一种复合型缓释微纳米颗粒及其合成方法、应用

1.本技术属于微纳米颗粒技术领域。更具体地，本技术涉及一种含有指示剂成份的复合型微纳米颗粒材料。


背景技术：

2.多元复合材料也称为多组分聚合物材料，是指由两种或两种以上不同物质组合而成的材料，它可以发挥各种材料的优点，克服单一材料的缺陷，扩大材料的应用范围，在近几年更是得到了飞速发展。然而多组分聚合物材料中的难降解组分，例如不可降解塑料、淀粉、纤维素、脂质、蛋白等，它们在污染土地、水体的同时，也对包括人类在内的生物的健康造成了严重威胁。因此多组分聚合物材料的降解是目前亟待解决的重大难题。
3.目前多组分聚合物材料降解的主要方式有化学破壁法(酸解、碱解)、物理破壁法(液体剪切、固体剪切等)、生物破壁法(酶解、自溶)。然而，物理或化学法不环保、降解不彻底、能耗高；生物法价格昂贵且效率低。因此，迫切需要开发一种高效率、低成本的筛选方法，为降解多组分聚合物材料提供更高效、专一的策略。
4.由于多组分聚合物材料不同组分的结构不同，开发通用的模拟底物也比较困难。随着微纳米技术的飞速发展，具有优异特性的功能性微纳米材料不断涌现，与传统的筛选底物相比，微纳米材料具有稳定性高、通用性高、形状和尺寸易于控制等优点，目前已被广泛应用于生物、化学和医学领域。
5.单一组分聚合物无法模拟多组分聚合物材料降解的过程和特性；单一组分聚合物纳米颗粒的比表面积大，降解速度快，在部分实验条件下，难以对高效酶及其突变体的降解速率进行可靠的指示(混合时很快发生降解而难以获得降解常数)，无法区分降解性能较高的突变体，复合材料对多种酶或一种酶进行筛选，且筛选的特异性、可控性高于单一组分。


技术实现要素：

6.基于以上，本技术开发了一种新型的多元复合型缓释微纳米颗粒指示剂，微纳米颗粒包括指示剂成份和多种复合材料基质成份。当多组分聚合物材料基质降解或分解后，指示剂成份达到指示效果，根据指示效果，我们可以筛选出更高效的多组分聚合物材料降解或分解方式。
7.具体的，本技术采用如下技术方案，
8.1、一种复合型缓释微纳米颗粒，其包含多组分聚合物材料基质和一种或多种包埋降解指示剂，其中，所述多组分聚合物材料基质至少包括组分1和组分2，一种或多种指示剂包埋在多组分聚合物材料基质中，
9.多组分聚合物材料基质能够被生物活性物质降解，其中组分1和组分2被不同的生物活性物质降解。
10.2、根据项1所述的复合型缓释微纳米颗粒，其中，所述多组分聚合物材料基质的总质量百分比为50～99.99％，优选为80～99.9％，所述包埋降解指示剂的质量浓度为0.01～
50％，优选为0.1～20％。
11.3、根据项1所述的复合型缓释微纳米颗粒，所述组分1和组分2使所述多组分聚合物材料基质被降解时，在相同降解条件下，降解速率低于只含有组分1或组分2的聚合物材料的降解速度，优选的，所述多组分聚合物材料基质选自生物基复合材料和/或人工复合材料。
12.4、根据项3所述的复合型缓释微纳米颗粒，所述生物基复合材料为真菌细胞壁、细菌细胞壁、细菌生物被膜胞外物质提取物、植物提取物、木质素和纤维素复合物、纤维素与半纤维素复合物、淀粉与油脂复合物、壳聚糖及衍生物基复合物等天然聚合物材料；或者
13.所述人工复合材料为塑料、树脂、橡胶、金属有机框架材料。
14.5、根据项1所述的复合型缓释微纳米颗粒，所述指示剂是荧光指示剂或生色指示剂，优选的，所述荧光指示剂是酶底物的荧光指示剂缀合物；或者，所述生色指示剂是酶底物的生色指示剂缀合物。
15.6、根据项1所述的复合型缓释微纳米颗粒，所述微纳米颗粒被降解或破坏时，从其中释放所述指示剂，然后触发或增强指示效果。
16.7、根据项1所述的复合型缓释微纳米颗粒，所述多组分聚合物材料基质可以被一种或多种活性酶降解或水解，导致纳米颗粒瓦解和指示剂缓慢释放，触发或增强指示效果。
17.8、一种微反应器，其包含根据项1-7中任一项所述的复合型缓释微纳米颗粒和至少一种生物活性物质，优选地，所述微反应器呈水相形式，优选，所述微反应器呈可以分散在油相中的水滴形式或呈可以分散在水相中的油包水液滴形式。
18.9、根据项8所述的微反应器，其平均直径为约5至200微米、优选10至100微米、更优选10至50微米、更优选10至30微米，更优选15至25微米。
19.10、根据项8所述的微反应器，其中所述生物活性物质是能够降解所述组分1或组分2的降解酶或降解微生物，优选地，所述降解微生物能够表达所述降解酶或能够表达所述降解酶的增强子，任选地，所述降解微生物是天然细胞或重组细胞，优选包含目的酶的多核苷酸。
20.11、根据项8所述的微反应器，其中所述降解酶是溶壁酶、水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，优选地是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脂肪分解酶、过氧化物酶、环化酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、pet降解酶、pe降解酶、pp降解酶、pbs降解酶、pla降解酶或辣根过氧化物酶中的一种或两种以上。
21.12、一种试剂盒，其包含根据项1-7中任一项所述的微纳米颗粒或根据项8-11中任一项所述的微反应器。
22.13、一种用于筛选能够降解或辅助降解不溶于水的多组分聚合物材料的菌群或文库中生物活性物质的方法，该方法包括以下步骤：
23.a)提供根据项1-7中任一项所述的微纳米颗粒；
24.b)使待分析的生物活性物质与根据项1-7中任一项所述的微纳米颗粒接触以形成
混合物；
25.c)当由该指示剂产生的指示效果、优选荧光指示效果被触发或增强时，表明该生物活性物质可以降解或辅助降解构成这些微纳米颗粒的不溶于水的多组分聚合物材料基质。
26.14、根据项13所述的筛选方法，其中该指示效果的量达到或高于预定的阈值水平。
27.15、根据项13所述的筛选方法，其中所述生物活性物质是能够降解所述组分1或组分2的降解酶或降解微生物，优选地，所述降解微生物能够表达所述降解酶或能够表达所述降解酶的增强子，任选地，所述降解微生物是天然细胞或重组细胞，优选包含目的酶的多核苷酸。
