一种Pdx1

一种pdx1
+
胰腺祖细胞mettl3特异性敲除小鼠模型的建立方法
技术领域
1.本发明属于小鼠模型领域，特别涉及一种pdx1
+
胰腺祖细胞mettl3特异性敲除小鼠模型的建立方法。


背景技术：

2.表观遗传修饰，主要包括dna甲基化修饰，组蛋白-修饰，非编码rna修饰，rna甲基化等，其中rna甲基化是最近几年，表观遗传修饰研究的新兴热点方向。m6a甲基化转移酶3(rna methyltransferase-like3，mettl3)和甲基化转移酶14(rna methyltransferase-like14，mettl14)是m6a修饰的“编码器(writer)”复合体的重要组成成员，负责催化体内外的m6a甲基化修饰过程，对基因调控、rna降解和转录//翻译等方-面均具有重要的影响作用。最近几年的研究发现：mettl3参与了多种癌症发生/过程，包括参与促进肺癌转移、黑色素瘤侵袭、乳腺癌的进展、胃癌细胞的增殖/迁移以及恶性髓系白血病分化等。此外mettl3也在免疫性疾病、炎症性疾病和代谢性疾病(39)中起到了广泛的作用。而体内多种器官发育//和细胞分化的生物过程中，mettl3则更多起到平衡稳定的作用，如：维持造血干细胞/分化，调节小鼠精子/发生等。从机制上来说，mettl3可参与了一系列重要信号通路包括pi3k/akt、wnt/β-catenin和mapk/nf-κb途径等调控的生物过程。发表于2020年《diabetes》的研究中发现m6a甲基化转移酶：mettl3和mettl14的蛋白水平在糖尿病db/db小鼠,及2型/糖尿病人的胰岛β细胞中显著下调，揭示m6a水平异常可能参与2型糖尿病病理发病过程。通过借助内分泌-祖细胞水平ngn3-cre特异性/敲除mettl3/14的敲除小鼠模型，观察到双敲小鼠在出生后第2周出现随机-血糖升高，4周后发展为严重
‑‑
高血糖，并伴有外周胰岛素抵抗和糖耐量异常，同时β细胞-数目减少和成熟/分化障碍，而mettl3单敲的小鼠同样具有相似的糖代谢改变。通过测序以及/分子生物学实验，发现m6a修饰可直接影响新生期β细胞的重要转录因子mafa的稳定性和mafa蛋白表达，从而促进新生β细胞身份成熟分化。ren以及kulkarni等人也报道了m6a甲基化修饰可以影响成体β细胞的胰岛素分泌、增殖以及生存等。上述研究共同揭示了m6a甲基化在新生β细胞/成熟分化以及成体β细胞/增殖凋亡过程中发挥了重要的作用，但目前为止m6a修饰对早期胰岛形成的作用尚无报道研究。基于此前的研究是在内分泌/祖细胞形成后敲除mettl3/14，敲除小鼠在出生时0天的主要内分泌细胞群组分以及-数量与相同时间点的同窝/对照小鼠并无明显差异，而m6a多参与胚胎早期的器官发育以及细胞分化过程，尚不能肯定mettl3对胚胎早期胰岛发育以及内分泌细胞分化的作用。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供一种pdx1
+
胰腺祖细胞mettl3特异性敲除小鼠模型的建立方法，深入探索m6a甲基化参与胚胎内分泌细胞分化的具体机制，串联起胰岛发早期表观遗传修饰与成体糖稳态的建立，为胰岛扩充移植以及糖尿病治疗提供新途径和思路。
4.本发明提供了一种pdx1
+
胰腺祖细胞mettl3特异性敲除小鼠模型的建立方法，包括：
5.(1)将性成熟、8周龄雄性mettl3
flox/flox
小鼠与性成熟pdx1-cre雌性小鼠交配，获得mettl3
flox/w
杂合型小鼠，即pdx1-cre
+/-的mettl3 flox/w
小鼠；
6.(2)通过pdx1-cre
+
；mettl3 flox/w
和pdx1-cre-；mettl3
flox/w
杂合型小鼠交配，获得在pdx1阳性、胰腺祖细胞中特异性敲除mettl3蛋白的小鼠，命名为mettl3
pko
。
7.所有小鼠均在spf级动物饲养设施中饲养，动物房环境设置为20℃，12h/12h明暗交替的光照周期；纯净水和普通灭菌干饲料自由供给，每周更换3次。
