CD24的应用的制作方法

cd24的应用
技术领域
1.本发明涉及分子医学技术领域，尤其涉及cd24的应用。


背景技术：

2.多囊卵巢综合症(pcos)是育龄女性最常见的生殖内分泌疾病之一，各国报道的育龄女性患病率在5％-20％之间，pcos是一种复杂的异质性内分泌疾病，其会影响身体多个系统，主要表现有月经周期紊乱、多毛、痤疮、肥胖和代谢综合症等。目前，其诊断标准主要包括：雄激素过多的临床或生化指标、稀发排卵或无排卵以及卵巢多囊样改变。pcos被认为是引起无排卵性不孕的主要原因，大多数女性直到难以怀孕时才诊断出pcos。患有pcos的女性更常借助辅助生殖技术助孕，由于pcos患者卵巢功能异常，行ivf-et助孕时卵子受精率和胚胎发育潜能等指标比排卵正常的患者要显著降低。
3.卵母细胞质量是女性生育能力的核心，卵母细胞发育能力是现代辅助生殖技术实践中的关键因素。卵母细胞成熟和排卵涉及多个相互交织的细胞调控和内分泌过程，卵丘颗粒细胞在卵泡发育、卵母细胞成熟和性激素分泌中有很重要的作用；在原始卵泡中，卵母细胞与前颗粒细胞直接相邻；在卵泡生长发育形成透明带后，颗粒细胞的胞膜突起可穿过透明带与卵子的胞膜形成缝隙连接，介导促性腺激素及自身功能，并且分泌因子进入卵泡液，对卵泡的形成和发育、卵母细胞的营养和成熟起重要作用，另一方面，卵母细胞通过分泌cdf9和bmp15等因子诱导颗粒细胞层形成卵泡腔并调控颗粒细胞增殖分化。在卵泡中，卵母细胞与其周围的颗粒细胞之间形成的双向通讯和相互影响在卵母细胞的协调生长和卵泡发育中起到重要作用。
4.cd24作为一种重要的信号分子，通过募集src家族蛋白酪氨酸激酶或与egfr结合来介导信号转导。已知egfr通路的急性上调是排卵级联的一个重要组成部分，因为它将黄体生成素(lh)信号从卵泡周围传递到卵丘-卵母细胞复合体。cd24通过抑制egfr在癌细胞中的内化和降解来调节egfr信号。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供cd24的应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
7.本发明的第一方面是提供检测cd24表达水平的制剂在制备诊断多囊卵巢综合症试剂盒中的应用。
8.优选地，检测所述cd24表达水平的制剂为检测卵丘颗粒细胞中所述cd24表达水平的制剂。
9.优选地，所述cd24为cd24基因，所述cd24基因的核苷酸序列如seq id no：1(agtttgcagcgtcaggcagcgggtctgcgcccagcgagcggctccccagctcctgggaagatgcggacccgggacgcccccgtgagctcactgcgcctggctgacacgaggcgctcacagaacaaagcaagggcttcggggagggcgcggccgcggggccgagcgcgcagatcgctccggacccggacaccgcctgcgaggagcgccgaccagccgggaagggttcgcgctaggc
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37.taacttcttatggaattgatttgcattgaacacaaactgtaaataaaaag
38.aaatggctgaaagagcaa)所示。
corona-cumulus complex，occc)置于透明质酸酶的液滴中，盖油，37℃边消化边用吸管反复吹打，直至卵丘颗粒细胞团消散为单个细胞；收集所有卵子外周卵丘颗粒细胞，所得的卵丘颗粒细胞用颗粒细胞培养基(含10％ fbs的dmem/f12培养基)于培养皿中洗涤2次，然后用3ml颗粒细胞培养基接种于35mm培养皿中，置于37℃、6％co2培养箱中培养，24h后全量换液1次，光学显微镜观察卵丘颗粒细胞形态，培养48h，待测。
58.二、间接免疫荧光染色法检测颗粒细胞上cd24蛋白的定位及表达
59.(1)收集：从胚胎实验室收集当天行icsi拆卵后留下的卵丘颗粒细胞；
60.(2)固定：将适量4％多聚甲醛加入35mm培养皿，并将卵丘颗粒细胞转入多聚甲醛固定20min；
61.(3)pbs泡3次，5min/次；
62.(4)细胞通透：用终浓度为0.3％的triton(溶于pbs)通透细胞，约室温半小时；
63.(5)洗去通透液：pbs泡3次，5min/次；
64.(6)封闭：小心吸尽pbs液，滴加(二抗同源-羊)封闭血清，覆盖标本表面，在湿盒中于常温下放置30min；