28.16、根据项13所述的筛选方法，其中该文库是包含多种不同的酶或微生物的酶文库、微生物文库或菌群，其中由一种酶或微生物释放的指示效果的量达到或高于预定的阈值水平，从而鉴定出目标酶或目标微生物。
29.17、根据项13所述的筛选方法，其中该菌群或文库是包含多种衍生自亲本酶的酶变体的酶文库，其中与该亲本酶相比，该活性酶变体已释放出增加量的指示效果，从而鉴定出改进的酶变体。
30.18、根据项13所述的筛选方法，其中不溶于水的多组分聚合物材料降解酶是溶壁酶、水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，优选地是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脂肪分解酶、过氧化物酶、环化酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、pet降解酶、pe降解酶、pp降解酶、pbs降解酶、pla降解酶或辣根过氧化物酶中的一种或两种以上。
31.19、一种酶筛选或选择方法，该方法包括以下步骤：
32.a)提供一个菌群或酶文库，提供多个隔室，每个隔室包含液体等分试样和至少一种复合型缓释微纳米颗粒，所述复合型缓释微纳米颗粒包含多组分聚合物材料基质(优选地，50％-99.99％(w/w))和与荧光团或生色团标记物缀合的一种或多种聚合物材料(优选地，50％-0.01％(w/w))的混合物；
33.b)使每个隔室中的复合型缓释微纳米颗粒与该文库的酶接触，其中所述多组分聚合物材料基质被活性酶降解，从而释放出荧光团或生色团标记物；
34.c)鉴定一个或多个隔室，其中所述多组分聚合物材料基质已被该活性酶降解或释放，从而鉴定出该活性酶。
35.20、根据项19所述的酶筛选或选择方法，其中该酶文库包含多种衍生自亲本酶的酶变体，并且其中在步骤(c)中鉴定出隔室，其中与该亲本酶相比，该活性酶变体已释放出增加量的标记物，从而鉴定出改进的酶变体。
36.21、根据项19所述的酶筛选或选择方法，其中该固体组合物包含根据项1-7中任一项所述的微纳米颗粒或由其组成，优选地，其中所述隔室包含根据项8-11中任一项所述的微反应器或由其组成。
37.22、根据项19所述的酶筛选或选择方法，其中与荧光团或生色团标记物缀合的酶
底物是荧光指示剂或生色指示剂，例如，具有酶底物、优选荧光或生色酶底物的荧光或生色指示剂缀合物，其中特定酶的活性将该荧光或生色酶底物转化为指示化合物，例如荧光素。
38.23、一种使用基于微流体的系统筛选能够降解或辅助降解不溶于水的多组分聚合物材料基质的的菌群或文库中生物活性物质的方法，该方法包括：
39.a)液滴生成过程，其中生成含有生物活性物质的液滴；
40.b)微纳米颗粒引入过程，其中将含有根据项1至5中任一项所述的微纳米颗粒的二次液滴与由单元a)生成的液滴聚结；
41.c)液滴分选过程，其中基于由该指示剂生成的指示效果分选目标液滴；以及
42.d)分析和检测过程，其中进一步分析分选的目标液滴以筛选目标生物活性物质。
43.24、一种使用基于微流体的系统筛选能够降解或辅助降解不溶于水的多组分聚合物材料基质的菌群或文库中生物活性物质的方法，该方法包括：
44.a)液滴生成过程，其中生成水性液滴；
45.b)微纳米颗粒引入过程，其中将含有根据项1至7中任一项所述的复合型缓释微纳米颗粒液滴与由单元a)生成的液滴聚结；
46.c)生物活性物质引入过程，其中将含有文库的生物活性物质的液滴与由单元a)生成的液滴聚结；
47.d)液滴分选过程，其中基于由该指示剂生成的指示效果分选目标液滴；以及
48.e)分析和检测过程，其中进一步分析分选的目标液滴以筛选目标生物活性物质，
49.其中过程b)可以与过程c)同时、在此之前或在此之后进行，或者过程a)、过程b)和过程c)可以同时进行。
50.25、根据项23或项24所述的筛选方法，其中当该液滴的指示效果达到或高于预设的阈值水平时，液滴分选系统触发对该目标液滴的选择，优选地，该液滴分选系统触发该目标液滴向选择路径的偏转。
51.26、根据项23或项24所述的筛选方法，其中液滴分选是基于荧光激活的液滴分选技术。
52.27、根据项23或项24所述的筛选方法，其中所述生物活性物质是能够降解所述组分1或组分2的降解酶或降解微生物，优选地，多组分聚合物材料所述降解微生物能够表达降解酶或能够表达降解酶的增强子，任选地，所述降解微生物是天然细胞或重组细胞，优选包含目的酶的多核苷酸。
53.28、根据项23或项24所述的筛选方法，其中多组分聚合物材料所述降解酶是溶壁酶、水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，优选地是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脂肪分解酶、过氧化物酶、环化酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、pet降解酶、pe降解酶、pp降解酶、pbs降解酶、pla降解酶或辣根过氧化物酶中的一种或两种以上。
54.29、根据项23或项24所述的筛选方法，该筛选方法进一步包括液滴孵育过程，其中孵育含有生物活性物质的液滴。
55.30、根据项23或项24所述的筛选方法，其中微纳米颗粒引入单位或生物活性物质引入单元是皮注射微流控功能单元，其中可以向该液滴中引入一皮升体积的包含微纳米颗粒的水性液体溶液或包含生物活性物质的水性液体溶液。
56.31、根据项23或项24所述的筛选方法，其中分选前的各液滴包含一个单细胞或由单细胞增殖的多个细胞。
57.32、根据项23或项24所述的筛选方法，其中该菌群或是包含多种不同的微生物的菌群或文库，其中由微生物释放的指示效果的量达到或高于预定的阈值水平，从而鉴定出目标酶或目标微生物。
58.33、根据项23或项24所述的筛选方法，其中该生物活性物质文库例如酶文库包含多种衍生自亲本酶的酶变体，其中与该亲本酶相比，该活性酶变体已释放出增加量的指示效果，从而鉴定出改进的酶变体。
59.发明效果
