杀虫蛋白的用途的制作方法

1.本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种ach1蛋白质通过在植物中表达来控制双斑萤叶甲为害植物的用途。


背景技术：

2.双斑萤叶甲(monolepta hieroglyphica(motschulsky))也叫长跗萤叶甲，属鞘翅目叶甲科，是为害玉米的一种新型害虫。为鞘翅目叶甲科萤叶甲属全变态型昆虫。主要发生在7～9月份，以成虫为害玉米叶片，轻者叶片呈纱网状，重者玉米整个叶片干枯。该虫有群聚习性和趋嫩为害习性，常集中于一棵植株自上而下取食玉米叶肉，嫩叶被咬成孔洞，中下部叶片被害后，残留网状叶脉或表皮，远看呈小面积不规则白斑，对光合作用影响较大；玉米抽雄吐丝后，该虫喜取食花药、花丝，严重影响玉米正常扬花和受粉，并容易引发穗腐病。
3.玉米和大豆是中国重要的粮食作物，每年因双斑萤叶甲造成的粮食损失巨大，更甚者影响到当地人口的生存状况。为了防治双斑萤叶甲，人们通常采用的主要防治方法有：农业防治、化学防治、物理防治和生物防治。
4.农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因素、创造一个有利于作物生长而不利于双斑萤叶甲发生的农田生态环境，如利用大水漫灌方式将虫卵和幼虫淹死在土壤中。但该法收效甚微，且对水资源的耗用极大。
5.化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是双斑萤叶甲综合治理的重要组成部分，它具有快速、方便、简便和高经济效益的特点，特别是双斑萤叶甲大发生的情况下，是必不可少的应急措施。目前化学防治方法主要是药液喷雾和种衣剂。药液喷雾为每百株玉米达到50头以上开始防治，用高氯吡虫啉2000倍液在双斑萤叶甲高发期喷雾。也可以用破棉絮蘸200倍液的甲拌磷乳油，每五十平米至一百平米放一个点，进行熏蒸，把蘸药的破棉絮放到玉米穗的上个叶鞘上进行防治。但双斑萤叶甲幼虫为地下生活，药剂喷洒无法控制地下幼虫。双斑萤叶甲成虫能飞善跳，在田块间和寄主间迁移，需要大规模的统防统治。这需要大量的组织管理成本，真正实施起来异常困难。目前小农户只管自己一小块地的施药，并不能有效防治双斑萤叶甲成虫。种衣剂进行防治，将干燥或湿润状态的种子，用含有粘结剂的农药组合物所包，使在种子外形成具有一定功能和包覆强度的保护层，这一过程称为种子包衣，包在种子外边的组合物质称之为种衣剂。因为种衣剂含农药成分，所以对侵害种子的地下害虫有一定的防治作用。但种衣剂的作用效果受到时间和雨水环境的影响，并不能保持稳定的控虫效果。且一般种衣剂持效期仅一个月，即按照东北玉米播种情况，种衣剂在5月最为有效，6月时效果已经开始衰减。而双斑萤叶甲的卵往往于5月底开始孵化，6月为其幼虫为害期。所以种衣剂的最佳药效期与双斑萤叶甲幼虫发育时期错开，并不能很好控制双斑萤叶甲幼虫。且化学防治也有其局限性，如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。
6.物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如
光、电、色、温湿度等以及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。但双斑萤叶甲成虫并没有明显的趋色性，所以并不能采用挂黄板等进行诱集以达到杀灭的目的。双斑萤叶甲成虫于白天活动，尤其是夏季高温中午活动，此时并不利于采用灯诱(灯光强度无法超越日光，不具有引诱性)，而夜晚双斑萤叶甲蛰伏于近地草丛和玉米下部，并不接受引诱。故至今尚未发现对双斑萤叶甲为害具有一定效果的物理防治措施。
7.生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量，以达到降低或消灭害虫的目的，如选择对天敌毒性低的农药，并根据害虫和天敌田间发生期的差异，调整施药时间，避开在天敌大量发生时施药以保护天敌。其特点是对人、畜安全，对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制的目的；但是效果常不稳定，并且不论双斑萤叶甲发生轻重均需同样投资进行。且由于双斑萤叶甲产卵于地下，并不适用于赤眼蜂等卵寄生益虫的使用。而其羽化成虫本身为能飞善跳的鞘翅目，同属鞘翅目的瓢虫无法对双斑萤叶甲成虫产生胁迫。所以目前尚未发现对双斑萤叶甲为害具有一定效果的生物防治措施。
8.为了解决农业防治、化学防治、物理防治和生物防治在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。
9.通过将作物进行遗传工程改造，将苏云金芽孢杆菌(bt)蛋白导入作物中，已经开发出抗害虫的作物。例如利用cry1ab开发了对玉米螟具有抗性的玉米。现在，这些转基因作物被广泛应用于农业中，并且为农民提供了取代传统昆虫防治方法的环境友好型替代方案。虽然它们已被证明对鳞翅目害虫(玉米螟、棉铃虫等)具有相当好的防治效果，但目前尚未发现能够防控双斑萤叶甲的转基因作物。这主要原因是至今尚未发现对双斑萤叶甲具有毒力的bt蛋白。
10.ach1是一类全新杀虫蛋白，其与传统bt蛋白完全不同。通过蛋白二级结构的分析，推测该蛋白属于β-开孔蛋白。该类蛋白的作用机制一般为酶切活化、与受体结合、形成寡聚体、在膜表面开孔。其中昆虫肠道内的酶切活化、与昆虫肠道上的受体结合以及肠道内的理化环境决定了该蛋白能否在昆虫肠道细胞膜上完成开孔。该类蛋白由菌体分泌之后，需要在作用对象体内经酶切形成活性蛋白，酶切过程主要在蛋白的氨基端或羧基端进行，将该蛋白变成活性片段。活性蛋白与昆虫肠道上皮细胞膜上的受体结合，形成寡聚体，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病征，破坏细胞膜内外的渗透压变化及ph平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。
11.已报道ach1蛋白对家蚕、马铃薯甲虫害虫有抗虫效果。然而，至今尚无关于通过产生表达ach1蛋白的转基因植株来控制双斑萤叶甲对植物危害的报道。


技术实现要素：

12.本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达ach1蛋白来控制双斑萤叶甲的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防治、物理防治和生物防治等技术缺陷。
13.为实现上述目的，本发明提供了一种控制双斑萤叶甲害虫的方法，包括将双斑萤叶甲害虫至少与ach1蛋白接触。
14.进一步地，所述ach1蛋白存在于至少产生所述ach1蛋白的宿主细胞中，所述双斑
萤叶甲害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述ach1蛋白接触。