8.小鼠出生14天进行基因型鉴定，然后18-21天分笼；除交配繁殖笼外，每≤5只、同性别小鼠一笼。
9.本发明为了更精准评估m6a甲基化对胚胎胰腺内分泌细胞分化的作用，将敲除的时间点提前至内分泌前体细胞形成之前的阶段，即pdx1
+
胰腺祖细胞水平。构建了在胰腺祖细胞水平上敲除mettl3(pdx1cre,mettl3
flox/flox
；简称mettl3
pko
)的动物模型，经测定胰腺细胞mrna的m6a/a％丰度明显降低，证明转基因小鼠构建成功，小鼠胰腺细胞的m6a修饰下调。
10.有益效果
11.本发明深入探索m6a甲基化参与胚胎内分泌细胞分化的具体机制，串联起胰岛发早期表观遗传修饰与成体糖稳态的建立，为胰岛扩充移植以及糖尿病治疗提供新途径和思路。
附图说明
12.图1a为mettl3
pko
小鼠模型构建示意图；b为正常wt对照小鼠以及mettl3
pko
小鼠e13.5天胰腺中mettl3(棕色)在胰腺间质以及胰腺上皮中的表达；c为正常wt对照小鼠以及mettl3
pko
小鼠e15.5天胰腺m6a丰度测定(n＝3)。所述独立实验的数据均以平均值
±
sem标准误表示；双尾t检验。
13.图2a-b为正常wt对照小鼠，mettl3het杂合子小鼠以及mettl3
pko
敲除小鼠8周的随机血糖监测(a)以及体重监测(b)(n＝5-6)。c为正常wt对照小鼠与mettl3
pko
敲除小鼠2周龄时血清胰岛素测定(n＝3)。d-e为出生后0天正常wt对照小鼠，mettl3
het
杂合子小鼠以及mettl3
pko
敲除小鼠的体重(d)以及随机血糖(e)(n＝5)。所述独立实验的数据均以：平均值
±
sem标准误表示，*p《0.05，**p《0.01，***p《-0.001。双尾t检验。
14.图3a为体视镜下正常wt对照小鼠以及mettl3
pko
小鼠出生时(p0)胰腺。b为正常wt对照小鼠以及mettl3
pko
小鼠出生时(p0)胰腺重量统计(n＝4)。所述独立实验的数据均以平均值
±
sem标准误表示，**p《0.01。双尾t检验。
15.图4a为正常wt对照小鼠以及mettl3pko小鼠出生时(p0)胰腺突触素免疫组化染色(n＝4)。b-d为正常wt对照小鼠以及mettl3pko小鼠出生时(p0)胰岛容量(b)、大小(c)、数目(d)统计(n＝4)。所述独立实验的数据均以平均值
±
sem标准误表示，**p《0.01，***p《0.001。双尾t检验。
16.图5a-b为胰高血糖素(gcg，红色)、生长抑素(sst，红色)、胰多肽(ppy，红色)和胰岛素(ins，绿色)在正常wt对照小鼠以及mettl3
pko
小鼠出生时(p0)胰腺进行免疫染色。c为
计算正常wt对照小鼠以及mettl3
pko
小鼠出生时(p0)胰腺切片上α/β/δ/pp细胞的绝对数(n＝3)。数据以平均值
±
sem标准误表示，*p《0.05，**p《0.01。双尾t检验。细胞核系dapi(蓝色)复染。
17.图6a为导管细胞标志ck19(红色)和胰岛素(ins，绿色)在正常wt对照小鼠以及mettl3
pko
小鼠出生时(p0)胰腺进行免疫染色。b为计算正常wt对照小鼠以及mettl3
pko
小鼠出生时(p0)胰腺切片上导管细胞的绝对数(n＝3)。数据以平均值
±
sem标准误表示，**p《0.01。t测验。细胞核系dapi(蓝色)复染。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
19.实施例1
20.1.实验动物：pdx1-cre小鼠，c57bl6/j，赛业-生物。mettl3
flox/flox
小鼠，c57bl6/j，中国-科学院。
21.2.实验过程：
22.(1)根据图1a所示，将性成熟、8周龄雄性mettl3
flox/flox
小鼠与性成熟pdx1-cre雌性小鼠交配，获得mettl3
flox/w
杂合型小鼠，即pdx1-cre
+/-的mettl3 flox/w
小鼠；
23.(2)通过pdx1-cre
+
；mettl3 flox/w
和pdx1-cre-；mettl3
flox/w