60.本技术旨在开发一种新型的多元复合型缓释微纳米颗粒指示剂，包含多组分聚合物材料基质和指示剂，多组分聚合物材料基质至少包括组分1和组分2，当多组分聚合物材料中的组分1被相关生物活性物质降解或分解时，组分2可以作为组分1和降解指示剂的缓释控制剂，组分1也可以作为组分2和降解指示剂的缓释控制剂，从而达到更好的降解效率指示效果。该多组分聚合物纳米颗粒也可以对多种生物活性物质的联合降解进行测试。基于微纳米颗粒指示剂，本技术建立多组分聚合物材料降解或分解的高效筛选体系，为多组分聚合物材料的降解提供更高效、专一的策略。
61.复合型材料在自然界及人工聚合物中广泛存在，在建筑，纺织，食品，生物医药等行业广泛应用。例如微生物生物被膜中含有细菌分泌的胞外多糖、胞外蛋白、核酸等物质，从而导致其难以去除和具有较高的耐药性。植物的木质素和纤维素形成复合体，导致利用木材等制备生物能源时，需要同时降解木质素和纤维素以提高转化率，大大增加了转化的难度。作为复合型材料，形成的例如复合型塑料材料由于具备了不同塑料材料的特性和优点，具有更好的环境耐受性和性能，从而被广泛应用。然而，复合型材料由于组分复杂，为其降解和循环利用带来了困难，也导致较为严重的环境污染问题。
62.本技术的复合型缓释微纳米颗粒，包含多组分聚合物材料基质和一种或多种包埋降解指示剂，其中，多组分聚合物材料基质包含有多种组分，不同的组分被不同的生物活性物质降解，选择的特定的生物活性物质对纳米颗粒的降解可以受到纳米颗粒中其他不能被该生物活性物质降解的聚合物组分的调控，当仅使用针对一种组分的生物活性物质降解纳米颗粒时，在相同降解条件下，降解速率低于仅含有一种组分的纳米颗粒，从而达到缓释降解效果。这样，可以更好的区分不同的生物活性物质的降解效率，比较不同生物活性物质的活性，例如不同酶的活性，以及不同生物活性物质的不同比例组合的降解活性。为复合型多组分天然聚合物和人造聚合物的降解和循环利用提供检测筛选的有效手段。
63.同时，还可以通过调整针对不同组分的生物活性物质的量和浓度，对复合型缓释微纳米颗粒的降解效率起到控制作用，如加快降解速率或者减慢降解速率，以满足在考察不同生物活性物质活性时的需要。
附图说明
64.附图用于更好地理解本技术，不构成对本技术的不当限定。其中：
65.图1本技术复合材料微纳米颗粒示意图，
66.图2本技术实施例中高压破碎酵母细胞后的扫描电镜图，
67.图3本技术实施例中荧光素与酵母细胞壁的比例为1:100，生成酵母细胞壁微纳米颗粒在酶标仪的荧光指示效果，
68.图4本技术实施例中荧光素与酵母细胞壁的比例为1:50，生成酵母细胞壁微纳米颗粒在酶标仪的荧光指示效果，
69.图5本技术实施例中荧光素与酵母细胞壁的比例为1:10，生成酵母细胞壁微纳米颗粒在酶标仪的荧光指示效果，
70.图6本技术实施例中利用动态光散射仪检测酵母细胞壁微纳米颗粒悬浮液粒径，
71.图7本技术实施例中酵母细胞壁微纳米颗粒悬浮液的扫描电镜图，
72.图8本技术实施例中利用动态光散射仪检测冷冻干燥后的微纳米颗粒粒径，
73.图9本技术实施例中冷冻干燥后酵母细胞壁的扫描电镜图，
74.图10本技术实施例中利用溶壁酶在酶标仪检测酵母细胞壁微纳米颗粒的荧光指示效果，
75.图11本技术实施例中利用溶壁酶在酶标仪检测冷冻干燥后酵母细胞壁微纳米颗粒的荧光指示效果，
76.图12本技术实施例中利用溶壁酶在fads平台检测酵母细胞壁微纳米颗粒的荧光指示效果，
77.图13本技术实施例6中不同的纤维素酶对复合型微纳米颗粒降解时酶标仪检测的荧光指示效果，
78.图14本技术对比例1中不同的纤维素酶对单一型微纳米颗粒降解时酶标仪检测的荧光指示效果，
79.图15本技术实施例7中不同浓度的淀粉酶和纤维素酶混合后对复合型微纳米颗粒降解时酶标仪检测的荧光指示效果。
具体实施方式
80.以下对本技术的示范性实施例做出说明，其中包括本技术实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本技术的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
81.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本技术的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本技术的范围。本技术的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
82.本技术提供一种复合型缓释微纳米颗粒，其包含多组分聚合物材料基质和一种或多种包埋降解指示剂，其中，所述多组分聚合物材料基质至少包括组分1和组分2，多组分聚合物材料基质能够被生物活性物质降解，其中组分1和组分2被不同的生物活性物质降解，多组分聚合物材料降解或分解时，该微纳米颗粒可产生指示作用，因此可用于筛选多组分聚合物材料降解或分解方式。
83.所述多组分聚合物材料基质中的组分1和组分2是指具有不同性质的两种组分，例如，组分1是能够被一种方式分解的材料，则组分2是能够被不同于组分1的分解方式分解的材料；组分1可以包含多种组分，所述组分1中的多种组分与组分2不相同，所述多种组分被分解的方式可以相同也可以不同。组分2也可以包含多种组分，所述组分2中的多种组分与组分1不相同，所述多种组分被分解的方式可以相同也可以不同。但是，所述组分1中的多种组分和所述组分2中的多种组分被分解的方式不相同。
84.上述降解方式或分解方式在本技术中指通过所述活性物质降解。
85.本技术的复合型缓释微纳米颗粒，其中的多组分聚合物材料基质的组分1和组分2使所述多组分聚合物材料基质被降解时，在相同降解条件下，降解速率低于只含有组分1或组分2的聚合物材料的降解速度。例如，当使用能够降解组分1的生物活性物质对只含有组分1的单一组分纳米颗粒进行降解时，其降解速率会比较快，而使用同样的活性物质在同样的条件下对同时含有组分1和组分2的复合型缓释微纳米颗粒进行降解时，因为组分2的存在使得组分1不能够大面积的与活性物质接触，在一定程度上阻碍了组分1被降解，降解速度得以降低。同样，当使用能够降解组分2的生物活性物质对复合型缓释微纳米颗粒和只含有组分2的单一组分纳米颗粒进行降解时，复合型缓释微纳米颗粒的降解速度也更低，从而达到缓释效果。