65.(7)吸尽血清，勿用水冲，滴加一抗(兔抗人cd24抗体，稀释浓度1：100)，覆盖标本表面，湿盒放4℃冰箱过夜；
66.(8)复温：将湿盒取出，室温下放30min，待温度恢复至室温后进行后续操作；
67.(9)洗去一抗：pbs泡3次，5min/次；
68.(10)小心吸尽pbs液，滴加二抗(cy3标记山羊抗兔igg(h+l)，二抗稀释浓度1：50)，覆盖标本表面，湿盒于37℃放置30min；
69.(11)洗去二抗：pbs泡3次，5min/次；
70.(12)染核(dapi)：爬片置于pbs(ph＝7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；切片稍甩干后在圈内滴加dapi染液，避光室温孵育10min；
71.(13)洗去染核液：pbs泡3次，5min/次；
72.(14)封片及检测：爬片置于pbs(ph＝7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；
73.(15)观察：切片于荧光显微镜下观察并采集图像；(dapi紫外激发波长330nm-380nm，发射波长420nm，发蓝光；cy3激发波长510nm-560nm，发射波长590nm，发红光)。
74.三、采用real-time荧光定量pcr方法检测颗粒细胞cd24基因表达
75.(1)提取卵丘颗粒细胞总rna
76.将所试验的标本按序排放在管架，室温待解冻；取细胞悬液转移至新的离心管中，加入适量的trizol(预冷)，室温静置5分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，小心吸取上清液于另一离心管，各管加入200ml氯仿，激烈振荡15秒，混匀后室温静置5分钟，4℃，12000rpm离心10分钟；小心吸出水层加入依次编号的eppendorf管中，再加入二倍体积的异丙醇(约600μl)，充分混匀后置于-20℃冰箱，30分钟；然后4℃，10000rpm离心10分钟，rna形成白色的小团沉淀在离心管的底部和侧面，弃上清留沉淀，加入75％的乙醇650ml洗涤沉淀，4℃，8000rpm离心5分钟，弃上清留沉淀，漂洗2-3次rna沉淀；最后，在无菌工作台中干燥rna沉淀5-10分钟，加入20ml depc处理水，55℃-60℃温育10分钟使rna充分溶解，取少许溶解的rna，用te buffer稀释后于紫外分光光度计260nm和280nm处读取a值，60/a280当比值为
1.8-2.0间方可使用，总rna浓度＝a260
×
稀释倍数
×
0.04(μg/μl)，用前调整为lμg/μl。
77.(2)逆转录cdna
78.将经过稀释后的rna样本进行rt，加入rt反应体系(5
×
逆转录buffer，dntps，oligo dt primer，逆转录酶mmlv，rna模板等)管中，并用depc处理水补足到20μl反应液体积，震荡混匀后短暂离心10000r/min，数秒，加少许矿物油于pcr仪37℃1h(cdna合成)，95℃5min(逆转录酶失活)，5℃5min；-20℃保存备用。
79.反应体系如下：
[0080]5×
逆转录buffer4μldntps0.5μloligo dt primer0.5μl逆转录酶mmlv1μldepc处理水10μlrna模板4μl总体积20μl
[0081]
(3)real-time pcr反应
[0082]
反应设立内参照gapdh作为cd24基因相对表达量，以消除rna制备及逆转录过程中造成的误差。反应所用引物序列如下：
[0083][0084]
具体操作步骤如下：
[0085]
real-time pcr反应体系：
[0086]
将制备好的cdna进行pcr扩增，扩增体系如下:
[0087]
sybrgreen mix32.5μl上游引物f0.5μl下游引物r0.5μlddh2o水14.5μlcdna模板2μl总体积50μl
[0088]
real-time pcr反应条件：cd24：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火45s，共40个循环；72℃总延伸6min；
[0089]
pcr反应后，在60℃-95℃进行溶解曲线分析：95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s，60℃，15s。
[0090]
(4)数据分析
[0091]