杂合型小鼠交配，获得在pdx1阳性、胰腺祖细胞中特异性敲除mettl3蛋白的小鼠，命名为mettl3
pko
。使用pdx1-cre小鼠以及mettl3
flox/flox
小鼠作为同窝对照。
24.所有小鼠均在spf级动物饲养设施中饲养，动物房环境设置为20℃，12h/12h明暗交替的光照周期；纯净水和普通灭菌干饲料自由供给，每周更换3次。
25.小鼠出生14天进行基因型鉴定，然后18-21天分笼；除交配繁殖笼外，每≤5只、同性别小鼠一笼。
26.对wt以及mettl3
pko
小鼠e13.5天的胚-胎胰腺进行免疫组化染色，观察到：mettl3(棕色)在胰腺间质细胞以及胰腺上皮细胞各细胞核中均有表达，而在敲除小鼠的胰腺上皮细胞中mettl3表达缺失(图1b)。
27.对两组小鼠e15.5天胚胎胰腺rna进行抽提，并进一步纯化为mrna，证实mettl3
pko
小鼠胰腺m6a/a％水平显著低于对照组(0.0585
±
0.0137％vs 0.0182
±
0.0062％，wt vs mettl3
pko
，p＝0.0551)，提示mettl3
pko
小鼠胰腺m6a修饰减少(图1c)。
28.以上结果共同证实，在pdx1
+
胰腺祖细胞水平上特异性敲除m6a甲基转移酶mettl3的转基因模型已构建成功,胰腺细胞的m6a修饰水平下调。
29.(3)mettl3
pko
小鼠出现早发糖尿病及低胰岛素血症
30.首先亟需确认的科学问题是：胰腺发育缺失mettl3是否会导致出生后糖尿病的发生。因此进一步对mettl3
pko
敲除小鼠进行了为期8周的血糖以及体重的动态监测。可以看到出生后1周的mettl3
pko
敲除小鼠的随机血糖水平以及体重与对照wt及mettl3
het
杂合子小鼠没有明显差异(图2a,b)。然而，mettl3
pko
敲除小鼠在出生后2周时开始出现随-机血糖水平
的显-著上升；并且mettl3
pko
的随机血糖随着周龄增加而逐渐升高(图2b)，在出生后4周即发展为接近临界值(33mmol/l)的严重高血糖(图2b)。而在8周的体重监测中mettl3
pko
敲除小鼠与其同窝对照wt小鼠以及杂合子小鼠相比并无明显差异(图2a)。此外，mettl3
pko
敲除小鼠的血清胰岛素在出生后2周时(p14)即血糖开始升高的时间点同样出现了明显的降低(0.892
±
0.197ng/ml vs0.311
±
0.059ng/ml，wt vs mettl3
pko
，p《0.05)(图2c)。后续，又观察了出生后0天(p0)时mettl3
pko
敲除小鼠与对照wt小鼠的体重以及空腹血糖，也未发现两组间有明显差异(图2d，e)。
31.(4)新生mettl3
pko
小鼠胰腺发育以及内分泌细胞形成受阻，导管细胞异常增多
32.首先分离了wt和mettl3
pko
小鼠出生0天时(p0)即随机血糖尚无差异时的胚胎胰腺并在体视镜下进行形态学的观察。观察到mettl3
pko
小鼠在出生0天时胰腺尺寸相较于正常小鼠的尺寸明显减小(图3a)，经称量后发现胰腺重量明显减轻(13.0
±
0.7mg vs 9.8
±
1.3mg，wt vs mettl3
pko
，p《0.01)(图3b)，提示胰腺祖细胞水平上敲除mettl3会引起胰腺萎缩，胰腺发育过程受阻。
33.为了探究mettl3
pko
发生早发糖尿病的原因，又对出生0天时mettl3
pko
小鼠的胰腺切片进行胰岛细胞标志物即突触素(synaptophysin，syn)的免疫组化染色(图4a)，发现出生0天时mettl3
pko
小鼠胰岛容量(mass)明显降低(2.43
±
0.07％vs 1.32
±
0.06％，wt vs mettl3
pko
，p《0.001)(图4b)，同时通过统计，可以看到胰岛的大小(5561.71
±
445.76μm
2 vs 2735.23
±
382.56μm2，wt vs mettl3
pko
，p《0.01)以及数目(21.90
±
1.77vs 12.03
±
1.62，wt vs mettl3
pko
，p《0.01)均较wt小鼠明显减少(图4c，d)。
