一种抗BCMA的纳米抗体及其制备方法和应用

chain-only antibodies)。vhh结构呈橄榄球状，直径约2.5nm，高约4.0nm，由于其结构和分子量较小(15kda)，因此，也被称作纳米抗体(nb,nanobody)，nb被认为是目前发现的最小的具有结合完整抗原功能的抗体分子。与其他小分子基因工程抗体相比，纳米抗体由于具有良好的稳定性、可溶性、亲和力、特异性以及与不同蛋白分子偶联的灵活性和易改造等特点，受到各领域的高度关注。目前，纳米抗体的应用主要集中在疾病治疗、疾病与医学诊断、科学研究等。人源化纳米抗体alx-0081(caplacizumab)作为第一种纳米抗体药物已于2018年正式上市，用于获得性血小板减少性紫癜疾病的治疗。
6.嵌合抗原受体t细胞(car-t,chimeric antigen receptor-t cell)是一类经过基因修饰的能够不依赖于mhc分子特异性识别特定抗原，且持续活化增殖并特异杀伤肿瘤细胞的t细胞。car由cd8信号肽、抗原识别区(单链抗体或纳米抗体或配体或fab段)、跨膜区以及t细胞的一系列信号转导区依次串联而成。利用慢病毒载体或者逆转录病毒载体与包装质粒和辅助质粒共转染哺乳动物细胞生产获得含有car的病毒颗粒，该颗粒再次感染原代t细胞使其能够稳定表达car，最终形成car-t细胞，将该细胞再回输至患者体内，经过修饰后的t细胞具有特异性识别和杀伤表达相关抗原肿瘤细胞的作用，达到清除肿瘤细胞的目的。
7.但是由于个体化car-t细胞的制备成本高、制备周期长以及某些病人其t细胞很难获得且在体外不易扩增等因素使得car-t在临床应用中受到极大的限制。
8.基于此，通用型car-t技术(同种异体car-t细胞)的应用将在很大程度上解决上述问题。利用现有的基因编辑技术对健康供者来源的t细胞中tcr以及其他介导个体间免疫原性的基因进行敲除，从而减少移植物抗宿主反应(gvhd,graft versus-host disease)和宿主抗移植物反应(hvgr,host versus-graft reaction)，进而实现car-t细胞治疗的产业化并降低成本。2022年5月12日，caribou biosciences宣布，其开发的基于crispr基因编辑的现货型car-t疗法cb-010，在治疗复发难治性b细胞非霍奇金淋巴瘤的1期临床试验中效果积极。公布的数据显示，可评估的5名患者中，总缓解率(orr)达100％，完全缓解率(cr)达80％。截至目前，完全缓解的4名患者中，治疗后三个月仍然如此，最长的完全缓解记录为六个月。
9.目前，fda已批准上市的靶向bcma的car-t疗法有abecma(ide-cel)和carvykti，其用于既往接受4线治疗或多线治疗(包括3类药物：免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂、抗cd38抗体)的rrmm成人患者。另外，目前全球共有约46项靶向bcma的car-t药物处于临床期或临床前期，表明bcma在mm药物发现和开发中具有广阔前景。但是，在bcma-cart临床治疗mm患者时面临高复发问题，复发的可能原因是bcma靶点的下调或丢失。另外，对临床病例分析表明mm患者的恶性浆细胞中cd47的表达率约100％。
10.因此，开发一种同时靶向bcma和cd47的双特异性通用型嵌合抗原受体不仅能够有效避免靶点逃逸的问题而且可以显著改善治疗效果，将为临床实验和临床治疗奠定良好的基础，但目前未有相关报道。


技术实现要素：

11.本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种用于多发性骨髓瘤治疗的通用型嵌合抗原受体及其应用。
12.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种用于多发性骨髓瘤治疗的通用
no.7；所述柔性linker(g4s)3编码区的编码序列为seq id no.18；所述刚性linker(eaaak)3编码区的编码序列为seq id no.19。
30.本发明还提供一种重组蛋白及其药物组合，包含抗bcma的纳米抗体(nb)和抗bcma的人源化纳米抗体(hunb)中任意一项重组蛋白用于相关疾病诊断或与活性剂联合使用，所述活性剂为免疫检查点相关制剂和/或双(多)特异性抗体和/或抗体偶联药和/或放射性核素和/或激酶抑制剂。
31.进一步地，所述嵌合抗原受体的表达载体选自慢病毒载体。
32.本发明还提供一种重组慢病毒，将上述的慢病毒载体与包装质粒和包膜质粒共转哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。
33.进一步地，所述哺乳动物细胞为hek293细胞、hek293t细胞或者hek293f细胞中的任意一种或者至少两种的组合。
34.本发明还提供一种用于敲除t细胞中trac基因的sgrna，以tcr基因的α链恒定区设计获得；所述trac基因的两条sgrna的序列分别为seq id no.20-21。
35.本发明还提供一种用于敲除t细胞中b2m基因的sgrna，以b2m基因的功能域设计获得；所述b2m基因的两条sgrna的序列分别为seq id no.22-23。
36.本发明还提供所述的纳米抗体序列、cd47分子天然配体sirpα胞外区n端v区(sirpαv)序列、重组融合蛋白、嵌合抗原受体、宿主细胞等在制备活化的t细胞中、免疫细胞或在肿瘤治疗药物中的应用。
