体复合物，包括起催化功能的α亚基(snrk1α1，snrk1α2和snrk1α3)和起调节作用的β亚基(snrk1β1，snrk1β2和snrk1β3)和βγ(snrk1βγ)亚基。
3.snrk1的α催化亚基被广泛报道参与植物免疫过程。过表达snrk1α1和snrk1α2增强水稻对稻瘟菌的抗性，而snrk1α1和snrk1α2的rnai株系表现出对稻瘟菌更加感病。
4.在大麦中过表达snrk1α增强了大麦对白粉菌的抗性，并且这种增强的抗性依赖于snrk1α的激酶活性和核定位。同样的，过表达snrk1α也增强了小麦对赤霉菌的抗性，但是snrk1αrnai小麦株系中增强了对赤霉菌的感病性，以上说明了snrk1的α催化亚基在防御多种病原物侵染时均起正调控作用。
5.β亚基可以抑制α亚基对靶基因的调控，并且可以因为改变α亚基的核质穿梭而导致的。但是目前没有报道β亚基在水稻抗稻瘟病和白叶枯病中的作用。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一类参与植物抗病性的感病基因。本发明所提供的参与植物抗病性的感病基因，即植物抗病性相关的snrk1的β亚基，名称分别为snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c。本发明利用crispr-cas9技术对3个snrk1β亚基(snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c)进行了敲除，发现β亚基表现出和α亚基相反的调控机理。缺失了3个β亚基的突变体snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c均表现出对稻瘟病菌和白叶枯菌更加抗病，而过表达snrk1β1a后水稻的感病性增强。此外，snrk1β1a突变体的农艺性状没有明显改变，说明snrk1β亚基在育种中具有较好的应用前景。
7.植物抗病性相关的snrk1的β亚基蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
8.a)氨基酸序列是序列2，4或6所示的蛋白质；
9.b)在序列2，4或6所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；
10.c)将序列2，4或6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
11.d)与序列2，4或6所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
12.为了使a)中的蛋白方便纯化，也可以在如序列2，4或6所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；所述标签可以为poly-arg(rrrrr)、poly-his(hhhhhh)、
flag(dykddddk)、strep-tag ii(wshpqfek)、c-myc(eqkliseedl)等标签。
13.上述a)-d)中的植物抗病性相关的snrk1的β亚基蛋白质一般来源于自然界中水稻中，即一般来讲，其为天然产物，也可以人工表达或者合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)-d)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1，3或5所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。其中，序列表中序列2(snrk1β1a)由290个氨基酸残基组成。序列表中序列4(snrk1β1b)由316个氨基酸残基组成。序列表中序列6(snrk1β1c)由295个氨基酸残基组成。
14.为解决上述技术问题，本发明又提供了与植物抗病性相关的snrk1的β亚基蛋白相关的生物材料
15.本发明提供的与植物抗病性相关的snrk1的β亚基蛋白相关的生物材料，为下述a1)至a13)中的任一种：
16.a1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
17.a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；
18.a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；
19.a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；
20.a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；
21.a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；
22.a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；
23.a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；
24.a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
25.a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
26.a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
27.a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
28.a13)a1)所述核酸分子转录的rna分子；或干扰所述rna分子翻译的核酸分子。
29.其中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
30.1)其编码序列是序列1，3，5或7所示的核酸分子；