86.当同时使用能够降解组分1和组分2的生物活性物质对复合型缓释微纳米颗粒进行降解时，可以对能够降解其中一种组分的活性物质的浓度或者使用量进行调整，从而控制另一种组分被降解的速率，对复合型缓释微纳米颗粒的降解速度起到调控的效果。例如，增加能够降解其中一种组分的活性物质的浓度或者使用量可以增加另一种组分被降解的速率，对复合型缓释微纳米颗粒的降解速度起到加快的效果。降低能够降解其中一种组分的活性物质的浓度或者使用量可以降低另一种组分被降解的速率，对复合型缓释微纳米颗粒的降解速度起到降低的效果。
87.如图1所示，a和b分别代表复合生物材料的其中一种成分，即a为组分1，b为组分2，c为含有a和b的复合材料，d为复合材料降解或分解前的指示剂成分，d’指复合材料降解或分解后，指示剂成分产生指示效果。当含有复合材料c和指示剂成分d的微纳米颗粒e降解或分解后，就会产生f，即指示剂成分产生指示效果，根据指示效果我们可以筛选出更高效的复合材料降解或分解方式。
88.本技术的“降解”、“裂解”、“分解”、“瓦解”均指上述通过所述活性物质降解的过程，在本技术中，上述术语可以互换使用。
89.所述生物基复合材料为真菌细胞壁、细菌细胞壁、细菌生物被膜胞外物质提取物、植物提取物、木质素和纤维素复合物、纤维素与半纤维素复合物、淀粉与油脂复合物、壳聚糖及衍生物基复合物等天然聚合物材料。
90.所述人工复合材料为塑料、树脂、橡胶、金属有机框架材料。
91.所述指示剂是荧光指示剂或生色指示剂，优选的，所述荧光指示剂是酶底物的荧光指示剂缀合物；或者，所述生色指示剂是酶底物的生色指示剂缀合物。例如所述指示剂是苯甲酰酯、荧光素二苯甲酸酯、尼罗红、尼罗蓝a、4-甲基伞形酮基2-磺氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷、4-甲基伞形酮基丁酸酯、4-甲基伞形酮基油酸酯、4-甲基伞形酮基硫酸酯、d-萤光素、试卤灵、n-丁基荧光素、丹酰尸胺、戊二酰-l-苯丙氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素、o-甲基-o-(n-丁基荧光素)磷酸酯、3-乙酰基伞形酮基β-d-吡喃葡萄糖苷、4-甲基伞形酮基α-l-艾杜糖苷、荧光素二辛酸酯ws1、hoechst34580和二氢四甲基罗丹明。
92.所述组分1和组分2使所述多组分聚合物材料基质被降解时，在相同降解条件下，降解速率低于单一组分聚合物材料基质的降解速度，使聚合物材料的降解达到缓释效果。
93.在本技术中，术语“多组分聚合物材料”具有本领域所用的普通含义，即包含多种组分的聚合物或复合物，也可以称之为多元聚合材料、多元复合材料。在本技术中“多组分聚合物材料”“多组分聚合物”“聚合物材料”“多元聚合材料”“多元复合材料”“复合材料”“聚合物”“复合物”可以互换使用。
94.在本技术实施例1中，我们利用酵母细胞壁复合材料，并对提取后的酵母细胞壁进行成分分析，如表1所示，多组分聚合物材料的主要组分包含蛋白质和多糖。
95.本技术实施例中微纳米颗粒指示剂成分的制备涉及一种标记方法，包括一种或多种物质的标记物，这种标记可以为荧光标记、颜色标记、生物素标记等。在本技术实施例二中，我们将多组分聚合物材料直接进行荧光标记，标记结果包括，荧光标记蛋白质、荧光标记多糖或荧光同时标记蛋白质和多糖。如图3-5所示，荧光物质与多组分聚合物材料的比例在1％-10％都可以具有良好的荧光标记效果。
96.本技术实施例中指示剂成分用于产生信号变化。该信号可以是物理性质变化产生的相应信号变化，例如颜色、状态、气味、熔点、沸点、硬度、磁性、导电性、导热性等。可以是化学性质变化产生的相应信号变化，例如酸碱性、氧化还原性等。还可以是不同信号间的变化；同种信号聚集状态变化；同种信号强弱变化，同种信号有无的变化等。
97.检测信号变化的方法包括电化学法、化学发光法、分光光度法、拉曼光谱法、荧光法、物理性质变化的相应检测方法、化学性质变化的相应检测方法等。例如我们可以使用荧光检测同种信号聚集状态的变化，当信号处于聚集状态时，产生高瘦形状的峰；当信号处于分散状态时，产生矮胖形状的峰。
98.本技术涉及一种微纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
99.a)将多组分聚合物材料以溶剂溶解；
100.b)将指示剂成份和多组分聚合物材料基质成份以一定比例混匀；
101.c)制备微纳米颗粒指示剂
102.在本技术实施例1-3中，酵母细胞壁微纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
103.a)提取、纯化多组分聚合物材料；
104.b)将多组分聚合物材料以溶剂溶解；
105.c)制备指示剂成分；
106.d)将指示剂成份和多组分聚合物材料基质成份以一定比例混匀；
107.e)制备微纳米颗粒指示剂。
108.在本技术实施例中，溶解多组分聚合物材料的溶剂包括酸性溶液，例如盐酸、硫
酸、冰醋酸、硝酸、氯化铵等；碱性溶液例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等；有机试剂，例如甲苯、二甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二恶烷、乙醚、丙酮、四氢呋喃等以及它们的混合溶剂；离子液体的阳离子为季铵盐离子、季鏻盐离子、咪唑盐离子和吡咯盐离子等，阴离子为卤素离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子等。
109.在本技术实施例中，生成微纳米颗粒的方式是多种多样的，包括水解法，例如酸水解。机械法，利用摩擦、挤压、剪切、冲击、超声、高速搅拌等机械手段将颗粒粒径降至微纳米级。再生法，例如有溶剂挥发法、纳米沉淀法、乳化-溶剂扩散法、盐析法、透析法、超临界流体技术(scf)、离子交联法和复凝聚法等。还包括纳米沉降法，反相纳米沉淀法等。