37.所述药物用于治疗肿瘤，包括血液瘤和实体瘤，所述血液瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病、b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种；所述实体瘤包括骨肉瘤、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈癌中的至少一种。优选肿瘤为多发性骨髓瘤。
38.以下为本发明的上述涉及的序列：
39.seq id no.1
40.qvqlqesgggsvqaggslrlsctasgysdsnycmawfrqapgkarqgvafingdgvitytdsvkgrftiskdnaqktldlqmnslkpedtamyycaaltagcvryaawgqgtqvtvss
41.seq id no.2
42.qvqlqesgggsvqaggslrlscaasgytysnycmawfrqapgklrqgvafidsdgtttyadsvkgrftisrdnakntlslqmntlkpedtamyycaalrsdcsggyrgvgqgtqvtvss
43.seq id no.3
44.qvqlqesgggsvqgggslrlsctasgfniddsdmgwfrqapgdacklvshinsdgatynadsvkgrftisrdsakntvylkmnslkpedtavyychpvynlglidppacsgqgtqvtvss
45.seq id no.4
46.evqlvesgggsvqaggslrlsctasgysdsnycmawfrqapgkgrqgvafingdgvitytdsvkgrftiskdnaqktldlqmnslraedtamyycaaltagcvryaawgqgtlvtvss
47.seq id no.5
48.evqlvesgggsvqaggslrlscaasgytysnycmawfrqapgkgrqgvafidsdgtttyadsvkgrftisrdnakntlslqmntlraedtamyycaalrsdcsggyrgvgqgtlvtvss
49.seq id no.6
50.evqlvesgggsvqgggslrlsctasgfniddsdmgwfrqapgdgcklvshinsdgatynadsvkgrfti
srdsakntvylkmnslraedtavyychpvynlglidppacsgqgtlvtvss
51.seq id no.7
52.eeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrak
53.seq id no.8
54.diklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk
55.seq id no.9
56.malpvtalllplalllhaarpfeevqlvesgggsvqaggslrlscaasgytysnycmawfrqapgkgrqgvafidsdgtttyadsvkgrftisrdnakntlslqmntlraedtamyycaalrsdcsggyrgvgqgtlvtvssgttttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdrrppskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelaslrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
57.seq id no.10
58.malpvtalllplalllhaarpfeeeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakgttttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdrrppskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelaslrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
59.seq id no.11
60.malpvtalllplalllhaarpfeevqlvesgggsvqaggslrlscaasgytysnycmawfrqapgkgrqgvafidsdgtttyadsvkgrftisrdnakntlslqmntlraedtamyycaalrsdcsggyrgvgqgtlvtvssggggsggggsggggseeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakgttttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdrrppskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelaslrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
61.seq id no.12