31.2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且与植物抗病性相关的snrk1的β亚基蛋白的cdna分子或基因组dna分子；
32.3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且与植物抗病性相关的snrk1的β亚基蛋白的cdna分子或基因组dna分子。
33.序列表中序列1由873个核苷酸组成，自序列1的5’端第1-873位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质(snrk1β1a)；序列表中序列3由951个核苷酸组成，自序列3的5’端第1-951位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列4所示的蛋白质(snrk1β1b)；序列表中序列5由888个核苷酸组成，自序列5的5’端第1-888位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列6所示的蛋白质(snrk1β1c)。序列表中序列7由951个核苷酸组成，自序列端第1-951位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列8所示的蛋白质(3
×
ha-snrk1β1a)，其n端为3串联的ha tag序列，c端为snrk1β1a的蛋白质序列。
34.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方
法，对本发明的编码snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
35.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
36.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
37.上述生物材料中，a2)所述的含有编码snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c的核酸分子的表达盒(snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c的dna，该dna不但可包括启动snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c转录的启动子，还可包括终止snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
38.所述植物重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等，如pgreen0029、pcambia3301、pcambia1300、pcambia1301、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcg1301或其他衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区，即包含多聚腺苷酸信号和任何其他参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述多聚腺苷酸信号可引导多聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiquitin启动子(pubi)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始或邻近区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是人工合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可以不加任何选择标记基因，直接以逆境筛选转化植株等。
39.在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c转录的启动子可为ubiquitin启动子、35s启动子或actin1启动子。在本发明中，启动所述编码基因snrk1β1a转录的启动子具体为ubiquitin启动子。
40.上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明中，所述重组载体具体为将ubiquitin启动子和snrk1β1a，snrk1β1b或snrk1β1c基因插入
2618.doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2010.13.001.”中，公众可从中国农业大学获得。
68.实施例1、snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体的获得及其抗病表型鉴定
69.1.水稻snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c蛋白及其编码基因的获得
70.1.1snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c基因鉴定
71.通过对拟南芥snrk1β亚基的基因序列进行ncbi blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，得到了水稻中4个atsnrk1β的同源基因，基因id分别为loc_os05g41220(snf1-related protein kinase regulatory subunit beta-1)，loc_os07g48790(snf1-related protein kinase regulatory subunit beta-1)，loc_os03g20340(snf1-related protein kinase regulatory subunit beta-1)和loc_os09g20010(snf1-related protein kinase regulatory subunit beta-2)，通过如图1所示的进化关系和蛋白结构分析，将其分别命名为snrk1β1a(loc_os05g41220)，snrk1β1b(loc_os07g48790)和snrk1β1c(loc_os03g20340)和snrk1β3(loc_os09g20010)。
