类肠膜魏斯氏菌在发酵肉制品中的应用

1.本发明属于微生物的分离筛选及应用技术领域。具体涉及类肠膜魏斯氏菌在发酵肉制品中的应用。


背景技术：

2.硝酸盐和亚硝酸盐在食品中广泛存在，尤其是在发酵肉制品中。但是，在发酵肉制品的制备过程中，颜色总是逐渐变得暗沉没有光泽，且在发酵过程中硝酸还原菌将硝酸盐转化成亚硝酸盐，导致发酵前期亚硝酸盐大量积累。
3.目前，提升产品色泽主要是通过添加亚硝酸盐，尽管已有部分研究能够减少或使用红苋菜粉或某些微生物等替代亚硝酸盐的添加，但仍存在色泽品质低、口味欠佳、保质期短、亚硝酸盐的残留过多等缺陷。因此，研发一种能够完全替代亚硝酸盐的添加，且可有效保持肉制品色泽、风味的制备工艺是非常有必要的。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.为解决背景技术中的问题，本发明提供了类肠膜魏斯氏菌在发酵肉制品中的应用。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：类肠膜魏斯氏菌在发酵肉制品中的应用，该类肠膜魏斯氏菌为类肠膜魏斯氏菌（weissella paramesenteroides）sl7，于2022年08月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:62429。
7.优选的，所述类肠膜魏斯氏菌sl7制备为发酵剂后对肉制品发酵，代替亚硝酸盐在肉制品中实现发色作用。
8.优选的，所述类肠膜魏斯氏菌制备发酵剂的方法包含：将类肠膜魏斯氏菌sl7接入mrs肉汤培养基，35~37℃培养18~24h，得到发酵液；将发酵液于3~5℃、4500~5500 r/min条件离心6-8 min，弃去上清液，得到菌体；以及向菌体中加入冻干保护剂进行冷冻干燥得到发酵剂。
9.优选的，经冷冻干燥得到的发酵剂的菌体密度在1.0
×
10
10
~6.0
×
10
10
cfu/g。
10.优选的，以菌体体积计，所述冻干保护剂包含脱脂奶粉10~15%、蔗糖1~2%。
11.优选的，所述类肠膜魏斯氏菌sl7在发酵肉制品中接种量为2~5%。
12.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的类肠膜魏斯氏菌发酵剂，可作为发酵剂替代亚硝酸盐应用于发酵肉制品中，提升产品色泽，达到发色、护色效果，提高产品品质。本发明提供的类肠膜魏斯氏菌发酵剂具有天然安全、不添加亚硝酸盐、且色泽漂亮、风味浓郁等优点，在食品中具有广阔的应用前景。
附图说明
13.图1为类肠膜魏斯氏菌sl7的16srrna序列构建的系统发育树；图2为类肠膜魏斯氏菌sl7在含高铁肌红蛋白的mrs液体培养基中培养20h后紫外扫描图；图3为类肠膜魏斯氏菌sl7在含高铁肌红蛋白的mrs液体培养基中培养20h内的高铁肌红蛋白含量变化；图4为类肠膜魏斯氏菌sl7在含高铁肌红蛋白的mrs液体培养基中培养20h的透射色度值；图5为类肠膜魏斯氏菌sl7的生长曲线与ph变化；图6为类肠膜魏斯氏菌sl7在不同nacl浓度下的生长情况；图7为发酵香肠色度值测定；图8为发酵香肠加工过程中ph值变化情况。
具体实施方式
14.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
15.实施例1菌株的分离筛选、鉴定1.1菌株的分离、筛选本发明所需菌种从四川腊肉中分离所得，在无菌条件下，取腊肉内部组分25g，剪碎，放入无菌均质袋中，加入225ml无菌生理盐水，于拍打式均质器中拍打3min；作10倍梯度稀释，共有10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
七个浓度，取200微升样品涂布于含有1.5%碳酸钙的mrs培养基上，每个浓度做3个重复，静置30min后于37℃条件下倒置培养48h。