15.更进一步地，所述ach1蛋白存在于至少产生所述ach1蛋白的细菌或转基因植物中，所述双斑萤叶甲害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述ach1蛋白接触，接触后所述双斑萤叶甲害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对双斑萤叶甲危害植物的控制。
16.所述转基因植物可以处于任意生育期。
17.所述转基因植物的组织为根、叶片、茎秆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
18.所述对双斑萤叶甲危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
19.所述植物为大豆、小麦、大麦、玉米、烟草、水稻、油菜、棉花或向日葵。
20.所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述ach1蛋白的多核苷酸的植物。
21.在上述技术方案的基础上，所述ach1蛋白为ach1_1蛋白、ach1_2蛋白、ach1_3蛋白或ach1_4蛋白。
22.优选地，所述ach1蛋白氨基酸序列具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列。
23.在上述技术方案的基础上，所述植物还包括至少一种不同于编码所述ach1蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
24.进一步地，所述第二种核苷酸编码cry类杀虫蛋白质、vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。
25.优选地，所述第二种核苷酸编码cry3bb蛋白。
26.更进一步地，所述cry3bb蛋白的氨基酸序列具有seq id no:13所示的氨基酸序列。所述第二种核苷酸具有seq id no:14所示的核苷酸序列。
27.可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsrna。
28.为实现上述目的，本发明还提供了一种ach1蛋白质控制双斑萤叶甲害虫的用途。
29.为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制双斑萤叶甲害虫的植物的方法，包括向所述植物的基因组中引入编码ach1蛋白的多核苷酸序列。
30.为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制双斑萤叶甲害虫的植物种子的方法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码ach1蛋白的多核苷酸序列的种子。
31.为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制双斑萤叶甲害虫的植物的方法，包括：
32.种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码ach1蛋白的多核苷酸序列；
33.使所述植物种子长成植株；
34.使所述植株在人工接种双斑萤叶甲害虫和/或双斑萤叶甲害虫自然发生危害的条件下生长，收获与其他不具有编码ach1蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量的植株。
35.本发明中所述的“接触”，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或
具有产生杀虫蛋白的微生物。
36.本发明术语“控制”和/或“防治”是指双斑萤叶甲害虫至少与ach1蛋白接触，接触后双斑萤叶甲害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，双斑萤叶甲害虫通过摄食植物组织至少与ach1蛋白接触，接触后全部或部分双斑萤叶甲害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码ach1蛋白的多核苷酸序列的控制双斑萤叶甲害虫的植物和/或植物种子，在人工接种双斑萤叶甲害虫和/或双斑萤叶甲害虫自然发生危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的茎秆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。ach1蛋白对双斑萤叶甲的“控制”和/或“防治”作用是可以独立存在的，不因其它可“控制”和/或“防治”双斑萤叶甲害虫的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物(含有编码ach1蛋白的多核苷酸序列)的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，ach1蛋白和/或可控制双斑萤叶甲害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响ach1蛋白对双斑萤叶甲的“控制”和/或“防治”作用，也不能导致所述“控制”和/或“防治”作用完全和/或部分由所述另一种物质实现，而与ach1蛋白无关。通常情况下，在大田，双斑萤叶甲害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种双斑萤叶甲害虫和/或双斑萤叶甲害虫自然发生危害的条件下，如转基因植物(含有编码ach1蛋白的多核苷酸序列)的任何组织存在死亡的双斑萤叶甲害虫、和/或在其上停留生长受到抑制的双斑萤叶甲害虫、和/或与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过双斑萤叶甲害虫至少与ach1蛋白接触以实现控制双斑萤叶甲害虫的方法和/或用途。
37.在本发明中，ach1蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个cry类杀虫蛋白质和/或vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第1亲本)可以通过遗传工程操作表达ach1蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达cry类杀虫蛋白质和/或vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
38.rna干扰(rna interference，rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-stranded rna，dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。因此在本发明中可以使用rnai技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