数据采用仪器自带软件分析(abi prism 7500sds software)；由real-time pcr产物的动态积累量，得到各管标本的扩增曲线及目的序列的ct值，同时检测该管标本管家基因gapdh的ct值，计算出各管标本待测序列的
△
ct值(
△
ct＝目的基因ct值-该管样品gapdh的ct值)，获得目的基因的相对表达量为2-δδct值进行比较分析。
[0092]
四、结论
[0093]
pcos组镜下卵丘颗粒细胞中cd24的表达较正常对照组更显著(图1)，pcos组卵丘颗粒细胞cd24平均荧光强度较正常对照组更高(图2)；rt-pcr检测pcos组卵丘颗粒细胞相对表达水平高于对照组(图3)；cd24在pcos组呈高表达，表明cd24与pcos发病相关；
[0094]
卵丘颗粒细胞cd24 mrna表达与bmi(图4a)、血清amh(图4b)水平之间具有显著正相关性(bmi：r＝0.646，p＝0.005；amh：r＝0.577，p＝0.015)；
[0095][0096][0097]
注：*p《0.05
[0098]
2pn形成率＝2pn/获卵总数
[0099]
可移植胚胎率＝可移植胚胎数/所有卵裂数
[0100]
优质胚胎率＝优质胚胎数/来自2pn的卵裂数
[0101]
卵丘颗粒细胞cd24 mrna表达虽与获卵数(图5a)、2pn数(图5b)、可移植胚胎数(图5c)、优质胚胎数(图5d)和卵裂数(图5e)之间呈显著正相关(获卵数：r＝0.834，p《0.001；2pn数：r＝0.693，p＝0.002；可移植胚胎数：r＝0.576，p＝0.012；优质胚胎数：r＝0.563，p＝0.011；卵裂数：r＝0.667，p＝0.003)，但与2pn形成率、可移植胚胎率以及优质胚胎率无明显相关性。
[0102]
综上所述，本发明探索了cd24在pcos患者及非pcos不孕患者卵丘颗粒细胞的表达，cd24在pcos不孕患者卵丘颗粒细胞中呈高表达，与pcos发病相关；cd24表达水平与获卵数、2pn数、可移植胚胎数、优质胚胎数、卵裂数呈明显正相关，揭示了卵丘颗粒细胞cd24能调控卵泡生长及胚胎发育，临床妊娠组中颗粒细胞cd24呈高表达，揭示了卵丘颗粒细胞cd24对临床妊娠结局有预测价值。
[0103]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范
围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.检测cd24表达水平的制剂在制备诊断多囊卵巢综合症试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测所述cd24表达水平的制剂为检测卵丘颗粒细胞中所述cd24表达水平的制剂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述cd24为cd24基因，所述cd24基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：用于检测所述cd24基因的引物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no：2-3所示。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述cd24为cd24蛋白。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：用于结合所述cd24蛋白的抗体，以及用于显色所述抗体的标记。8.检测cd24表达水平的制剂在制备诊断卵母细胞质量试剂盒中的应用。

技术总结
本发明涉及CD24的应用；提供检测CD24表达水平的制剂在制备诊断多囊卵巢综合症(PCOS)试剂盒中的应用；本发明探索了CD24在PCOS患者及非PCOS不孕患者卵丘颗粒细胞的表达，CD24在PCOS不孕患者卵丘颗粒细胞中呈高表达，与PCOS发病相关；CD24表达水平与获卵数、2PN数、可移植胚胎数、优质胚胎数、卵裂数呈明显正相关，揭示了卵丘颗粒细胞CD24能调控卵泡生长及胚胎发育，临床妊娠组中颗粒细胞CD24呈高表达，揭示了卵丘颗粒细胞CD24对临床妊娠结局有预测价值。价值。价值。


技术研发人员：王炎秋 陈其臻 焦雨帆 傅夏燕 郭莎娜 刘萍
受保护的技术使用者：上海市同济医院
技术研发日：2022.10.27
技术公布日：2023/7/11