110.在本技术实施例中，微纳米颗粒可通过反相微纳米沉淀法形成。将标记的和未标记的酵母细胞壁溶解于离子液体，然后将溶液与多组分聚合物材料的反溶剂混合，例如水、甲醇、乙醇等。多组分聚合物材料在溶剂-反溶剂复合物中的溶解度比在原始溶剂中的溶解度低，因过饱和而发生沉淀。在复合过程中，可配合搅拌、超声等因素，从而产生大小可控的微纳米颗粒。
[0111]“微纳米颗粒”是指直径小于1000μm，例如20nm至500μmm，30nm至300μm，或50nm至150μm的任何颗粒。如图6-9所示，在本技术实施例中微纳米颗粒的粒径为100-200nm。
[0112]
本技术实施例中，微纳米颗粒包括水不溶性多组分聚合物材料和指示剂成份，其中水不溶性多组分聚合物材料的质量浓度为50～99.99％，优选为80～99.99％，其中指示剂成份的质量浓度为0.01～50％，优选为0.01～20％。只有在多组分聚合物材料基质降解或分解时，指示剂成份才可以产生可检测的信号变化。多组分聚合物材料基质的降解或分解包括其中几种组分，或全部组分的降解或分解。
[0113]
微纳米颗粒在优选条件下产生的指示效果与降解多组分聚合物材料的功能和速度呈线性或指数关系。如图10-11所示，随着多组分聚合物材料基质的降解，荧光逐渐增强。
[0114]
本技术实施例中提供一种筛选多组分聚合物材料降解的方法。包括以下步骤：
[0115]
a)提供本技术的微纳米颗粒或制备微纳米颗粒所需试剂；
[0116]
b)待测物与微纳米颗粒接触；
[0117]
c)指示剂成份产生指示效应，根据指示效果分析检测物质是否可以降解或辅助降解多组分聚合物材料基质。
[0118]
本技术实施例中涉及待测物质文库的构建。例如生物活性物质文库，包括细菌、真菌、放线菌或古细菌。文库来源包括：a)土壤、污水等环境样品的微生物样本。b)通过基因工程、蛋白质工程构建突变文库。化合物文库的构建，化合物包括有机化合物、无机化合物或其他复合物，通过水解、醇解、氨解、热解等方式引起多组分聚合物材料降解或分解。
[0119]
本技术实施例中提供一种多组分聚合物材料降解或辅助降解文库的筛选方法，包括以下步骤：
[0120]
a)提供本技术的微纳米颗粒或制备微纳米颗粒所需试剂；
[0121]
b)至少文库中的一种物质与微纳米颗粒接触；
[0122]
c)指示剂成份产生指示效应，根据指示效果分析检测物质是否可以降解或辅助降解多组分聚合物材料基质。
[0123]
本技术实施例中提供一种基于平板的多组分聚合物材料降解方式的筛选方法。利用微纳米颗粒比表面积大，形状尺寸易于控制等优势，可以将微纳米颗粒作为培养基成分，
根据微纳米颗粒指示效果筛选多组分聚合物材料的降解物。包括以下步骤：
[0124]
a)提供本技术的微纳米颗粒或制备微纳米颗粒所需试剂；
[0125]
b)配置含有微纳米颗粒的培养基；
[0126]
c)将待测物与培养基接触；
[0127]
d)根据培养基的指示效果检测物质是否可以降解或辅助降解多组分聚合物材料。
[0128]
本技术实施例中，信号可以被酶标仪检测到。酶标仪是一种实验室仪器，旨在检测一个或多个微孔板中样品的生物、化学或物理反应。样品反应可以在6-1536孔规格的微孔板中进行分析。微孔板测定的常见检测模式是吸光度、荧光强度、发光、时间分辨荧光和荧光偏振。
[0129]
本技术实施例4中提供一种基于微孔板的多组分聚合物材料降解方式的筛选方法。其特征在于微孔板选用6-1536孔规格中的一种，微孔板的材质选用聚苯乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯中的一种。其过程包括：
[0130]
a)提供待测物质和多个区室，每个区室包含微纳米颗粒和至少一种待测物质；
[0131]
b)每个区室中的微纳米颗粒与待测物质接触；
[0132]
c)多组分聚合物材料被降解或分解后，指示剂成分产生指示效果，根据指示效果分析待测物。
[0133]
本技术涉及一种微反应器，其包含如上所述的复合型缓释微纳米颗粒和至少一种生物活性物质，所述微反应器可以是水相形式，例如分散在油相中的液滴形式，可以是油相形式，例如分散在水相中的油水滴形式。
[0134]
微反应器直径约5至200微米，例如可以为6微米、10微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、20微米、21微米、23微米、25微米、30微米、35微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、150微米、170微米、180微米、190微米，优选为10至100微米，更优选为10至50微米，更优选10至30微米，更优选15至25微米。
[0135]
其中所述生物活性物质是能够降解所述复合型缓释微纳米颗粒中多组分聚合物材料基质，例如降解组分1或组分2的降解酶或降解微生物，优选地，所述降解微生物能够表达所述降解酶或能够表达所述降解酶的增强子，任选地，所述降解微生物是天然细胞或重组细胞，优选包含目的酶的多核苷酸。
[0136]
所述降解酶是溶壁酶、水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，优选地是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脂肪分解酶、过氧化物酶、环化酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、pet降解酶、pe降解酶、pp降解酶、pbs降解酶、pla降解酶或辣根过氧化物酶中的一种或两种以上。
[0137]
降解组分1或组分2的降解酶或降解微生物应该为不同的生物活性物质，例如，降解组分1的生物活性物质为水解酶，降解组分2的生物活性物质为氧化酶；例如，降解组分1的生物活性物质为水解酶，降解组分2的生物活性物质为氧化酶和角质酶；例如，降解组分1的生物活性物质为氧化酶和角质酶，降解组分2的生物活性物质为水解酶；例如，降解组分1
的生物活性物质为水解酶和pe降解酶，降解组分2的生物活性物质为氧化酶和角质酶；例如，降解组分1的生物活性物质为氧化酶和角质酶，降解组分2的生物活性物质为水解酶和pe降解酶。