72.1.2snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体获得
73.在rice genome annotation project数据库(http://rice.uga.edu/)获得了snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c的编码序列以及蛋白序列。
74.snrk1β1a的编码序列如序列表中序列1所示，具体如下：
75.atggggaacg cgagcggcaaggaaggggaggagaacggccacgtggcggcgggggccgcc 60
76.gccggagtggctggctcggcgggggcagcggcccgggctccgccgccgcttatgccgccg 120
77.gacgccgtgatgcgggagctgcctcccccggtgccctacgtcttcacgccgcaggttcca 180
78.gtagccccactgcatatacctactgaattttctcctgttttcaacaattcatggataaat 240
79.gaatcggatgaatccaccaataaccatccccaggagaagggaattccaactttgatctca 300
80.tggagtcaaggaggaaatgaggtgtttgtggaaggatcatgggataactggacatcaagg 360
81.agggtgttagagaagtctgggaaagaccataccatattgctagttctgccatcaggggta 420
82.taccattacaggatcatcgtcgatggggaaccgaaatatgtccctgaactacctcatgtg 480
83.gctgatgagggagggcaggttgccaacctcctcgatgtccatgattatatcccagaaagc 540
84.ctgggcagcgtggcaggattcgactctcctccgtcgcctgaacacagctatgatctccag 600
85.ctcccaggtgatgaggagtttgccaaggagccacctatactgccacctcagcttgtaatg 660
86.tctgttcttggtgatactgataactctgaagaacaaactctgaagccaaagcatgttgtc 720
87.ctcaaccacctgtatatcgagaaaggatggggatcgcagtcgctgcttgctcttggagtc 780
88.actcaccggtttcaatccaagtatgtaagcttcgtgctgtacaagccgctgcgaaggtca 840
89.tccacggcgaagcgaacaaagaatggtggttaa 873
90.snrk1β1a的蛋白序列如序列表中序列2所示，具体如下：
91.mgnasgkege enghvaagaa agvagsagaa arappplmpp davmrelppp vpyvftpqvp 60
92.vaplhiptef spvfnnswin esdestnnhp qekgiptlis wsqggnevfv egswdnwtsr 120
93.rvleksgkdh tillvlpsgv yhyriivdge pkyvpelphv adeggqvanl ldvhdyipes 180
94.lgsvagfdsp pspehsydlq lpgdeefake ppilppqlvm svlgdtdnse eqtlkpkhvv 240
95.lnhlyiekgw gsqsllalgv thrfqskyvs fvlykplrrs stakrtkngg 290
96.snrk1β1b的编码序列如序列表中序列3所示，具体如下：
97.atgggcaacgcgagcggcaggctggacgacatcgccgacgccgaaatggatgacggcggc 60
98.ggaggcggcaaccgcgccggcgctggggactactcctcctcgctgcgccccatggaccgt 120
99.gctggcctcccgccgtacggcggcgccgggggaagcggcggactggtgcggcccccgtcg 180
100.tcggcagcggggtactccggcggcggagggtcgtcgtccccgccggggacccccccgcgg 240
101.ccgcactccccgcgcatgttcgtgccgcagagtcctgtaactccattgcatagagctgta 300
102.gatggacctcctccagtatttaaccagatattaacgagtgaacaagaggaggatcacgat 360
103.ggtccccctgacaagctgattcctactctgcttgtgtggactcttggagggaagaatgtc 420
104.tatatagaaggatcatgggataactggaaatcaaagcaactcgtccataaatgtggaaag 480
105.gatcactgcgtcatgttagggcttgcatctggagtttaccgttatagattcattgttgat 540
106.ggagaaagaagatttcagcctgatcgtccccgtgaagctgacattatgggcaccatttca 600
107.aatcttattgatgttcatgattatgtcccggatagcgtggacagtgtgtcagagctgatg 660
108.gctcctccatcgccggactccagctacggtttcctggctcctgacgacaaggagttcacc 720