39.本发明所述的双斑萤叶甲(monolepta hieroglyphica(motschulsky))，为鞘翅目叶甲科萤叶甲属全变态型昆虫。成虫体长3.6～4.8mm、宽2～2.5mm，触角11节丝状，端部色黑，长为体长的2/3；复眼大，呈卵圆形；前胸背板宽大于长，表面隆起，密布很多细小刻点；小盾片黑色，呈三角形；鞘翅布有线状细刻点，每个鞘翅基半部具l个近圆形淡色斑，四周黑色，淡色斑后外侧多不完全封闭，两翅后端合为圆形。简单识别法是，成虫两个鞘翅基部各有1个大的淡黄色斑，四周黑色，鞘翅端半部为黄色。
40.双斑萤叶甲在我国广泛分布，主要分布于东北、华北、江苏、浙江、湖北、江西、福建、广东、广西、宁夏、甘肃、陕西、四川、云南、贵州、台湾等省区。属于杂食性害虫，主要危害豆类、马铃薯、苜蓿、玉米、茼蒿、胡萝卜、十字花科蔬菜、向日葵、杏树、苹果等作物。幼虫在
田间主要取食作物根部，其为害不能在地上部体现；每年7月中旬开始能够发现其成虫在玉米和大豆田间危害叶片；7月底至8月初大量成虫主要为害玉米花丝，将玉米花丝咬断，严重影响授粉，造成突尖、纺锤形穗子，导致玉米减产；随后，双斑萤叶甲转移至大豆田间取食大豆叶片，也可转移至周边蔬菜田间为害蔬菜。从2009年至2016年，双斑萤叶甲对玉米的为害面积从1600万亩次上升到将近4000万亩次，发生面积翻了2倍。且造成为害的区域也从西北等地蔓延到东北、华北等玉米主要生产区域。
41.双斑萤叶甲所属的叶甲科是鞘翅目中种类最丰富的科。尽管双斑萤叶甲与马铃薯甲虫同属于叶甲科，除了在分类标准上存在相似性，在其它形态结构或习性上则存在极大差异。就好比植物中的草莓与苹果一样(同属于蔷薇目蔷薇科)，它们都有花两性，辐射对称，花瓣5片等特征，但是其果实以及植株形态却是千差万别。但因人们较少接触昆虫，尤其是较少接触农业害虫，对于昆虫形态上的差异较少关注，而使得人们以为昆虫的形态大同小异。而事实上，双斑萤叶甲有其独特的形态特征。例如马铃薯甲虫的成虫体背显著隆起，红黄色，有光泽。鞘翅色稍淡，每一鞘翅上具黑色纵带5条。而双斑萤叶甲成虫的两个鞘翅基部各有1个大的淡黄色斑，四周黑色，鞘翅端半部为黄色。
42.同属叶甲科的昆虫不仅在形态特征上存在较大差异，同时在取食习性上，也存在差异。例如同为叶甲科的马铃薯甲虫的寄主主要是茄科植物，其成虫取食马铃薯叶片并在马铃薯叶片和叶腋间产卵，卵孵化后继续为害马铃薯叶片，属于全地上生活型，期间不发生生活空间的转移，也不发生食性的转移。而双斑萤叶甲的寄主相对广泛，包括豆类、玉米、马铃薯、棉花、麻类、蔬菜等重要作物。成虫取食玉米地上部分，产卵于土中，经过冬季滞育后于次年孵化，孵化后幼虫土中生活并取食玉米根直至羽化。这期间既发生了生活空间的转移，又发生了食性的改变。取食习性的不同，也暗示着体内消化系统所产生的酶和受体蛋白不同。其中昆虫肠道内的酶切活化、与昆虫肠道上的受体结合以及肠道内的理化环境是β-开孔蛋白起作用的关键点，只有能够将β-开孔蛋白进行酶切成活性片段后，并与昆虫肠道上皮细胞膜上的受体结合，才有可能使得某个β-开孔蛋白对该害虫具有抗虫效果。受体结合过程需要精确匹配，往往开孔蛋白或受体蛋白上的一个氨基酸差异就能造成与同一受体的结合发生改变。例如同属于β-开孔蛋白的气溶素蛋白(aerolysin)在r336a突变后，对ctll-2细胞系的毒力产生了质的变化(osusky,teschk等，2008)。同样由于受体发生了变化也可导致同一个β-开孔蛋白的毒力发生变化。例如采用dsrna将mdck细胞系上的havcr1基因进行抑制，导致了ε-毒蛋白(epsilon-toxin)对细胞的毒力产生了百倍差异(ivie,fennessey等，2011)。这充分说明了β-开孔蛋白与昆虫体内酶和受体的相互作用方式是复杂且难以预料的。
43.本发明所述的绿豆象(callosobruchus chinensis(linnaeus))是一种仓储害虫，和马铃薯甲虫同属于鞘翅目叶甲科。主要危害菜豆、豇豆、扁豆、豌豆、蚕豆、绿豆、赤豆等。成虫可在仓内豆粒上或田间豆荚上产卵，每雌可产70-80粒。幼虫孵化后即蛀入豆荚豆粒,成虫有假死性。各虫期均可在豆粒中越冬，次年春化蛹羽化。
44.本发明所述的马铃薯二十八星瓢虫(henosepilachna vigintioctomaculata(motschulsky))，属于鞘翅目瓢虫科，且主要为害马铃薯。其食性和生活空间与马铃薯甲虫一致，均是成虫取食马铃薯叶片并产卵于马铃薯叶片和叶腋上，孵化后幼虫仍然取食马铃薯叶片。
45.本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
46.本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。
47.本领域技术人员所熟知的，dna典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于dna在植物中复制产生了dna的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将dna的一条链转录为一条mrna的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mrna实际上是从dna的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(orf)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的dna有相当功能的rna。
48.本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明ach1基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明ach1基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
49.本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进dna杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0
×
氯化钠/柠檬酸钠(ssc)处理，然后在50℃条件下用2.0
×
ssc洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0
×
ssc、50℃到高度严格条件的约0.2
×
ssc、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6
×
ssc、0.5％sds溶液中，在65℃下发生特异性杂交，然后用2
×
ssc、0.1％sds和1
×
ssc、0.1％sds各洗膜1次。
50.因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40％-50％同源，大约60％、65％或70％同源，甚至至少大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。