16.将具有明显溶钙圈的菌落接种于mrs培养基，划线纯化直到出现单菌落且整个平板和镜下观察菌落形态一致，然后测定菌株的生理生化指标；挑取革兰氏阳性、不产h2s、发酵葡萄糖不产气、不产黏液和肌红蛋白阳性菌株，筛选得到的菌株于-4℃条件下进行斜面保存备用。
17.2）对亚硝酸盐具有降解作用的菌株筛选将上述分离到的菌株按1%接种于含150ug/mlnano2，ph6.0的mrs肉汤培养基中，35℃培养24h后，检测培养基中的nano2含量，用亚硝酸盐降解率来表示菌株降解亚硝酸盐的能力。
18.含碳酸钙的mrs培养基上乳酸菌的形态特征：乳白色菌落，大小、形状各异，温润，有溶钙圈，有透明圈。从mrs碳酸钙培养基的菌株中挑选出12株菌透明圈较大的形态不同的典型菌落，并纯化菌株，直到出现单菌落且整个平板和镜下观察菌落形态一致，再把所有菌株转接斜面-4℃保存，同时用甘油保存法封存备用。依据gb5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》进行测定结果表明其中降解亚硝酸盐效果最好的是菌株sl7，降解率达到98%，显著高于其他菌株，所以，筛选出菌株sl7作为优良菌株。
19.1.2 菌株的分子学鉴定细菌基因组dna提取：用 tsingke 植物 dna 提取试剂盒（通用型）提取细菌dna；提取产物经过pcr扩增，扩增体系：1
×
tse101 金牌 mix 45ul，27 f 2ul，1492 r 2 l，template 1ul；pcr扩增反应条件：98℃ 4min预变性；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，38个循环；72℃修复延伸10min，4℃终止。
20.pcr产物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行测序，测序结果与genbank基因数据库中16sr dna序列进行同源性比较分析，鉴定微生物种类。由此鉴定出菌株sl7为weissella paramesenteroides，该菌株的氨基酸序列如seq id no：1所示。该菌株的16rrna序列构建的系统发育树如图1所示。
21.将菌株类肠膜魏斯氏菌（weissella paramesenteroides）sl7于2022年08月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:62429。
22.实施例2 类肠膜魏斯氏菌转化高铁肌红蛋白试验将类肠膜魏斯氏菌sl7接种于含有高铁肌红蛋白的mrs液体培养基中，表面加一层石蜡油，恒温35℃培养18~20h，取培养液离心(10000
×
g、5min、4℃)，取上清液待测，以未接种类肠膜魏斯氏菌sl7含有高铁血红蛋白的mrs培养基为空白对照组。
23.（1）光谱学分析：肌红蛋白的颜色主要取决于血红素铁原子第六个配位基的结合状态，而第六个配位基的不同，对应的不同肌红蛋白衍生物在各个波长处的吸光度值也不同，因此可以通过测定高铁肌红蛋白溶液的特征吸收峰，分析菌株对高铁肌红蛋白的含量以及转化过程。
24.分别取上述类肠膜魏斯氏菌sl7离心所得上清液和对照组样品使用uv-1800 型紫外可见分分光光度计于400-700nm波长范围内进行紫外可见光谱扫描，结果如图2。
25.（2）高铁肌红蛋白含量测定：分别取上述类肠膜魏斯氏菌sl7离心所得上清液和对照组样品，通过722-s 型可见分光光度计分别在525 nm、545 nm、565 nm 以及 572 nm 波长处测其吸光值，计算公式如下：高铁肌红蛋白（met-mb）%=（-2.541r1+0.777r2+0.800r3+1.098）
×