62.malpvtalllplalllhaarpfeevqlvesgggsvqaggslrlscaasgytysnycmawfrqapgkgrqgvafidsdgtttyadsvkgrftisrdnakntlslqmntlraedtamyycaalrsdcsggyrgvgqgtlvtvsseaaakeaaakeaaakeeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakgttttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdrrppskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelaslrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
63.seq id no.13
64.malpvtalllplalllhaarp
65.seq id no.14
66.tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd
67.seq id no.15
68.pskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvr
69.seq id no.16
70.krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggce
71.seq id no.17
72.rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
73.seq id no.18
74.ggggsggggsggggs
75.seq id no.19
76.eaaakeaaakeaaak
77.seq id no.20
[0078]5’‑
acaaaactgtgctagacatg-3’[0079]
seq id no.21
[0080]5’‑
cttcaagagcaacagtgctg-3’[0081]
seq id no.22
[0082]5’‑
cgcgagcacagctaaggcca-3’[0083]
seq id no.23
[0084]5’‑
actcacgctggatagcctcc-3’[0085]
与现有技术相比，本方案的有益效果：
[0086]
本发明以人的bcma和cd47分子为靶点，制备获得的通用型嵌合抗原受体能够同时靶向多发性骨髓瘤的两种表面标志物，其不仅能够有效解决靶点免疫逃逸导致的疗效降低问题，而且能够降低治疗成本、缩短治疗周期，同时能够有效的提高t细胞的杀伤活性，有效降低治疗后肿瘤的复发率，延长患者的生存期。
附图说明
[0087]
图1是本发明实施例中sds-page分析纯化后的重组蛋白bcma-mfc；其中m为maker，1为还原，2为非还原；
[0088]
图2是本发明实施例中sds-page分析纯化后的重组抗bcma的纳米抗体；其中m为maker；
[0089]
图3是本发明实施例中双特异性抗体nbs-okt3对bcma阳性细胞系的体外杀伤活性分析；
[0090]
图4是本发明实施例中利用间接elisa比较优选地人源化纳米抗体和驼源纳米抗体与bcma抗原的反应活性；
[0091]
图5是本发明实施例中biacore测定bcma-hu381、bcma-hu388和bcma-hu394与bcma
蛋白的亲和力；
[0092]
图6是本发明实施例中通过facs检测天然阳性细胞系中cd47分子的表达；
[0093]
图7是本发明实施例中嵌合抗原受体的分子模式示意图；
[0094]
图8是本发明实施例中利用facs检测car在t细胞中的表达；
[0095]
图9是本发明实施例中利用rtca检测通用型car-t细胞对bcma
+
/cd47
+-hela细胞的杀伤活性；
[0096]
图10a，图10b是本发明实施例中利用facs分别检测car-t细胞中trac和b2m基因敲除效率；图10c，图10d是本发明实施例中为trac和b2m基因敲除后测序分析图；
[0097]
图11是本发明实施例中通用型car-t细胞体外杀伤活性分析；
[0098]
图12是本发明实施例中通用型car-t细胞对mm小鼠移植模型生存期分析。
具体实施方式
[0099]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0100]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0101]
实施例一bcma蛋白真核表达载体的构建及其表达、纯化
[0102]
1.1载体构建
[0103]
以含有bcma全长基因的质粒为模板，设计引物扩增获得bcma胞外区(ecd)基因，并利用同源重组的方式将其连接至经限制性内切酶pstⅰ和xbaⅰ双酶切后的pvax-mfc载体中，通过转化至dh5α感受态中涂布卡那抗性平板置于37℃温箱培养过夜，挑取单克隆测序鉴定。
[0104]
1.2重组蛋白的表达及纯化
[0105]
将构建成功的含有bcma胞外区基因的重组质粒pvax-bcma(ecd)-mfc转染至hek293t细胞中，表达5天后收集培养上清，利用nta-ni柱通过亲和层析的方式纯化获得高纯度的重组蛋白bcma-mfc，结果如图1所示。
[0106]
实施例二抗bcma蛋白纳米抗体的筛选与制备
[0107]
2.1蛋白乳化与动物免疫
[0108]
将1mg纯化的bcma-mfc重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后对阿拉善双峰驼通过颈部皮下进行第一次免疫，然后每隔2周将1mg蛋白与不完全弗氏佐剂乳化后连续进行4次免疫，冲击免疫后的第7天采集外周抗凝血和凝血。
[0109]
2.2 vhh噬菌体抗体文库的构建及淘选
[0110]
2.2.1外周血淋巴细胞的分离
