一种基于原位PCR检测EGFR基因L858R位点突变的引物、试剂盒和方法与流程

一种基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的引物、试剂盒和方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的引物、试剂盒和方法。


背景技术：

2.egfr是表皮生长因子受体(her)家族成员之一，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，egfr信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。然而当egfr发生突变时，导致egfr信号通路的持续激活，从而导致细胞异常增殖。egfr已经被证明在众多肿瘤的发生、发展及预后过程中发挥了重要调控作用。
3.人egfr基因21外显子上的l858r为常见的egfr突变之一，目前检测l858r突变常用的技术有arms-qpcr、数字pcr、ngs等。这些技术均存在一些弊端，如arms-qpcr灵敏度只有1％，数字pcr与ngs的灵敏度可达到0.1％，但成本较高。
4.原位pcr技术是指结合了传统pcr技术和原位杂交技术的原位多聚酶链式反应技术，兼有二者的优点，该实验技术可以在保持组织细胞形态结构的基础上，增加细胞膜的通透性，以细胞膜作为反应场所，通过前处理使得pcr体系中的引物、探针、酶系、游离核苷酸等进入核膜，与暴露的拟扩增目的dna或rna进行pcr反应，且具有较高的敏感性，可以检测出组织或细胞内的微量dna或rna并进行大量扩增，又可揭示出扩增的目的片段与目的组织之间的形态结构关系，具有良好的组织定位的能力。
5.但目前未有采用原位pcr技术检测egfr基因l858r位点突变的相关报道。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的引物、试剂盒和方法。该方法使用原位pcr技术，将引物在阴性模板延伸一个ddntp，转变成3'双脱氧引物；突变模板引物不延伸，保留3'羟基，同时在引物的5'端引入外源序列；更换为正常的pcr反应液后，与突变模板结合的引物得以延伸，而与阴性模板结合的引物终止延伸，从而将阳性突变筛选出来。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面是提供一种基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的引物，包括序列为seq id no.1～seq id no.5的引物。
9.本发明的第二方面是提供一种基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒，包括上述引物。
10.本发明的第三方面是提供一种采用上述引物或试剂盒的基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的方法，包括如下步骤：
11.步骤一，将样本的组织切片进行固定、消化、封片后采用序列分别为seq idno.1和
seq id no.2的上、下游引物进行预扩增；
12.步骤二，去除封片剂，滴加无taq酶的pcr反应液覆盖标本区，常温预处理；
13.步骤三，采用序列为seq id no.3的下游引物进行扩增；
14.步骤四，重复步骤二，用手术刀片刮下玻片上的组织，提取dna，采用序列为seq id no.4和seq id no.5的引物对进行pcr扩增后进行测序。
15.进一步地，步骤一中采用蛋白酶k对组织切片进行固定；该蛋白酶k的浓度为15-30μg/ml，优选为20μg/ml。
16.进一步地，步骤一中消化的条件为50-60℃，消化时间为1.5-2小时。
17.进一步地，在步骤一中，封片前滴加无taq酶的pcr反应液覆盖标本区，常温预处理30分钟。
18.进一步地，步骤一和步骤四中的扩增体系如下：
[0019][0020][0021]
进一步地，步骤一中预扩增的扩增程序为：95℃2分钟；95℃2分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，10个循环。
[0022]
进一步地，步骤三中的扩增体系如下：
[0023][0024]
进一步地，步骤三中的扩增程序为：95℃3分钟，50℃5分钟。
[0025]
进一步地，步骤四中的扩增程序为95℃2分钟；95℃2分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，35或8个循环。
[0026]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0027]
本发明提供的方法采用原位pcr技术检测egfr基因l858r位点突变，具有灵敏度高，可检测出10-5
单碱基突变，且成本较低，适合大规模推广。
附图说明
[0028]
图1是本发明一实施例中阴阳性模板被扩增的结果，其中，b代表碱基g、c、t任意一种；
[0029]
图2为本发明一实施例中样本1在显微镜下的观察结果；
[0030]
图3为本发明一实施例中样本2在显微镜下的观察结果；
[0031]
图4为本发明一实施例中样本3的测序结果；
[0032]
图5为本发明一实施例中样本4的测序结果；
[0033]
图6为本发明验证实施例中对照组a的测序结果；
[0034]
图7为本发明验证实施例中检测组b的测序结果。
具体实施方式
[0035]
本发明提供了一种基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的引物、试剂盒和方法。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0036]