109.aaggagcctcccgctctgccgccgcagctccacctgggcgtgctcaactcgcgaggaggc 780
110.tccggcgggaaggagggagagtgcgccatgcccaagcacaacgtcctcggccatgtcttc 840
111.atcggcaagggcaccccacccatggtcgctgccctcggcaccaccttcaggttccagtcc 900
112.aagtttgtcaccaaagtcctctacaaggccatccaaagagaggacagata g 951
113.snrk1β1b的蛋白序列如序列表中序列4所示，具体如下：
114.mgnasgrldd iadaemddgg gggnragagd yssslrpmdr aglppyggag gsgglvrpps 60
115.saagysgggg sssppgtppr phsprmfvpq spvtplhrav dgpppvfnqi ltseqeedhd 120
116.gppdkliptl lvwtlggknv yiegswdnwk skqlvhkcgk dhcvmlglas gvyryrfivd 180
117.gerrfqpdrp readimgtis nlidvhdyvp dsvdsvselm appspdssyg flapddkeft 240
118.keppalppql hlgvlnsrgg sggkegecam pkhnvlghvf igkgtppmva algttfrfqs 300
119.kfvtkvlyka iqredr 316
120.snrk1β1c的编码序列如序列表中序列5所示，具体如下：
121.atggggaacgcgagcgggcgggaggaggaccccgcggcggcggccggggagggggacgtc 60
122.gaggactcgtcggtccggtcctcggagcgcggcttcccgccgtacggcggagggggcaac 120
123.cacgtgcggcgcgcgtgctcggtgggcgtcgtcgggggcggcgggggcgccggatcgccg 180
124.cccgggagccccggccgctccctctcgccgcggatgttcgtgccccagacacctgtgcct 240
125.ccactccaaagagcagctgatgtaactccagtgttcaaccggatcttaatgaatgaacaa 300
126.gaagaggaatttgatggcccccctcaaaaggaaattcctgtcttgatcgtgtggacgctt 360
127.ggaggaaaaaatgtatctgttgaaggatcctgggataactggaaatcaaggaaacccatg 420
128.cagaaatctgggaaagatcattcgctcctgttgatacttccatcgggagtttatcgttac 480
129.agatttgttgtagatggagaaaggaaatgtcttcctgatcttccttgtgaaactgatatc 540
130.atgggcaacgctgttaaccttcttgatgttcatgattttgtccctgaaagtgttgagagt 600
131.gtggcagaatttgagcctcccccatccccagattctagctacagtatccaggcacccgag 660
132.gaaaaggatttctcaaaagagccaccggttcttccatcccaactccatctgggtgttctc 720
133.aactcacagaactctgatgaaagttgtgcacggccccagcacatagtcctcaaccacctc 780
134.ttcatcgagaaaggctggggtgcccatccgctggtggcccttggtctaacccacaggttt 840
135.gagtccaaatatgtaaccgtcgtcctgtataagcccattgaacgatag 888
136.snrk1β1c的蛋白序列如序列表中序列6所示，具体如下：
137.mgnasgreed paaaagegdv edssvrsser gfppyggggn hvrracsvgv vgggggagsp 60
138.pgspgrslsp rmfvpqtpvp plqraadvtp vfnrilmneq eeefdgppqk eipvlivwtl 120
139.ggknvsvegs wdnwksrkpm qksgkdhsll lilpsgvyry rfvvdgerkc lpdlpcetdi 180
140.mgnavnlldv hdfvpesves vaefepppsp dssysiqape ekdfskeppv lpsqlhlgvl 240
141.nsqnsdesca rpqhivlnhl fiekgwgahp lvalglthrf eskyvtvvly kpier 295
[0142]2×
ha-snrk1β1a的编码序列如序列表中序列7所示，具体如下：
[0143]
atgtacccatacgatgttcctgactatgcgtacccatacgatgttcctgactatgcgtac 60
[0144]
ccatacgatgttcctgactatgcggggaacgcgagcggcaaggaaggggaggagaacggc 120
[0145]
cacgtggcggcgggggccgccgccggagtggctggctcggcgggggcagcggcccgggct 180
[0146]
ccgccgccgcttatgccgccggacgccgtgatgcgggagctgcctcccccggtgccctac 240
[0147]
gtcttcacgccgcaggttccagtagccccactgcatatacctactgaattttctcctgtt 300
[0148]
ttcaacaattcatggataaatgaatcggatgaatccaccaataaccatccccaggagaag 360
[0149]