51.本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定
示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗双斑萤叶甲害虫的生物活性的蛋白。
52.本发明中所述的dna分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始dna或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。
53.使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用dna重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶诸如bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限制性内切酶获取编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。
54.本发明可以从β-开孔蛋白分离物和/或dna文库衍生出等价蛋白和/或编码这些等价蛋白的基因。有多种方法获取本发明的杀虫蛋白。例如，可以使用本发明公开和要求保护的杀虫蛋白的抗体从蛋白质混合物鉴定和分离其它蛋白。特别地，抗体可能是由蛋白最恒定和与其它β-开孔蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(elisa)或western印迹方法使用这些抗体专一地鉴定有特征活性的等价蛋白。可使用本领域标准程序容易的制备本发明中公开的蛋白或等价蛋白或这类蛋白的片段的抗体。然后可以从微生物中获得编码这些蛋白的基因。
55.由于遗传密码子的丰余性，多种不同的dna序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代dna序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的dna序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。
56.本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。
57.保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，n.neurath和r.l.hill在1979年纽约学术出版社(academic press)出版的《protein》中进行了描述。最常见的互换有ala/ser，val/ile，asp/glu，thu/ser，ala/thr，ser/asn，ala/val，ser/gly，tyr/phe，ala/pro，lys/arg，asp/asn，leu/ile，leu/val，ala/glu和asp/gly，以及它们相反的互换。
58.对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴
定(如参见，cunningham和wells，1989，science 244：1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如de vos等，1992，science 255：306-312；smith等，1992，j.mol.biol 224:899-904；wlodaver等，1992，febs letters 309：59-64)。
59.在本发明中，ach1蛋白包括但不限于seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4，与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于78％，优选的大于85％，更优选的大于90％，甚至更优选的大于95％，并且可以大于99％。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或类似性。
60.本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到所述ach1蛋白的调节序列。
61.所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35s启动子、玉米ubi启动子、水稻gos2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规rna试验进行测定)，如pep羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pinⅰ和pinⅱ)和玉米蛋白酶抑制基因(mpi)的启动子。
62.所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用
‘
kdel’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的ctpp靶向液泡。
63.所述前导序列包含但不限于，小rna病毒前导序列，如emcv前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯y病毒组前导序列，如mdmv(玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(bip)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mrna的不翻译前导序列(amv rna4)；烟草花叶病毒(tmv)前导序列。
64.所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(camv)增强子、玄参花叶病毒(fmv)增强子、康乃馨风化环病毒(cerv)增强子、木薯脉花叶病毒(csvmv)增强子、紫茉莉花叶病毒(mmv)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(cmylcv)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(clcumv)、鸭跖草黄斑驳病毒(coymv)和花生褪绿线条花叶病毒(pclsv)增强子。
65.对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛
no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列。除了包含ach1蛋白的编码区外，也可包含其他元件，例如编码选择性标记的蛋白质。