[0138]
降解组分1的生物活性物质可以是一种、两种、三种、四种、五种或以上；
[0139]
降解组分2的生物活性物质可以是一种、两种、三种、四种、五种或以上。
[0140]
本技术实施例中提供一种基于微流体的多组分聚合物材料降解方式的筛选系统，包括：a)微滴生成单元；b)微纳米颗粒导入单元，将含有微纳米颗粒的液滴与单元a)产生的液滴混合，或者直接将微纳米颗粒与单元a)产生的液滴混合)；c)液滴分选单元，根据指示器产生的指示效果对目标液滴进行分选，以及d)分析和检测单元，进一步分析分选的目标液滴以筛选出能够降解或协助降解多组分聚合物材料基质的物质。
[0141]
液滴分选基于荧光激活液滴分选技术。设定分选阈值，液滴分选系统对目标液滴进行检测，当液滴的指示效果达到预设的阈值水平时，向选择路径偏转，用于进一步的液滴分析。
[0142]
本技术实施例5验证了基于荧光激活液滴分选平台筛选多组分聚合物材料降解方式的可行性。如图12所示，微纳米颗粒在与阳性酶和阴性对照分别接触时，产生≥1.5倍的荧光值差距，即多组分聚合物材料微纳米颗粒可以应用到超高通量的微流体筛选系统中。
[0143]
实施例
[0144]
实施例1：多组分聚合物材料的提取与分析
[0145]
此实施例选用酵母细胞壁复合材料，首先我们需要培养酵母细胞，酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,ypd)培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸出粉10g/l,115℃灭菌20min。从ypd平板上挑取毕赤酵母gs115单菌落到ypd培养基中，30℃、200r/min培养至od 600nm值为1.0-3.0，此为酵母菌悬液。将酵母菌液9500rpm离心30分钟收集菌体，去除上清液，并利用无菌水重悬酵母菌至浓度≤20％。
[0146]
高压法破碎酵母细胞。用无菌水稀释酵母细胞浓度至≤20％。酵母细胞壁在jn-mini低温高压细胞破碎仪中提取，功率设置为1500-2000w。收集沉淀并离心洗涤。沉淀用异丙醇、丙酮等进行清洗，最后用无菌水洗涤。将收集到的沉淀物进行干燥，干燥的方式可以为热风干燥(温度为50℃-160℃)、喷雾干燥、负压干燥、冷冻干燥。
[0147]
将高压法得到的酵母细胞壁粉末拍摄扫描电镜，如图2所示,高压破碎法可将酵母细胞彻底破碎成碎片。
[0148]
对高压破碎法提取到的酵母细胞壁进行成份分析。利用高效液相(hplc)检测多组分聚合物材料成份，hplc具体操作流程为，首先13000rpm离心30min，取上清液经0.22微米滤膜过滤后进行hplc分析。使用bio-rad aminex hpx-87h(7.8mm
×
300mm)色谱柱，5mm h2so4作为流动相，流速0.6ml/min，柱温45℃，使用示差折光检测器检测。
[0149]
结果如表1所示，本技术中提取到的酵母细胞壁主要成分为蛋白质和多糖。
[0150]
表1酵母细胞壁的主要成分
[0151]
样品多糖％(hplc-87h)蛋白质％本技术微纳米颗粒79.5016.70
[0152]
实施例2：指示剂成分制备
[0153]
首先，将酵母细胞壁粉末加入到离子液体中，加入二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰
胺等助溶剂，将复合物在80℃-150℃下搅拌溶解。
[0154]
待酵母细胞壁溶液冷却到室温后，将fitc溶解在dmso中，并加入到溶有酵母细胞壁的离子液体复合液中，在室温下避光搅拌8-20小时。将荧光素与酵母细胞壁的比例控制为1:100,1:50,1:10，并利用酶标仪检测微纳米颗粒的荧光指示效果。如图3所示，荧光素与酵母细胞壁的比例控制为1:100，如图4所示，荧光素与酵母细胞壁的比例控制为1:50，如图5所示，荧光素与酵母细胞壁的比例控制为1:10。在以上所有比例中，微纳米颗粒均具有良好的荧光指示效果。
[0155]
实施例3：多组分聚合物材料微纳米颗粒的合成
[0156]
将荧光标记酵母细胞壁以2％的质量比加入溶有酵母细胞壁的离子液体复合液中，充分搅拌均匀。
[0157]
将复合液装入玻璃注射器中，超声的同时逐滴加入到ddh2o中。注射通过注射泵以0.1-0.4ml/min的流速进行。超声波处理的具体参数为：选用直径为6毫米的探头，功率为200-400w，工作时间为开3-5秒，关3-5秒。
[0158]
反应物溶液用ddh2o彻底清洗3个循环，以去除过量的离子液体、二甲基亚砜等。清洗结束后，将微纳米颗粒重新悬浮在ddh2o中。形成的微纳米颗粒悬浮液可以直接使用。也可将微纳米颗粒放置在-80℃冰箱，然后放入冷冻干燥机中得到酵母细胞壁微纳米颗粒粉末。
[0159]
如图6所示，将0.2mg/ml酵母细胞壁微纳米颗粒悬浮液用动态光散射仪检测颗粒粒径，微纳米颗粒直径约为128.2nm，分散性指数为0.28。如图7所示，将0.2mg/ml酵母细胞壁微纳米颗粒悬浮液滴到硅片上，彻底风干后利用扫描电子显微镜观察，微纳米颗粒直径约为120nm，与我们利用动态光散射仪检测到的微纳米颗粒大小一致。如图8所示，将冷冻干燥后的微纳米颗粒粉末重新悬浮在ddh2o中，浓度为0.2mg/ml,用动态光散射仪检测颗粒粒径，微纳米颗粒直径约为460.8nm，分散性指数为0.03。将冷冻干燥后的微纳米颗粒粉末放置到硅片上，得到多组分酵母细胞壁纳米颗粒扫描电子显微镜照片如图9所示。
[0160]
实施例4：基于多组分聚合物材料微纳米颗粒的微孔板筛选方法
[0161]
本技术实施例中使用的溶壁酶是由诺维信公司提供的含有葡聚糖酶、蛋白酶及几丁质酶的混合酶，浓度为0.95mg/ml。将100μl 0.95mg/ml溶壁酶与100μl 5mg/ml荧光酵母细胞壁微纳米颗粒同时加入96孔微量滴定板中，酶标仪参数设置为：激发波长为495nm，发射波长为525nm，温度25℃，每五分钟检测一次。设置三组平行对照。阴性对照为100μl ddh2o与100μl5mg/ml荧光酵母细胞壁微纳米颗粒同时加入96孔微量滴定板，同样设置三组平行对照。在检测2小时后，结果如图10所示。加入溶壁酶的信号明显高于阴性对照组，这意味着制备的微纳米颗粒在溶壁酶的作用下，具有良好的荧光指示效果。