34.为了明确不同内分泌细胞的分化情况，进一步通过免疫荧光染色以观察出生0天时mettl3
pko
小鼠和wt小鼠胰腺中胰岛素(β)、胰高血糖素(α)、生长抑素(δ)和胰多肽(pp)分泌的四种主要的内分泌激素细胞(图5a-b)，通过计数发现出生后0天的mettl3
pko
小鼠的β细胞的绝对数目明显降低(466.72
±
29.62vs 162.72
±
38.64，wt vs mettl3
pko
，p《0.01)，同时α细胞(267.56
±
34.78vs 91.33
±
9.07，wt vs mettl3
pko
，p《0.01)、δ细胞(86.72
±
7.57vs 32.67
±
4.85，wt vs mettl3
pko
，p《0.05)和pp细胞的绝对数量(22.17
±
3.15vs 9.06
±
0.64，wt vs mettl3
pko
，p《0.05)也有不同程度的降低(图5c)。
35.有意思的是，通过对胰腺导管标志物：细胞角蛋白19(cytokeratin 19，ck19)的免疫荧光染色发现出生0天时mettl3
pko
小鼠的导管细胞出现异常增多(图6a)。计数结果表明，与wt小鼠相比，mettl3
pko
小鼠每个截面的平均的导管细胞数量(410.0
±
53.8vs 1031.3
±
115.2，wt vs mettl3pko，p《0.01)有显著增加(图6a，6b)。
36.综上数据表明，mettl3在小鼠胰腺发育过程中具有非常重要的作用，胰腺祖细胞缺失mettl3可导致小鼠胰腺萎缩且胰岛形成减少，内分泌细胞分化障碍，同时导管细胞也出现显著增多，胰腺细胞组分发生改变。
37.3.结论
38.本发明首先观察了mettl3、mettl14在e17.5天至出生后2周胰岛内的表达情况，发现两者在胰岛发育过程中表达逐渐增强。通过使用内分泌前体细胞(ngn3+)选择性敲除mettl3和mettl14的转基因小鼠，观察到小鼠在出生后2周即出现高糖血症，并伴有低胰岛素血症，β细胞的容量缺失以及成熟分化障碍。分离敲除小鼠的胚胎胰岛后进行m6a甲基化测序和转录组测序观察到m6a修饰可通过降低新生β细胞的重要转录因子mafa稳定性和表
达水平，进而调控新生β细胞的功能获得以及成熟分化(45)。而利用ngn3cre内分泌前体细胞上敲除mettl3/14的小鼠模型并未在出生时0天有发现内分泌细胞分化的改变。
39.本发明深入探索m6a甲基化参与胚胎内分泌细胞分化的具体机制，串联起胰岛发早期表观遗传修饰与成体糖稳态的建立，为胰岛扩充移植以及糖尿病治疗提供新途径和思路。

技术特征：
1.一种pdx1+胰腺祖细胞mettl3特异性敲除小鼠模型的建立方法，包括：(1)将性成熟、8周龄雄性mettl3
flox/flox
小鼠与性成熟pdx1-cre雌性小鼠交配，获得mettl3
flox/w
杂合型小鼠，即pdx1-cre
+/-的mettl3 flox/w
小鼠；(2)通过pdx1-cre
+
；mettl3 flox/w
和pdx1-cre-；mettl3
flox/w
杂合型小鼠交配，获得在pdx1阳性、胰腺祖细胞中特异性敲除mettl3蛋白的小鼠，命名为mettl3
pko
。2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：所有小鼠均在spf级动物饲养设施中饲养，动物房环境设置为20℃，12h/12h明暗交替的光照周期；纯净水和普通灭菌干饲料自由供给，每周更换3次。3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：小鼠出生14天进行基因型鉴定，然后18-21天分笼；除交配繁殖笼外，每≤5只、同性别小鼠一笼。

技术总结
本发明涉及一种Pdx1


技术研发人员：汪启迪 孙佳俊 宁光 王卫庆
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属瑞金医院
技术研发日：2022.12.09
技术公布日：2023/7/11