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0037]
实施例1
[0038]
1、取四张egfr l858r弱阳性组织切片，分别标记1、2、3、4，其中样本1：原位pcr阴性对照，样本2：原位pcr阳性对照，用以检测原位pcr是否成功，样本3：测序阴性对照，样本4：测序阳性对照；对于四个样本的处理如下表1。按常规操作烤片、脱蜡、高压煮片修复。
[0039]
表1四个样本的处理设计
[0040] 酶ddttp第3次pcr循环数总循环数1无有35452有有35453有无8184有有818
[0041]
2、滴加4％多聚甲醛覆盖标本区，固定30分钟，双蒸水洗去多聚甲醛；用20μg/ml的蛋白酶k将固定好的组织切片55℃消化处理2h后，双蒸水洗去蛋白酶k，风干。
[0042]
3、滴加无taq酶的pcr反应液覆盖标本区，常温预处理30分钟。
[0043]
4、滴加pcr反应液，盖上玻片，用指甲油封片，按照下表2的反应体系1和表3所示的程序1进行原位pcr反应，此步为预扩增，其中，采用的上游引物1：catcctcccctgcatgtgtt(seq id no.1),下游引物1：cttggaggaccgtcgctt(seq id no.2)。四张玻片中1号玻片无taq酶，改为5μl ddh2o，作为原位pcr的阴性对照。
[0044]
表2预扩增的反应体系1
[0045]
成分体积(μl)上游引物1(10pmol)2下游引物1(10pmol)210
×
pcr buffer5mg
2+
(25mm)3dntp(各10mm)1taq dna聚合酶(5u/μl)5ddh2o32总体系50
[0046]
其中，10
×
pcr buffer的组成为：100mm tris-hcl(ph8.8,25℃)，500mmkcl和0.8％(v/v)np-40。
[0047]
表3预扩增的反应程序1
[0048][0049]
5、取出玻片，无水乙醇软化指甲油，去除指甲油与盖玻片。双蒸水中浸洗10分钟。
[0050]
6、滴加无taq酶的pcr反应液覆盖标本区，常温预处理30分钟。
[0051]
7、采用如下反应体系2和反应程序2(95℃3分钟，50℃5分钟)进行扩增；其中，下游引物2：taatacgactcactataggggcatgtcaagatcacagattttgggc(seq id no.3，横线的序列为t7通用引物)。如图1，下游引物2延伸的下一个碱基是待测位点，阴性为碱基t，阳性为g；若为阴性模板，则pfu dna聚合酶会延伸ddttp，并使得引物3’变成双脱氧末端，不可被taq酶继续延伸；若为阳性模板，则pfu dna聚合酶不能延伸，保留引物3’末端羟基，可被taq酶继续延伸。
[0052]
为防止pfudna聚合酶3'降解功能，加入dctp，当引物最后一个碱基被切割时，会再延伸一个dctp。
[0053]
表4反应体系2的组成
[0054]
成分体积(μl)下游引物2(10pmol)210
×
pcr buffer5mg
2+
(25mm)3dntp(各10mm)1dctp(各10mm)1pfu dna聚合酶(5u/μl)5
ddh2o33总体系50
[0055]
8、重复上述步骤5、6，然后更换反应体系3(反应体系3除引物外与反应体系1相同，上游引物3：aaggcagcctggtccctggt(seq id no.4)，下游引物3：taatacgactcactataggg(seq id no.5))。反应程序3如下表4，55℃延伸30分钟，阳性模板被延伸，并在新的模板中引入t7引物；阴性模板无法被延伸。反应程序3的原位pcr只以55℃延伸的新模板作为初始模板，阴性链不会扩增。
[0056]
表5反应程序3
[0057][0058][0059]
其中，针对每个样本的n值参考表1。
[0060]
9、用手术刀片刮下玻片上的组织，提取dna，pcr扩增后进行测序。引物为反应体系3的引物。
[0061]
结果
[0062]
(1)样本1、2扩增完成后，用双蒸水浸洗15分钟，风干后加dapi 10μl封片，显微镜下观察结果。如图2-3所示，样本1：细胞核颜色均匀，表明无pcr产物积累；细胞核上亮点为l858r阳性突变产物pcr积累。
[0063]
(2)如图4-5，样本3：测序显示样本无突变，样本4：测出t
→
g突变，且为强阳性。
[0064]
测序引物为下游引物，测序结果是模板的互补链，因而阴性为a。本实验阳性结果为c，故为t
→
g突变，且阳性峰高于阴性峰，表明本次实验效果良好，达到预期目标。
[0065]
图5测序中有阴性峰，可能是因为pfudna聚合酶有3
’→5’
切割功能，将延伸的ddttp切割，产生3’羟基末端，经第三次原位pcr后，将阴性模板扩增；同时3
’→5’
切割速率低于5
’→3’
延伸速率，故测序结果为强阳性而不是全阳性。
[0066]
验证实施例
[0067]
本实施例验证本发明所提供的方法的灵敏性，取去除红细胞的淋巴细胞，用pbs配制成107/ml的细胞悬浮液，加入100个h1975细胞。h1975细胞系为l858r突变，此细胞悬浮液l858r突变率为10-5
。
[0068]
制作两张细胞涂片标记a、b，按上述实施例1的步骤进行实验。a为对照组，b为检测组。
[0069]
结果如图6-7，对照组a：未检测出突变，检测组b：检测出弱阳性突变，说明本发明所提供的方法对10-5
单碱基突变能有效检出。
[0070]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代
也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