[0162]
同时，我们也将冷冻干燥后的微纳米颗粒重新悬浮于ddh2o中，重复上述步骤检测微纳米颗粒的荧光指示效果。如图11所示，加入溶壁酶的信号明显高于阴性对照组，这意味着微纳米颗粒经过冷冻干燥后，依旧具有良好的荧光指示效果。这也表示在微纳米颗粒储存时，可以采用冷冻干燥的方式，延长存储时间。
[0163]
上述实施例验证了本技术的荧光酵母细胞壁微纳米颗粒指示剂可应用到微孔板筛选系统。在进行多酶复合配方的优化时，我们可以先确定葡聚糖酶、蛋白酶和几丁质酶中的任意两种作为缓释调控活性物质，并对剩余的一种酶进行优化或者突变进化，以考察三
种酶的协同作用，并优化选择最佳的目标酶或其突变体。为了更好的筛选目标酶，我们可以调节缓释调控活性物质的浓度和比例，并筛选目标酶的降解效果。
[0164]
实施例5：基于多组分聚合物材料微纳米颗粒的微流控平台筛选方法
[0165]
微流体装置制造：用于液滴生成、注射和筛选的微流体装置是使用软光刻技术利用聚二甲基硅氧烷(pdms)制造的。芯片的通道高度在14-25μm之间，并在通道入口和出口打孔。用于注射和分选的芯片包含盐水电极。
[0166]
荧光激活液滴分选(fluorescence activated droplet sorting，fads)系统：本技术包含了利用介电力完成分选的荧光激活液滴分选平台。该平台包括用于检测液滴荧光的集成化光学模块，为盐水电极提供高压高频电场的高压模块，用于捕获图像和视频的高速相机，以及用于控制显微镜和fads系统的电源模块。检测模块包含一个高功率二极管激光器、用于检测荧光信号的光电倍增管(pmt)和一个2mhz模数转换电路。激光和检测器的波长可以灵活定制，以实现多个荧光探针的同时检测。检测模块的v型安装口可以与标准倒置显微镜的侧端口连接，在检测模块中将pdms芯片对齐光路并固定。使用labview软件中编写的程序控制fads。使用matlab编写的程序提取和分析每个液滴的荧光信号。在分选之前和之后，收集液滴并利用荧光显微镜观察。
[0167]
fads工作流程：
[0168]
(1)液滴生成：使用微流控装置生成含有微生物样本的液滴。体积约为25-35pl的液滴以每秒1000个的速率产生。该装置以100μl/h的总水流速和200μl/h的油速运行，其中液滴生成油为含表面活性剂的氟化油。
[0169]
(2)液滴培养：生成的液滴收集在20-30厘米长的聚四氟乙烯管(内径0.010英寸，外径0.028英寸)中孵育，管道的两个末端用蜡密封。
[0170]
(3)微纳米颗粒注入：将微纳米颗粒注入培养的液滴中，通过引入荧光底物以测量酶活。将0到200v之间的电压以30khz的频率施加到电极上，以每秒300个液滴的流速触发注射。液滴被收集在聚四氟乙烯管(20-30厘米长)中，然后孵育。
[0171]
(4)液滴分选：将带有液滴的聚四氟乙烯管连接到分选装置上，通道深度为25μm。分选过程以10μl/h液滴和100μl/h氟化油的流速操作。使用安装在倒置显微镜侧端口上的检测模块收集每个液滴的荧光信号。设定荧光阈值，优选的液滴通过介电力偏转到选择通道。然后收集液滴并利用荧光显微镜观察。
[0172]
在本技术实施例中，将50μl 10mg/ml的酵母细胞壁微纳米颗粒与50μl 0.95mg/ml的溶壁酶在离心管中混合均匀并放置在25℃的金属加热台上，放置1-5小时。同时，将50μl 10mg/ml的酵母细胞壁微纳米颗粒与50ul ddh2o在离心管中混合均匀并放置在25℃的金属加热台上，放置1-5小时。按照上述操作方式分别生成两种液滴，并检测两种液滴的荧光值，收集检测信号。
[0173]
如图12所示，阴性液滴的荧光值主要集中在5000a.u.，阳性液滴的荧光值主要集中在13000a.u.，两者具有良好的区分度。这初步验证了本实施例中的荧光酵母细胞壁微纳米颗粒指示剂应用到微流体筛选系统的可行性。
[0174]
实施例6：纤维素-淀粉复合纳米颗粒(多组分聚合物材料基质)测试纤维素降解酶酶活
[0175]
采用溶剂析出法，制备纤维素-淀粉复合纳米颗粒。其中纤维素含量为45％，淀粉
的含量为50％，fitc荧光标记纤维素的含量为5％，将以上所有内容物加入溶有淀粉的离子液体复合液中，充分搅拌均匀。将复合液装入玻璃注射器中，超声的同时逐滴加入到ddh2o中。注射通过注射泵以0.1-0.3ml/min的流速进行。超声波处理的具体参数为：选用直径为6毫米的探头，功率为300-400w，工作时间为开4-5秒，关4-5秒。反应物溶液用ddh2o彻底清洗3个循环，以去除过量的离子液体、二甲基亚砜等。清洗结束后，将微纳米颗粒重新悬浮在ddh2o中。形成的微纳米颗粒悬浮液可以直接使用。也可将微纳米颗粒放置在-80℃冰箱，然后放入冷冻干燥机中得到纤维素-淀粉复合纳米颗粒粉末。
[0176]
首先使用去离子水稀释纤维素酶01(由诺维信公司提供，编号4500l)、纤维素酶02(由诺维信公司提供，编号4500t)及纤维素酶03(由诺维信公司提供，编号5000p)，浓度均为0.5μg/ml。然后，将50μl三种纤维素酶和50μl上述制备的纤维素-淀粉纳米颗粒(5mg/ml)分别加入96孔微量滴定板(flat bottom,black,corning,usa)中。然后，在设定的温度(37℃)下，将孔板放入多模板读取器(ex＝488nm，em＝523nm)(enspire，perkinelmer，usa)中200min。测量每个孔以检测荧光强度，对三种纤维素酶的酶活进行检测，得到三种纤维素酶的降解曲线如图13所示。纤维素酶3的降解性能最佳，其次为纤维素酶1，再次为纤维素酶2。利用上述纳米颗粒，可以对纤维素酶的酶活，酶反应动力学常数等进行研究。
[0177]
对比例1：纤维素纳米颗粒(单一组分聚合物材料基质)测试纤维素降解酶酶活
[0178]
采用溶剂析出法，制备纤维素纳米颗粒。制备方法同实施例6，其中纤维素纳米颗粒的纤维素含量为95％，fitc荧光标记纤维素的含量为5％。
[0179]