100式中r1、r2、r3分别a
572nm
/a
525nm
、a
565nm
/a
525nm
与a
545nm
/a
525nm
进行计算。
26.结果重复3次取平均值，结果如图3。
27.（3）培养液的透射色度值测定：分别取上述类肠膜魏斯氏菌sl7离心所得上清液和对照组样品与石英比色皿中，使用cr-400 型色差仪测定l*、a*值，结果如图4。
28.结果分析：由图2可知，类肠膜魏斯氏菌sl7离心所得的上清液于 421 nm、540 nm、和 579 nm处出现了吸收峰，这是亚硝基肌红蛋白的典型吸收峰；而对照组峰值出现在了 410nm、505nm和634 nm，这是高铁肌红蛋白的典型吸收峰。推断类肠膜魏斯氏菌sl7具有将高铁肌红蛋白转化成脱氧肌红蛋白的能力，亚硝酸盐分解产生的no会与肌红蛋白结合形成了亚硝基肌红蛋白，而对照组未出现这种情况。
29.由图3可以看出，类肠膜魏斯氏菌sl7在含高铁肌红蛋白的mrs液体培养基中培养20h内的高铁肌红蛋白含量变化，类肠膜魏斯氏菌sl7培养液中高铁肌红蛋白的含量相比对照组显著降低，在第20h降低至33.27%，对照组中在第20h时高铁肌红蛋白含量为70.95%。
30.由图4可以看出，sl7组在20h后a*值为29.76，显著高于对照组12.83；并且在试验过程中肉眼观察到，接种了类肠膜魏斯氏菌sl7含有高铁肌红蛋白的培养基在5~20h内逐渐由棕红色转为鲜红色，而未接种sl7菌株的培养基在20h内维持原本的棕红色。
31.实施例3肠膜魏斯氏菌生物性能试验（1）菌株生长曲线以及产酸测定将活化18h的类肠膜魏斯氏菌sl7株按照1%接种于mrs液体培养基中，35℃，150r/min的摇床培养。在培养时间为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、28、32h取适量菌液并稀释到适宜倍数，测od
600
吸光值以及ph值，结果如图5。
32.（2）菌株对食盐的耐受性曲线将活化18h的类肠膜魏斯氏菌sl7按照1%接种于含有0.0%、5.0%、7.0%、9.0%、11.0%的mrs试管培养基，35℃下培养24h，测定菌体od
600
，结果如图6。
33.结果分析：由图5可知，类肠膜魏斯氏菌sl7在8-18小时属于菌株生长的对数期，此期间od
600
值由0.578增长到1.119，18小时以后属于菌株生长的稳定期，od
600
值保持在1.100~1.200。由此看出菌株在mrs液体培养基中生长速率较快。同时，类肠膜魏斯氏菌sl7在4h后产酸比较快，ph大幅下降，第18h时ph已经降到了3.39，此后逐渐稳定，最后稳定在3.33左右。
34.由图6可以看出sl7菌株在7.0%~11.0%的高盐浓度范围内有较好的生长效果，在7.0%盐浓度下od
600
值最高，为0.9873；在11%高盐浓度下od
600
值仍有0.7748，说明类肠膜魏斯氏菌sl7有强耐盐能力，在某些高盐浓度的食品加工中更具有优势。
35.实施例4类肠膜魏斯氏菌sl7在制备香肠中的应用（实验组）（1）冻干发酵剂制备：将类肠膜魏斯氏菌按1%接入mrs肉汤培养基，35~37℃培养18h，得到发酵液；将发酵液于4℃、5500r/min无菌条件下离心8min，弃去上清液，得到菌体；向离心所得菌体中加入冻干保护剂进行冷冻干燥得到发酵剂。冻干保护剂以菌体体积计，加入15%脱脂奶粉、1%蔗糖；（2）原料肉处理：将新鲜猪后腿去皮，清洗并沥干表面水分，绞肉机绞碎，称取以肥肉30份和70份；（3）辅料腌制：称取辅料绵白糖2份、食盐3分、十三香1.5份、辣椒粉1.5份、花椒粉1份、味精2.5份，与处理好的肉混合滚揉10min，充分混匀，4℃腌制8h；（4）接种发酵剂：取上述制备好的冻干粉，配制菌悬液使活菌数为1
×