技术特征：
1.一种基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的引物，其特征在于，包括序列为seq id no.1～seq id no.5的引物。2.一种基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物。3.一种采用如权利要求1所述的引物或如权利要求2所述的试剂盒的基于原位pcr检测egfr基因l858r位点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，将样本的组织切片进行固定、消化、封片后采用序列分别为seq idno.1和seq id no.2的上、下游引物进行预扩增；步骤二，去除封片剂，滴加无taq酶的pcr反应液覆盖标本区，常温预处理；步骤三，采用序列为seq id no.3的下游引物进行扩增；步骤四，重复步骤二，用手术刀片刮下玻片上的组织，提取dna，采用序列分别为seq id no.4和seq id no.5的上、下游引物对进行pcr扩增后进行测序。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤一中采用蛋白酶k对组织切片进行固定；所述蛋白酶k的浓度为15-30μg/ml，优选为20μg/ml。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤一中消化的条件为50-60℃，消化时间为1.5-2小时。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤一中，封片前滴加无taq酶的pcr反应液覆盖标本区，常温预处理30分钟。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤一和步骤四中的扩增体系如下：步骤一和步骤四中的扩增体系如下：8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤一中预扩增的扩增程序为：95℃2分钟；95℃2分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，10个循环。9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤三中的扩增体系如下：
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤三中的扩增程序为：95℃3分钟，50℃5分钟。11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤四中的扩增程序为95℃2分钟；95℃2分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，35或8个循环。

技术总结
本发明提供了一种基于原位PCR检测EGFR基因L858R位点突变的引物、试剂盒和方法。该引物包括序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5的引物。该方法使用原位PCR技术，将引物在阴性模板延伸一个ddNTP，转变成3'双脱氧引物；突变模板引物不延伸，保留3'羟基，同时在引物的5'端引入外源序列；更换为正常的PCR反应液后，与突变模板结合的引物得以延伸，而与阴性模板结合的引物终止延伸，从而将阳性突变筛选出来。本发明提供的方法采用原位PCR技术检测EGFR基因L858R位点突变，具有灵敏度高，可检测出10-5


技术研发人员：郭亮 崔陈周 王鹏非 周海霞
受保护的技术使用者：科医联创（浙江）生物科技集团有限公司
技术研发日：2022.12.30
技术公布日：2023/7/11