73.此外，包含编码本发明ach1蛋白的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如epsps基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如ppt)的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。
74.本发明中，将外源dna导入植物，如将编码所述ach1蛋白的基因或表达盒或重组载体导入植物细胞，常规的转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将dna摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的dna导入。
75.本发明提供了一种杀虫蛋白的用途，具有以下优点：
76.1、内因防治。现有技术主要是通过外部作用即外因来控制双斑萤叶甲害虫的危害，如农业防治、化学防治、物理防治和生物防治；而本发明是通过植物体内产生能够杀死双斑萤叶甲的ach1蛋白来控制双斑萤叶甲害虫的，即通过内因来防治。
77.2、无污染、无残留。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制双斑萤叶甲害虫的危害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制双斑萤叶甲害虫的方法，可以消除上述不良后果。
78.3、全生育期防治。现有技术使用的控制双斑萤叶甲害虫的方法都是阶段性的，而本发明是对植物进行全生育期的保护，转基因植物(ach1蛋白)从发芽、生长，一直到开花、结果，都可以避免遭受双斑萤叶甲的侵害。
79.4、全植株防治。现有技术使用的控制双斑萤叶甲害虫的方法大多是局部性的，如叶面喷施；而本发明是对整个植株进行保护，如转基因植物(ach1蛋白)的根、叶片、茎秆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝等都是可以抵抗双斑萤叶甲侵害的。
80.5、效果稳定。现有技术使用的无论是农业防治方法还是物理防治方法都需要利用环境条件对害虫进行防治，可变因素较多；本发明是使所述ach1蛋白在植物体内进行表达，有效地克服了环境条件不稳定的缺陷，且本发明转基因植物(ach1蛋白)的防治效果在不同地点、不同时间、不同遗传背景也都是稳定一致的。
81.6、简单、方便、经济。本发明只需种植能够表达ach1蛋白的转基因植物即可，而不需要采用其它措施，从而节省了大量人力、物力和财力。
82.7、效果彻底。现有技术使用的控制双斑萤叶甲害虫的方法，其效果是不彻底的，只起到减轻作用；而本发明转基因植物(ach1蛋白)可以造成初孵双斑萤叶甲幼虫的大量死亡。
83.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
84.图1为本发明杀虫蛋白的用途的含有ach1核苷酸序列的重组表达载体dbn01-p构建流程图；
85.图2为本发明杀虫蛋白的用途的含有ach1核苷酸序列的重组表达载体dbn01-t构
建流程图；
86.图3为本发明杀虫蛋白的用途的含有ach1核苷酸序列的植物重组表达载体dbn01-b构建流程图。
具体实施方式
87.下面通过具体实施例进一步说明本发明杀虫蛋白的用途的技术方案。
88.第一实施例、基因的获得和合成
89.1、获得核苷酸序列
90.ach1_1杀虫蛋白质的氨基酸序列(309个氨基酸)，如序列表中seq id no:1所示；细菌中编码相应于所述ach1_1杀虫蛋白质的氨基酸序列的ach1_1细菌核苷酸序列(930个核苷酸)，如序列表中seq id no:5所示；植物中编码相应于所述ach1_1杀虫蛋白质的氨基酸序列的ach1_1植物核苷酸序列(930个核苷酸)，如序列表中seq id no:9所示。
91.ach1_2杀虫蛋白质的氨基酸序列(306个氨基酸)，如序列表中seq id no:2所示；细菌中编码相应于所述ach1_2杀虫蛋白质的氨基酸序列的ach1_2细菌核苷酸序列(921个核苷酸)，如序列表中seq id no:6所示；植物中编码相应于所述ach1_2杀虫蛋白质的氨基酸序列的ach1_2植物核苷酸序列(921个核苷酸)，如序列表中seq id no:10所示。
92.ach1_3杀虫蛋白质的氨基酸序列(309个氨基酸)，如序列表中seq id no:3所示；细菌中编码相应于所述ach1_3杀虫蛋白质的氨基酸序列的ach1_3细菌核苷酸序列(930个核苷酸)，如序列表中seq id no:7所示；植物中编码相应于所述ach1_3杀虫蛋白质的氨基酸序列的ach1_3植物核苷酸序列(930个核苷酸)，如序列表中seq id no:11所示。
93.ach1_4杀虫蛋白质的氨基酸序列(309个氨基酸)，如序列表seq id no:4所示；细菌中编码相应于所述ach1_4杀虫蛋白质的氨基酸序列的ach1_4细菌核苷酸序列(930个核苷酸)，如序列表中seq id no:8所示；植物中编码相应于所述ach1_4杀虫蛋白质的氨基酸序列的ach1_4植物核苷酸序列(930个核苷酸)，如序列表中seq id no:12所示。
94.2、合成上述核苷酸序列
95.合成所述ach1_1、ach1_2、ach1_3、ach1_4的细菌核苷酸序列(如序列表中seq idno:5至seq id no:8所示)、所述ach1_1的植物核苷酸序列(如序列表中seq id no:9所示)。
96.第二实施例、重组表达载体的构建和重组表达载体转化大肠杆菌获得ach1蛋白
97.1、构建含有ach1基因的重组表达载体
98.将第一实施例合成的ach1_1细菌核苷酸序列连入蛋白表达载体pet28a(novagen，usa，cat：69864-3)上，操作步骤按novagen公司产品pet28a载体说明书进行，得到重组表达载体dbn01-p，其构建流程如图1所示(其中，kan表示卡纳霉素抗性基因；f1 ori表示噬菌体f1的复制起点；lacl为lacl起始密码子；ach1_1为ach1_1细菌核苷酸序列(seq id no:5)；mcs为多克隆位点)。
99.按照上述构建重组表达载体dbn01-p的方法，将合成的所述ach1_2细菌核苷酸序列连入蛋白表达载体pet28a上，得到重组表达载体dbn02-p，其中，ach1_2为ach1_2细菌核苷酸序列(seq id no:6)。
100.按照上述构建重组表达载体dbn01-p的方法，将合成的所述ach1_3细菌核苷酸序
列连入蛋白表达载体pet28a上，得到重组表达载体dbn03-p，其中，ach1_3为ach1_3细菌核苷酸序列(seq id no:7)。
101.按照上述构建重组表达载体dbn01-p的方法，将合成的所述ach1_4细菌核苷酸序列连入蛋白表达载体pet28a上，得到重组表达载体dbn04-p，其中，ach1_4为ach1_4细菌核苷酸序列(seq id no:8)。