ggaattccaactttgatctcatggagtcaaggaggaaatgaggtgtttgtggaaggatca 420
[0150]
tgggataactggacatcaaggagggtgttagagaagtctgggaaagaccataccatattg 480
[0151]
ctagttctgccatcaggggtataccattacaggatcatcgtcgatggggaaccgaaatat 540
[0152]
gtccctgaactacctcatgtggctgatgagggagggcaggttgccaacctcctcgatgtc 600
[0153]
catgattatatcccagaaagcctgggcagcgtggcaggattcgactctcctccgtcgcct 660
[0154]
gaacacagctatgatctccagctcccaggtgatgaggagtttgccaaggagccacctata 720
[0155]
ctgccacctcagcttgtaatgtctgttcttggtgatactgataactctgaagaacaaact 780
[0156]
ctgaagccaaagcatgttgtcctcaaccacctgtatatcgagaaaggatggggatcgcag 840
[0157]
tcgctgcttgctcttggagtcactcaccggtttcaatccaagtatgtaagcttcgtgctg 900
[0158]
tacaagccgctgcgaaggtcatccacggcgaagcgaacaaagaatggtgg t 951
[0159]2×
ha-snrk1β1a的蛋白序列如序列表中序列8所示，具体如下：
[0160]
mypydvpdya ypydvpdyay pydvpdyagn asgkegeeng hvaagaaagv agsagaaara 60
[0161]
ppplmppdav mrelpppvpy vftpqvpvap lhiptefspv fnnswinesd estnnhpqek 120
[0162]
giptliswsq ggnevfvegs wdnwtsrrvl eksgkdhtil lvlpsgvyhy riivdgepky 180
[0163]
vpelphvade ggqvanlldv hdyipeslgs vagfdsppsp ehsydlqlpg deefakepp i240
[0164]
lppqlvmsvl gdtdnseeqt lkpkhvvlnh lyiekgwgsq sllalgvthr fqskyvsfvl 300
[0165]
ykplrrssta krtkngg 317
[0166]
利用crispr-cas9技术对snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c进行敲除，首先在基因编码区atg后设计合适的sgrna序列，序列如表1所示：
[0167]
表1、基因敲除sgrna序列
[0168][0169]
将3个基因的sgrna序列分别构建到载体首先根据snrk1β1a、snrk1β1b和snrk1β1c靶点序列制备oligo二聚体(oligoup/lw序列见表1)。加入anneal buffer 18μl、β1a/β1b/β1c-up(10μmol/l)1μl、β1a/β1b/β1c-lw(10μmol/l)1μl，先在95℃条件下变性3min，然后以约0.2℃/s缓慢降至20℃进行退火。将上述oligo二聚体克隆到crispr/cas载体pbgk032(未米生物科技(江苏)有限公司)上，即加入pbgk032(bsai酶切线性化载体)2μl、enzyme mix 1μl、oligo二聚体1μl、ddh2o 6μl，在23℃条件下反应1h。取5μl上述反应液，加入20μl dh5α感受态细胞，通过42℃热激法转入到dh5α。经过pcr验证的转化子再次由擎科生物(北京)有限公司进行测序验证。
[0170]
构建好的crispr/cas载体通过农杆菌eha105(普如汀生物技术(北京)有限公司)导入到水稻品种zh11的胚性愈伤组织中。具体转化方法参见文献“易自力、曹守云、王力、储成才、李祥、何锶洁、唐祚舜、周朴华、田文忠，提高农杆菌转化水稻频率的研究，遗传学报，2001，28(4)：352-358”一文。
[0171]
利用引物5
’‑
gctgcgccgatggtttctacaa-3’和5
’‑
cacggcctccagaag aagatgttg-3’检测转基因t0水稻中的新霉素磷酸转移酶基因(hptii)片段，pcr扩增产物为514bp的片段的即为转基因阳性植株，得到的所有株系均为阳性转化株系。
[0172]
将阳性t0代幼苗提取dna，设计特异性引物扩增含有sgrna靶点序列，对片段进行检测snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c的基因突变类型。
[0173]
对t0代苗提取基因组dna，用表2中的check引物分别进行pcr扩增，将扩增得到的片段进行测序。根据测序结果比对，如表2和图2所示，snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c的靶点序列均有两种不同类型的突变。根据测序结果，我们分别得到了2个纯合的突变体株系(表2)，即snrk1β1a突变体snrk1β1a-2和snrk1β1a-4，snrk1β1b突变体snrk1β1b-15和snrk1β1b-19，snrk1β1c突变体snrk1β1c-7和snrk1β1c-12(图2中的b,c和d)。
[0174]
表2、snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变类型
[0175][0176]
2.snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体抗病表型测定
[0177]
2.1snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体抗瘟表型测定
[0178]