降解实验中首先使用去离子水稀释纤维素酶01(浓度：0.5μg/ml，由诺维信公司提供，编号4500l)、纤维素酶02(浓度：0.5μg/ml，由诺维信公司提供，编号4500t)及纤维素酶3(浓度：0.5μg/ml，由诺维信公司提供，编号5000p)。然后，将50μl三种纤维素酶和50μl纤维素纳米颗粒(5mg/ml)分别加入96孔微量滴定板(flat bottom,black,corning,usa)中。然后，在设定的温度(37℃)下，将孔板放入多模板读取器(ex＝488nm，em＝523nm)(enspire，perkinelmer，usa)中200min。测量每个孔以检测荧光强度。对三种纤维素酶的酶活进行检测，可以看到三种纤维素酶的降解曲线如图14所示。在t＝0时，三种酶的降解效率无法区分，由于混合时，降解就已经达到接近平台期，无法考察三种酶的酶活。
[0180]
实施例7：纤维素-淀粉复合纳米颗粒(多组分聚合物材料基质)测试纤维素酶和淀粉酶联合降解酶酶活
[0181]
采用溶剂析出法，制备纤维素-淀粉复合纳米颗粒。其中纤维素含量为45％，淀粉的含量为50％，fitc荧光标记纤维素的含量为5％，制备方法同实施例6。
[0182]
对纤维素酶02(由诺维信公司提供，编号4500t)的酶活进行检测，加入α-淀粉酶(a1031，sigma-aldrich)浓度分别为0.0mg/ml，0.10mg/ml和0.20mg/ml。将浓度为0.5μg/ml的50μl纤维素酶02和50μl纤维素纳米颗粒(5mg/ml)分别加入96孔微量滴定板(flat bottom,black,corning,usa)中。然后，在设定的温度(37℃)下，将孔板放入多模板读取器(ex＝488nm，em＝523nm)(enspire，perkinelmer，usa)中200min。测量每个孔以检测荧光强度。降解曲线结果如图15所示。加入淀粉酶使纤维素-淀粉复合纳米颗粒中的淀粉被降解，从而使纤维素酶能与纳米颗粒中的纤维素更好的接触并发生酶促降解反应。增加淀粉酶的浓度，可以加速纤维素降解速度。通过淀粉酶的加入，有助于加速纤维素酶与纤维素底物的接触和指示剂的释放，从而缩短了检测时间，有利于提高酶文库筛选通量，提升筛选效率。
[0183]
尽管以上结合对本技术的实施方案进行了描述，但本技术并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本技术权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本技术保护之列。

技术特征：
1.一种复合型缓释微纳米颗粒，其包含多组分聚合物材料基质和一种或多种包埋降解指示剂，其中，所述多组分聚合物材料基质至少包括组分1和组分2，一种或多种指示剂包埋在多组分聚合物材料基质中，多组分聚合物材料基质能够被生物活性物质降解，其中组分1和组分2被不同的生物活性物质降解。2.根据权利要求1所述的复合型缓释微纳米颗粒，其特征在于，其中，所述多组分聚合物材料基质的总质量百分比为50～99.99％，优选为80～99.9％，所述包埋降解指示剂的质量浓度为0.01～50％，优选为0.1～20％。3.根据权利要求1所述的复合型缓释微纳米颗粒，其特征在于，所述组分1和组分2使所述多组分聚合物材料基质被降解时，在相同降解条件下，降解速率低于只含有组分1或组分2的聚合物材料的降解速度，优选的，所述多组分聚合物材料基质选自生物基复合材料和/或人工复合材料。4.根据权利要求3所述的复合型缓释微纳米颗粒，其特征在于，所述生物基复合材料为真菌细胞壁、细菌细胞壁、细菌生物被膜胞外物质提取物、植物提取物、木质素和纤维素复合物、纤维素与半纤维素复合物、淀粉与油脂复合物、壳聚糖及衍生物基复合物等天然聚合物材料；或者所述人工复合材料为塑料、树脂、橡胶、金属有机框架材料。5.根据权利要求1所述的复合型缓释微纳米颗粒，其特征在于，所述指示剂是荧光指示剂或生色指示剂，优选的，所述荧光指示剂是酶底物的荧光指示剂缀合物；或者，所述生色指示剂是酶底物的生色指示剂缀合物。6.根据权利要求1所述的复合型缓释微纳米颗粒，其特征在于，所述微纳米颗粒被降解或破坏时，从其中释放所述指示剂，然后触发或增强指示效果。7.根据权利要求1所述的复合型缓释微纳米颗粒，其特征在于，所述多组分聚合物材料基质可以被一种或多种活性酶降解或水解，导致纳米颗粒瓦解和指示剂缓慢释放，触发或增强指示效果。8.一种微反应器，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的复合型缓释微纳米颗粒和至少一种生物活性物质，优选地，所述微反应器呈水相形式，优选，所述微反应器呈可以分散在油相中的水滴形式或呈可以分散在水相中的油包水液滴形式。9.根据权利要求8所述的微反应器，其平均直径为约5至200微米、优选10至100微米、更优选10至50微米、更优选10至30微米，更优选15至25微米。10.根据权利要求8所述的微反应器，其中所述生物活性物质是能够降解所述组分1或组分2的降解酶或降解微生物，优选地，所述降解微生物能够表达所述降解酶或能够表达所述降解酶的增强子，任选地，所述降解微生物是天然细胞或重组细胞，优选包含目的酶的多核苷酸。

技术总结
本申请提供了一种复合型多组分聚合物缓释微纳米颗粒，其包含多组分聚合物材料基质和一种或多种包埋降解指示剂，其中，所述多组分聚合物材料基质至少包括组分1和组分2，一种或多种指示剂包埋在多组分聚合物材料基质中。当多组分聚合物材料中的组分1被相关生物活性物质降解或分解时，组分2可以作为组分1和降解指示剂的缓释控制剂，组分1也可以作为组分2和降解指示剂的缓释控制剂，从而达到更好的降解效率指示效果。该多组分聚合物纳米颗粒也可以对多种生物活性物质的联合降解进行测试。基于微纳米颗粒指示剂，本申请开发了更高效的多组分聚合物材料降解筛选系统，有望为难降解材料提供新策略。供新策略。


技术研发人员：杜文斌 于海燕 陈栋炜 乔雨歆 汪之一
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：2023.01.05
技术公布日：2023/7/11