102.2、重组表达载体转化大肠杆菌获得ach1蛋白
103.然后将重组表达载体dbn01-p、dbn02-p、dbn03-p、dbn04-p用热激方法转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(transgen，china，cat：cd501)，挑取阳性克隆于lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l、氨苄青霉素100mg/l，用naoh调ph至7.5)中于温度37℃，转速200r/min条件下培养16h。再将培养液按照1：10的比例转接到yt培养基中，置于温度37℃，转速200r/min条件下培养。当培养液的od＝600值达到0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为0.5mm进行诱导表达6h，离心培养液收集菌体，弃上清，加入pbs重悬后超声波破碎，用sds-page对表达蛋白进行检测，估算蛋白浓度，于温度-20℃保存备用。
104.第三实施例、饲喂ach1蛋白鉴定对双斑萤叶甲的抗虫效果
105.将实施例二中所述的2获得的ach1_1、ach1_2、ach1_3、ach1_4蛋白对双斑萤叶甲、绿豆象、马铃薯二十八星瓢虫进行抗虫效果检测。每一个虫子共设置4个处理，分别为：ach1_1、ach1_2、ach1_3、ach1_4。以及1个阴性对照处理：gfp。
106.双斑萤叶甲：将ach1_1、ach1_2、ach1_3、ach1_4、gfp的蛋白液分别混合到饲料中，终浓度为50g/g。每组处理进行3次重复。
107.绿豆象：将ach1_1、ach1_2、ach1_3、ach1_4、gfp的蛋白液按照50g/g的浓度浸泡绿豆。每组处理进行3次重复。
108.马铃薯二十八星瓢虫：将ach1_1、ach1_2、ach1_3、ach1_4、gfp的蛋白液按照50g/g的浓度浸泡马铃薯叶片。每组处理进行3次重复。
109.表1、ach1蛋白饲喂双斑萤叶甲、绿豆象、马铃薯二十八星瓢虫的抗虫结果
[0110][0111]“+”代表有抗虫效果；
“‑”
代表无抗虫效果
[0112]
表1的结果表明：ach1_1、ach1_2、ach1_3、ach1_4蛋白均对双斑萤叶甲表现出良好的抗虫效果，而对同为鞘翅目的绿豆象(同科)和马铃薯二十八星瓢虫均无抗虫效果。
[0113]
上述结果充分说明了抗虫蛋白对昆虫的毒性与昆虫所属科目不具有必然联系，其
与抗虫蛋白的作用机制密不可分，即昆虫肠道内的酶切活化、与昆虫肠道上的受体结合以及肠道内的理化环境是β-开孔蛋白起作用的关键点，且β-开孔蛋白与昆虫体内酶和受体的相互作用方式是复杂且难以预料的。
[0114]
第四实施例、植物表达载体的构建
[0115]
1、构建含有ach1基因的重组克隆载体
[0116]
将合成的ach1_1植物核苷酸序列连入克隆载体pgem-t(promega，madison，usa，cat：a3600)上，操作步骤按promega公司产品pgem-t载体说明书进行，得到重组克隆载体dbn01-t，其构建流程如图2所示(其中，amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1ori表示噬菌体f1的复制起点；lacz为lacz起始密码子；sp6为sp6rna聚合酶启动子；t7为t7rna聚合酶启动子；ach1_1为ach1_1植物核苷酸序列(seq id no:9)；mcs为多克隆位点)。
[0117]
然后将重组克隆载体dbn01-t用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞(transgen，beijing，china，cat：cd501),挑取白色菌落，在lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l、氨苄青霉素100mg/l，用naoh调ph至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒,于温度-20℃保存备用。
[0118]
提取的质粒经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体dbn01-t中插入的所述ach1_1核苷酸序列为序列表中(seq id no:9)所示的核苷酸序列，即ach1_1植物核苷酸序列正确插入。
[0119]
2、构建含有ach1基因的重组表达载体
[0120]
用限制性内切酶分别酶切重组克隆载体dbn01-t和表达载体dbnbc-01(载体骨架：pcambia2301(cambia机构可以提供))，将切下的ach1_1植物核苷酸序列片段插到表达载体dbnbc-01的限制性内切酶酶切位点间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体dbn01-b，其构建流程如图3所示(kan：卡那霉素基因；rb：右边界；prubi：玉米泛素(ubiquitin)基因启动子(seq id no:15)；ach1_1：ach1_1核苷酸序列(seq id no:9)；tnos：胭脂碱合成酶基因的终止子(seq id no:16)；hpt：潮霉素磷酸转移酶基因(seq id no:17)；lb：左边界)。
[0121]
将重组表达载体dbn01-b用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞，挑取白色菌落，在lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l、卡那霉素50mg/l，用naoh调ph至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜,碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体dbn01-b中的核苷酸序列含有为序列表中seq id no:9所示核苷酸序列，即ach1_1植物核苷酸序列。
[0122]
3、重组表达载体转化农杆菌
[0123]
对己经构建正确的重组表达载体dbn01-b用液氮法转化到农杆菌lba4404(invitrgen，chicago，usa，cat：18313-015)中，其转化条件为：100μl农杆菌lba4404、3μl质粒dna(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌lba4404接种于lb试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/l的利福平(rifampicin)和100mg/l的卡那霉素的lb平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶对重组表达载体dbn01-b切后进行验证，结果表明重组表达载体dbn01-b的结构完全正确。