将野生型zh11，snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体种于温室内，对5叶1心时期得水稻叶片进行划伤接种稻瘟菌rb22菌株，在接种4天后拍照，snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体的病斑均小于野生型zh11的病斑(图3中a，c和e)。分别提取图3中a，c和e的叶片基因组dna，用稻瘟菌基因mopot2的表达水平来指示接种叶片中稻瘟菌的生物量。具体为用荧光定量pcr方法检测mopot2的转录水平，以水稻基因osubq为内参。实验设三次重复。数据处理采用comparative ct方法，即ct值为pcr管中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，δct＝ct(mopot2)-ct(osubq)，以2-δct
值衡量基因转录水平。稻瘟菌基因mopot2的表达量也显示了snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体病叶中稻瘟菌相对生物量明显低于野生型zh11(图3中b，d和f)，说明了snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体对稻瘟菌的抗性增强。
[0179]
此外，采用9级分级法在田间对zh11和snrk1β1a进行稻瘟菌病害调查，结果显示zh11的病情指数明显高于snrk1β1a的病情指数(图3中g和h)。
[0180]
2.2snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体抗白叶枯表型测定
[0181]
将野生型zh11，snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体种于温室内，对生长2月左右水稻叶片接种白叶枯菌pxo99。接种2周后，结果如图4所示，突变体snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c的病斑长度和生物量均显著小于野生型zh11，说明snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体对白叶枯病菌的抗性显著增强。
[0182]
实施例2、snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体在chitin处理后的pti反应
[0183]
本发明获得的snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体在病原相关分子模式chitin处理以后，表现出ros积累，mapk通路被激活和病程相关基因上调表达，说明snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c负调控pti反应。
[0184]
1.snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体在chitin处理后ros积累
[0185]
将野生型zh11，snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c突变体种于温室内，对5叶1心时期得水稻叶片用4mm直径打孔器打孔，将打孔的叶片浸泡在灭菌ddh2o中避光静置过夜。配制工作浓度为0.0125mg/ml chitin，0.05mm luminol和25μg/ml的hrp反应液(对照将chitin替换为ddh2o)。先在透明costar 96孔板中加入50μl/孔的ddh2o，将过夜浸泡的水稻叶片小心转移至每个小孔中。加入50μl/孔的不同反应液，每种处理至少设置8个生物学重复，450nm下，酶标仪检测化学发光情况。如图5中a，b和c所示，snrk1β1a，snrk1β1b和snrk1β1c
突变体在chitin处理后ros积累水平高于zh11。
[0186]
2.snrk1β1a在chitin处理后mapk通路被激活
[0187]
将zh11，snrk1β1a-2和snrk1β1a-4突变体种子去除颖壳，经无菌消毒后置于1/2ms培养基上无菌生长约10天。取生长一致的zh11，snrk1β1a-2和snrk1β1a-4幼苗浸泡在灭菌ddh2o中避光静置过夜。第二天在90mm的塑料皿中配置终浓度为0.0125mg/ml chitin反应液，快速将zh11，snrk1β1a-2和snrk1β1a-4幼苗置于其中。在0min，15min，30min和60min取样，液氮速冻备用。待样品全部取样完毕，提蛋白进行western blot。根据幼苗重量加入合适的提取buffer，包含1/10的磷酸酶抑制剂(phos-stop)，1/1000的cocktail，1/100的pmsf。先用一抗phospho-p44/p42 mapk(erk1/2)antibody(9101,cst)，1:1000(5％的bsa)，4℃孵育过夜。二抗anti-rabbit igg，hrp-linked antibody(7074,cst)，1:2000(5％的脱脂牛奶)孵育1h。chitin处理后的15min和30min，snrk1β1a-2和snrk1β1a-4突变体中mpk6和mpk3的磷酸化水平明显高于野生型zh11，说明了chitin处理后，snrk1β1a-2和snrk1β1a-4突变体mapk信号通路被激活。
[0188]
3.snrk1β1a在chitin处理后防卫相关基因上调表达
[0189]
将上述2中chitin处理的幼苗延长至6h取样，提取样品的总rna。用荧光定量pcr方法分析野生型zh11，snrk1β1a-2和snrk1β1a-4突变体中的防御相关基因pr1a、pr1b、pr4、pr5、pr5-1、pr10、wrky53和mapk1的表达情况，以水稻actin1基因为内参。引物序列如表3所示。实验设三次重复。数据处理采用comparative ct方法，即ct值为pcr管中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，δct＝ct(待测基因)-ct(actin1)，以2-δct