108cfu/ml；以肉质量计，类肠膜魏斯氏菌发酵剂在香肠的接种量为3%；（5）灌肠：灌前用沸水洗涤灌肠设备，将步骤中处理好的肉灌入肠衣，灌好后用棉线系紧，用针排气；（6）发酵：发酵温度37℃，发酵湿度85%，30h；（7）烘烤：温度设为35℃，相对湿度45%，烘烤6h；（8）成熟风干：香肠在白天12℃，晚上8℃条件下交替进行风干，风速1m/s，相对湿度70%，风干4d；（9）成熟后产品进行真空包装，得到成品，于4℃储藏。
36.实施例5类肠膜魏斯氏菌sl7在制备香肠中的应用（1）冻干发酵剂制备：将植类肠膜魏斯氏菌sl7按1%接入mrs肉汤培养基，35℃培养
18h，得到发酵液；将发酵液于4℃、5500 r/min无菌条件下离心8 min，弃去上清液，得到菌体；l向离心所得菌体中加入冻干保护剂进行冷冻干燥得到发酵剂。冻干保护剂以菌体体积计，加入12%脱脂奶粉、1.5%蔗糖；（2）原料肉处理：将新鲜猪后腿去皮，清洗并沥干表面水分，绞肉机绞碎，称取以肥肉250g份和750g；（3）辅料腌制：称取辅料绵白糖25g份、食盐30g、十三香15g、辣椒粉15g、花椒粉10g、味精20g，与处理好的肉混合滚揉10min，充分混匀，4℃腌制8h；（4）接种发酵剂：取上述制备好的冻干粉，配制菌悬液使活菌数为1
×
108cfu/ml；以肉质量计，类肠膜魏斯氏菌发酵剂在香肠的接种量为4%；（5）灌肠：灌前用沸水洗涤灌肠设备，将步骤中处理好的肉灌入肠衣，灌好后用棉线系紧，用针排气；（6）发酵：发酵温度37℃，发酵湿度85%，30h；（7）烘烤：温度设为35℃，相对湿度45%，烘烤6h；（8）成熟风干：香肠在白天12℃，晚上8℃条件下交替进行风干，风速1m/s，相对湿度70%，风干4d；（9）成熟后产品进行真空包装，得到成品，于4℃储藏。
37.对比例1 无发酵剂制备香肠（对比例1组）不接种发酵剂，将实施例4中步骤（4）中菌悬液改为添加等体积无菌生理盐水，其余步骤等同于实施例4。
38.对比例2 不接种类肠膜魏斯氏菌、添加亚硝酸盐制备香肠（对比例2组）不接种发酵剂，将实施例4中步骤（4）中菌悬液改为添加等体积无菌生理盐水，步骤2中辅料增加0.015%亚硝酸盐，其余步骤等同于实施例4。
39.对比例3 （对比例3组）与实施例4相比，将类肠膜魏斯氏菌sl7替换为等量的中国专利cn114456979a实施例中的类肠膜魏斯氏菌cgmcc no .22238（购于中国微生物菌种保藏中心），类肠膜魏斯氏菌（cgmcc no .22238）活菌数为1
×
108cfu/g，其余步骤等同于实施例4。
40.对以上实施例4、对比例1、对比例2和对比例3进行了色度值测定、ph测定、挥发性盐基氮、过氧化值、亚硝酸盐含量以及挥发性香气物质及相对含量的测定。
41.使用cr-400色差仪对香肠肉样测定色差，结果如图7。如图7所示，实验组亮度值l*为43.07、红度值a*为17.27，显著高于对比例1、对比例2和对比例3组，对比例1组的亮度值l*为21.46、红度值a*为5.58，均为最低，肉色暗沉；而对比例3组添加类肠膜魏斯氏菌（cgmcc no .22238）制备的香肠亮度值l*为28.79、红度值a*为8.28，稍高于对比例1，但不及对比例2中添加亚硝酸盐的效果，说明无法使用对比例3的方式来替代亚硝酸盐发酵香肠。实验组类肠膜魏斯氏菌sl7发酵赋予了香肠特征性的玫瑰红色，光泽度较好，具有较好的市场价值，也说明了类肠膜魏斯氏菌sl7是具有良好发色、护色效果的发酵剂。
42.使用插入式ph计测定样品ph，结果如图8。如图8所示，发酵前期实验组ph值迅速下降，在第2d时ph降至4.450，且在整个加工过程中实验组的ph值显著低于其他组，这是由于类肠膜魏斯氏菌sl7具有强产酸能力，使得香肠ph迅速下降，赋予香肠特征性的酸香味；同时低ph抑制了香肠致病菌和腐败微生物的生长繁殖，延长了香肠保质期。