[0124]
第五实施例、转基因玉米植株的获得
[0125]
按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31(z31)的幼胚与第四实施例中3所述的重组表达载体转化的农杆菌共培养，以将第四实施例中2构建的重组表达载体dbn01-b中的t-dna(包括玉米泛素基因的启动子序列、ach1_1核苷酸序列、hpt基因和nos终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了转入ach1_1核苷酸序列的玉米植株；同时以野生型玉米植株作为对照。
[0126]
对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将ach1_1核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)，在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(od
660
＝0.4-0.6，侵染培养基(ms盐4.3g/l、ms维他命、干酪素300mg/l、蔗糖68.5g/l、葡萄糖36g/l、乙酰丁香酮(as)40mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)1mg/l，ph5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(ms盐4.3g/l、ms维他命、干酪素300mg/l、蔗糖20g/l、葡萄糖10g/l、乙酰丁香酮(as)100mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)1mg/l、琼脂8g/l，ph5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(ms盐4.3g/l、ms维他命、干酪素300mg/l、蔗糖30g/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)1mg/l、琼脂8g/l，ph5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(潮霉素)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(ms盐4.3g/l、ms维他命、干酪素300mg/l、蔗糖5g/l、潮霉素50mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)1mg/l、琼脂8g/l，ph5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(ms分化培养基和ms生根培养基)上培养以再生植物。
[0127]
筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述ms分化培养基(ms盐4.3g/l、ms维他命、干酪素300mg/l、蔗糖30g/l、6-苄基腺嘌呤2mg/l、潮霉素50mg/l、琼脂8g/l，ph5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述ms生根培养基(ms盐2.15g/l、ms维他命、干酪素300mg/l、蔗糖30g/l、吲哚-3-乙酸1mg/l、琼脂8g/l，ph5.8)上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。
[0128]
第六实施例、用taqman验证转基因玉米植株
[0129]
取转入ach1_1植物核苷酸序列的玉米植株的叶片约100mg作为样品，用qiagen的dneasy plant maxi kit提取其基因组dna，通过taqman探针荧光定量pcr方法检测hpt基因的拷贝数以确定ach1_1基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
[0130]
检测hpt基因拷贝数的具体方法如下：
[0131]
步骤11、分别取转入ach1_1核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
[0132]
步骤12、使用qiagen的dneasy plant mini kit提取上述样品的基因组dna，具体方法参考其产品说明书；
[0133]
步骤13、用nanodrop 2000(thermo scientific)测定上述样品的基因组dna浓度；
[0134]
步骤14、调整上述样品的基因组dna浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；
[0135]
步骤15、采用taqman探针荧光定量pcr方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量pcr引物和探针序列分别是：
[0136]
以下引物和探针用来检测hpt核苷酸序列：
[0137]
引物1：cagggtgtcacgttgcaaga如序列表中seq id no:18所示；
[0138]
引物2：ccgctcgtctggctaagatc如序列表中seq id no:19所示；
[0139]
探针1：tgcctgaaaccgaactgcccgctg如序列表中seq id no:20所示；
[0140]
pcr反应体系为：
[0141][0142]
所述50
×
引物/探针混合物包含1mm浓度的每种引物各45μl，100μm浓度的探针50μl和860μl 1
×
te缓冲液，并且在4℃，贮藏在离心管中。
[0143]
pcr反应条件为：
[0144][0145]
利用sds2.3软件(applied biosystems)分析数据。
[0146]
通过分析hpt基因拷贝数的实验结果表明，ach1_1核苷酸序列均已整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入ach1_1核苷酸序列的玉米植株均获得了单拷贝的转基因玉米植株。
[0147]
第七实施例、鉴定转基因玉米植株的抗虫效果
[0148]
将转入ach1_1核苷酸序列的玉米植株、相应的野生型玉米植株，以及经taqman鉴定为非转基因的玉米植株对双斑萤叶甲进行抗虫效果检测。
[0149]
分别取转入ach1_1核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经taqman鉴定为非转基因的玉米植株(v3-v4期)的新鲜叶片(心叶)，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成约1cm
×
2cm的长条状，取1片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的保湿滤纸上，每个培养皿中放10头双斑萤叶甲(幼虫)，虫试培养皿加盖后，在温度24