值衡量基因转录水平，对zh11，snrk1β1a-2和snrk1β1a-4突变体中的测定基因进行比较分析。
[0190]
表3、actin1及防御相关基因的引物序列
[0191][0192][0193]
结果如图5中e所示，所检测的防御相关基因pr1a、pr1b、pr4、pr5、pr5-1、pr10、wrky53和mapk1均呈现显著的上调表达。
[0194]
实施例3、snrk1β1a过表达株系抗瘟表型测定
[0195]
1.pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a过表达载体构建
[0196]
1.1 3
×
ha-snrk1β1a融合序列的获得
[0197]
本实施例中所涉及的基因序列为序列表中的序列7(3
×
ha-snrk1β1a融合基因序列)所示，由921个核苷酸组成。利用pcr扩增(引物为snrk1β1aoe-f:
[0198]5’‑
acgagctcttaattaaatgtacccatacgatgttcctgactatgcgtacccatacgatgttcctgactatgcgtacccatacgatgttcctgactatgcggggaacgcgagcggc-3’,snrk1β1aoe-r:5
’‑
ggtgatcggacgcgtaccaccattctttgttcg-3’，模板为水稻品种日本晴的cdna)得到3
×
ha-snrk1β1a融合序列。
[0199]
1.2植物表达载体pcambia1301-ubi的构建
[0200]
利用pcr方法，采用引物5
’‑
atagagctcgtgcagcgtgacccggt-3’(下划线部分为sac i位点)和5
’‑
ataggatccaagtaacaccaaacaacagggt-3’(下划线部分为bam hi位点)，以双元载体pubigusplus(普如汀生物技术(北京)有限公司)为模板，扩增ubiquitin启动子区域。将扩增产物回收后连接pmd18-tsimple(takara)载体并测序验证。将测序验证正确的质粒用saci和bamhi双酶切，酶切产物回收后连入pcambia1301载体(普如汀生物技术(北京)有限公司)的saci和bamhi双酶切位点，得到植物表达载体pcambia1301-ubi。
[0201]
1.3过表达载体pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a的构建
[0202]
植物表达载体pcambia1301-ubi进行paci和mlui双酶切。将酶切的pcambia1301-ubi和3
×
ha-snrk1β1a融合片段用ce重组连接酶(购自南京诺唯赞)进行连接，转化子经pcr和测序验证正确，即获得重组表达载体pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a。
[0203]
所述重组表达载体pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a为将ubiquitin启动子和3
×
ha-snrk1β1a融合基因插入pcambia1301载体的paci和mlui酶切位点间后得到的载体。在重组表达载体pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a中，驱动所述snrk1β1a基因表达的为ubiquitin启动子。在重组表达载体pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a的构建过程中，也可以人工合成序列表中序列7所示的3
×
ha-snrk1β1a基因作为模板。
[0204]
2.pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a过表达株系的获得与鉴定
[0205]
2.1、snrk1β1a超表达水稻的获得
[0206]
将上述步骤1所构建的重组表达载体pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a，通过农杆菌eha105(普如汀生物技术(北京)有限公司)导入到水稻品种zh11的胚性愈伤组织中。具体转化方法参见文献“易自力、曹守云、王力、储成才、李祥、何锶洁、唐祚舜、周朴华、田文忠，提高农杆菌转化水稻频率的研究，遗传学报，2001，28(4)：352-358”一文。
[0207]
2.2snrk1β1a超表达水稻的鉴定
[0208]
利用引物5
’‑
gctgcgccgatggtttctacaa-3’和5
’‑
cacggcctccagaag aagatgttg-3’检测转基因t0水稻中的新霉素磷酸转移酶基因(hptii)片段，pcr扩增产物为514bp的片段的即为转基因阳性植株，得到的所有株系均为阳性株系。经上述pcr鉴定，将其中2个转入pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a的转基因水稻株系分别记做t0代转snrk1β1a水稻株系snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6。
[0209]
2.3snrk1β1a超表达水稻的转录水平分析
[0210]
然后采用植物总rna提取试剂盒(购自北京庄盟生物)对野生型zh11，snrk1β1a过
表达株系(snrk1β1a oe)叶片提取总rna，再用反转录试剂盒(购自南京诺唯赞)对提取的rna转录成cdna，荧光定量pcr检测snrk1β1a的转录水平。如图6中a所示，snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6相较于野生型水稻zh11相比，snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6均上调约100倍。同时，提取了zh11，snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6的总蛋白，用anti-ha抗体检测3