43.挥发性盐基氮依据gb 5009.228-2016 《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定，过氧化值依据gb 5009.181-2016《食品中丙二醛的测定》进行测定，亚硝酸盐含量依据gb5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》进行测定，结果取平均值，结果如表1。
44.表1 发酵香肠成品挥发性盐基氮、过氧化值、亚硝酸盐含量的测定。
45.注：数据为均值
±
标准差由表1可知实验组的过氧化值和亚硝酸盐残留量分别为4.29mg/100g、2.15mg/kg，显著低于对比例1、对比例2、对比例3组，且根据国家亚硝酸盐残留量低于30mg/kg的标准，对比例2组香肠中亚硝酸盐残留量为31.81mg/kg已然超标。
46.使用gcms方法测定挥发性香气物质成分种类和数量对比，结果如表2。如表2所示，实验组添加类肠膜魏斯氏菌sl7产生了38种风味物质，显著提高了香肠中酸类和酯类物质的含量，使得发酵香肠干腌风味浓郁，具有诱人的芳香味道，大大提高了发酵香肠的风味。
47.表2 成品香肠挥发性香气物质成分种类和数量对比 单位：种。
48.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.类肠膜魏斯氏菌在发酵肉制品中的应用，其特征在于，该类肠膜魏斯氏菌为类肠膜魏斯氏菌（weissella paramesenteroides）sl7，于2022年08月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:62429。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述类肠膜魏斯氏菌sl7制备为发酵剂后对肉制品发酵，代替亚硝酸盐在肉制品中实现发色作用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述类肠膜魏斯氏菌制备发酵剂的方法包含：将类肠膜魏斯氏菌sl7接入mrs肉汤培养基，35~37℃培养18~24h，得到发酵液；将发酵液于3~5℃、4500~5500 r/min条件离心6-8 min，弃去上清液，得到菌体；以及向菌体中加入冻干保护剂进行冷冻干燥得到发酵剂。4.如权利要求4所述的应用，其特征在于，经冷冻干燥得到的发酵剂的菌体密度在1.0
×
10
10
~6.0
×
10
10
cfu/g。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，以菌体体积计，所述冻干保护剂包含脱脂奶粉10~15%、蔗糖1~2%。6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在在于，所述类肠膜魏斯氏菌sl7在发酵肉制品中接种量为2~5%。

技术总结
本发明属于微生物的分离筛选及应用技术领域。公开了类肠膜魏斯氏菌在发酵肉制品中的应用，该类肠膜魏斯氏菌为类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）SL7，于2022年08月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62429。本发明提供的类肠膜魏斯氏菌，可作为发酵剂替代亚硝酸盐应用于发酵肉制品等食品中，提升产品色泽，达到发色、护色效果，提高了食用安全性，使产品具有天然安全、不添加亚硝酸盐、且色泽漂亮、风味浓郁等优点。点。点。


技术研发人员：张崟 钱琴 贾溅琳 张鹏程 陈秋月 王林果 彭海川 曾庆 张应杰
受保护的技术使用者：成都大学
技术研发日：2022.09.15
技术公布日：2023/7/11