±
2℃，相对湿度70％-80％、光周期(光/暗)24:0的条件下放置1天不动，从接虫后第2天开始，每2天更换阳性叶片至第10天实验结束，检验是否有显著存活率差异。转入ach1_1核苷酸序列的共3个株系，经taqman鉴定为非转基因的(ngm)共1个株系，
野生型的(ck)共1个株系；从每个株系选5株进行测试，每株重复3次。结果如表2所示。
[0150]
表2、转基因玉米植株接种双斑萤叶甲的抗虫实验结果
[0151][0152]“+”代表有抗虫效果；
“‑”
代表无抗虫效果
[0153]
结果表明，转入ach1_1核苷酸序列的玉米植株对双斑萤叶甲具有良好的致死效果。由此证明ach1_1蛋白不论是在细菌中还是在植物中都显示出对双斑萤叶甲的抗性活性，这种活性足以对双斑萤叶甲的生长产生不良效应从而使其在田间得以控制。同时通过控制双斑萤叶甲为害，也有可能降低转ach1基因植株上病害的发生，极大的提高转ach1基因植株的产量及品质。
[0154]
综上所述，本发明杀虫蛋白的用途通过细菌或植物体内产生能够杀死双斑萤叶甲的ach1蛋白来控制双斑萤叶甲害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法、物理防治方法和生物防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治双斑萤叶甲害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。
[0155]
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种控制双斑萤叶甲害虫的方法，其特征在于，包括将双斑萤叶甲害虫至少与ach1蛋白接触；优选地，所述ach1蛋白存在于至少产生所述ach1蛋白的宿主细胞中，所述双斑萤叶甲害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述ach1蛋白接触；更优选地，所述ach1蛋白存在于至少产生所述ach1蛋白的细菌或转基因植物中，所述双斑萤叶甲害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述ach1蛋白接触，接触后所述双斑萤叶甲害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对双斑萤叶甲危害植物的控制。2.根据权利要求1所述的控制双斑萤叶甲害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物为大豆、小麦、大麦、玉米、烟草、水稻、油菜、棉花或向日葵；优选地，所述转基因植物的组织为根、叶片、茎秆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。3.根据权利要求1或2所述的控制双斑萤叶甲害虫的方法，其特征在于，所述ach1蛋白为ach1_1蛋白、ach1_2蛋白、ach1_3蛋白或ach1_4蛋白；优选地，所述ach1蛋白氨基酸序列具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列；更优选地，所述ach1蛋白在细菌中的核苷酸序列具有seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8所示的核苷酸序列；所述ach1蛋白在转基因植物中的核苷酸序列具有seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11或seq id no:12所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1至3任一项所述的控制双斑萤叶甲害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物还包括至少一种不同于编码所述ach1蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。5.根据权利要求4所述的控制双斑萤叶甲害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸编码cry类杀虫蛋白质、vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶；优选地，所述第二种核苷酸编码cry3bb蛋白；更优选地，所述cry3bb蛋白具有seq id no:13所示的氨基酸序列；进一步优选地，所述第二种核苷酸具有seq id no:14所示的核苷酸序列。6.根据权利要求4所述的控制双斑萤叶甲害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsrna。7.一种ach1蛋白质控制双斑萤叶甲害虫的用途。8.一种产生控制双斑萤叶甲害虫的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组中引入编码ach1蛋白的多核苷酸序列。9.一种产生控制双斑萤叶甲害虫的植物种子的方法，其特征在于，包括将由权利要求8所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码ach1蛋白的多核苷酸序列的种子。10.一种培养控制双斑萤叶甲害虫的植物的方法，其特征在于，包括：种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码ach1蛋白的多核苷酸序列；使所述植物种子长成植株；使所述植株在人工接种双斑萤叶甲害虫和/或双斑萤叶甲害虫自然发生危害的条件下生长，收获与其他不具有编码ach1蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤
和/或具有增加的植物产量的植株。

技术总结
本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，所述杀虫蛋白可用于控制双斑萤叶甲害虫，所述控制双斑萤叶甲害虫的方法包括：将双斑萤叶甲害虫至少与ACh1蛋白接触。本发明通过细菌和/或植物体内产生能够杀死双斑萤叶甲的ACh1蛋白来控制双斑萤叶甲害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法、物理防治和生物防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治双斑萤叶甲害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。经济。经济。


技术研发人员：常藤玉 王秦扬 张爱红 陶青
受保护的技术使用者：北京大北农生物技术有限公司
技术研发日：2022.12.08
技术公布日：2023/7/11