×
ha-snrk1β1a表达情况，说明了snrk1β1a在snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6中表达水平远高于zh11(图6中b)。
[0211]
3.pcambia1301-ubi-3
×
ha-snrk1β1a抗瘟表型测定
[0212]
将t1代的snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6种于温室内，对5叶1心时期得水稻叶片进行划伤接种稻瘟菌rb22菌株，在接种4天后拍照，snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6的病斑均大于野生型zh11的病斑(图6中c)。稻瘟菌基因mopot2的表达量也显示了snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6病叶中稻瘟菌生物量明显高于野生型zh11(图6中d)，说明了snrk1β1a oe-3和snrk1β1a oe-6对稻瘟菌的抗性减弱，snrk1β1a负调控水稻对稻瘟菌的抗性。
[0213]
4.snrk1β1a突变体主要农艺性状测定
[0214]
对snrk1β1a突变体进行农艺性状检测，结果表明突变体snrk1β1a相较于野生型zh11,，其主要的农艺形状没有明显变化。结果如图7所示，其中，a为野生型zh11和snrk1β1a的植株样貌；b为野生型zh11和snrk1β1a的株高统计；c为野生型zh11和snrk1β1a的分蘖数统计；d为野生型zh11和snrk1β1a的成熟稻穗样貌；e为野生型zh11和snrk1β1a的每穗的籽粒数统计；f为野生型zh11和snrk1β1a的籽粒千粒重统计。

技术特征：
1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2，4或6所示的蛋白质；b)在序列2，4或6所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2，4或6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2，4或6所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述a1)至a13)中的任一种：a1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系；a13)a1)所述核酸分子转录的rna分子；或干扰所述rna分子翻译的核酸分子。3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1，3，5或7所示的核酸分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物抗病性中的应用；或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育抗病性提高的转基因植物中的应用；或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在植物育种中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述调控植物抗病性为提高或抑制植物抗病性。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述抗病性为对水稻稻瘟病和/或水稻白叶枯病的抗病性。7.一种培育抗病性提高的转基因植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1所述的
蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性的方法为抑制受体植物基因组中权利要求1所述的蛋白质的活性，或使其灭活；或，所述抑制受体植物基因组中权利要求1所述的蛋白质的活性，或使其灭活的方法包括：通过rnai技术干扰受体植物基因组中权利要求1所述的蛋白质的表达；或者突变受体植物基因组中权利要求1所述的蛋白质的编码基因使受体植物基因组中权利要求1所述的蛋白质的编码基因的表达量降低或使受体植物基因组中权利要求1所述的蛋白质的编码基因发生缺失突变或发生插入突变；或，所述突变的方式为crispr/cas9或tellen技术或t-dna插入或ems诱变；或，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1，3，5或7所示的dna分子。9.根据权利要求4-6任一所述的应用或权利要求7-8中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。

技术总结
本发明公开了与植物抗病性相关的水稻SnRK1β亚基蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的SnRK1β蛋白是序列2，4或6所示的蛋白质，SnRK1β亚基蛋白的编码基因是序列1、3或5所示的DNA分子。SnRK1β亚基的敲除增强了对水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性。在病原相关分子模式(Chitin)处理后，导致病程相关蛋白上调表达，ROS水平积累，MAPK通路被激活。此外，SnRK1β1A基因的缺失不影响水稻主要的农艺性状，说明了SnRK1β基因在增强作物抗病中具有较好的应用潜力。本发明利用基因工程手段调控SnRK1β基因的表达水平进行分子育种，在提高作物抗病性上具有潜在的应用价值。病性上具有潜在的应用价值。


技术研发人员：彭友良 袁贵鑫 卢训莉 王邢斌
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.02.14
技术公布日：2023/7/11