[0111]
从骆驼颈部静脉无菌采集200ml外周抗凝血，先用等体积的rpmi-1640培养基稀释。再用ficoll-paqueplus淋巴细胞分离液(greinerbio-one)和淋巴细胞分离管通过离心的方式分离获得外周血淋巴细胞，得到的淋巴细胞可直接提取总rna或冻存于-80℃备用。
[0112]
2.2.2 vhh基因扩增
goat@human igg(catalog 109-603-003,jackson)抗体进行检测，结果如图6所示，上述细胞系中cd47分子呈强阳性表达。
[0131]
实施例六嵌合抗原受体的慢病毒制备
[0132]
6.1嵌合抗原受体的设计
[0133]
本实施例构建抗bcma和/或cd47的嵌合抗原受体car-hu388、car-sirpαv、car-h31、car-h32，其中car-h31、car-h32抗原结合域分别为h31、h32，嵌合抗原受体的分子模式示意图如图7所示。
[0134]
6.2构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体
[0135]
以含有hu388和/或sirpαv序列的质粒为模板，设计同源重组引物分别扩增抗原结合域，根据胶回收试剂盒说明书对pcr产物和用限制性内切酶bamhⅰ和kpn i酶切后的慢病毒载体pslcar-cd19-bbz分别进行回收，再利用同源重组酶进行连接，经转化、测序验证确定构建成功。
[0136]
6.3慢病毒包装
[0137]
具体步骤如下：
[0138]
6.3.1将含有嵌合抗原受体的慢病毒质粒、包装辅助质粒pspax2和包膜质粒pmd2.g按照质量比6:3:1的比例混合，再将其与转染试剂按照质量体积比3:1的比例混匀，加入一定体积的无血清opti-mem培养基中，混匀后室温静置20min，将上述混合液均匀加入铺有hek293t细胞的培养皿中，混匀后置于37℃、5％co2的培养箱中培养6～8h后，更换新鲜培养基并继续培养48h后收集培养上清，同时更换新鲜培养基并继续培养至转染后72h时收集上清。
[0139]
6.3.2将收集的培养上清4℃、2000rpm离心10min后用0.45μm滤膜过滤，置于超速离心机中4℃、35,000rpm离心2.5h，弃去上清，沉淀用适量体积rpmi-1640培养基重悬，病毒液可直接用于后续感染t细胞或分装冻存于-80℃备用。
[0140]
实施例七car-t细胞的制备
[0141]
具体步骤如下：
[0142]
7.1原代t淋巴细胞的分离
[0143]
采集适量人外周血于抗凝管中，颠倒混匀，先用等体积的rpmi-1640培养基稀释外周血。再用ficoll-paque plus淋巴细胞分离液和淋巴细胞分离管通过离心的方式分离获得外周血淋巴细胞，裂解红细胞后再利用pant cell isolation kit(catalog 130-096-535,miltenyi)分选t细胞。
[0144]
7.2 t细胞的培养
[0145]
将分选出的t细胞用x-vivo培养基调整至5
×
106个/ml，采用人t cell activation/expansion kit(catalog130-091-441,miltenyi)激活t细胞，混匀后置于37℃、5％co2的培养箱中培养刺激48h后，300g离心10min去除磁珠，弃去上清，用新鲜t细胞培养基重悬t细胞。
[0146]
7.3 car慢病毒感染
[0147]
将实施例六6.3.2中制备的含有car的慢病毒浓缩液(moi＝10)与t细胞混合，加入10μg/ml polybrene、10ng/ml il-7和10ng/ml il-15，置于离心机中32℃、2000rpm离心2h，离心结束后取出细胞板置于37℃、5％co2的培养箱中培养。
[0148]
7.4 car-t细胞培养
[0149]
将制备的car-t细胞密度维持在1
×
106个/ml，每2～3天进行半换液并继续培养用于后续实验。
[0150]
7.5 car-t细胞中car的表达情况检测
[0151]
取5
×
104个car-t细胞，利用抗原bcma-mfc和/或cd47-hfc重组蛋白与car-t细胞共孵育，1200rpm离心洗涤3次后用647(catalog 115-605-003,jackson)和647-goat@human igg通过facs方法检测car的表达情况，结果如图8所示，car-hu388、car-sirpα、car-h31、car-h32中car的表达率分别为93.43％、93.80％、97.51％、97.63％。
[0152]
实施例八通用型car-t细胞的制备
[0153]
8.1 sgrna设计
[0154]
首先从ncbi数据库下载人trac(ng_001332.3)、b2m(nm_004048.4)基因序列，利用crispr设计软件(http://chopchop.cbu.uib.no/)针对trac恒定区和b2m功能域设计sgrna。
[0155]
8.2 crispr/cas9介导的基因敲除
[0156]
将上述基因序列以及其互补链分别进行基因合成，为了形成核糖核蛋白复合体(rnp)，将重组cas9蛋白(thermofisher)与合成的sgrna按照10μg:5μg混匀后与10μl 4d-nucleofector
tm
solution在37℃孵育10～15分钟，将准备就绪的rnp与实施例七7.4中与100μl 4d-nucleofector
tm
solution重悬的1.0
×
107个car-t细胞混匀加入lonza公司电转仪中，利用程序e0-115进行电转，电转完成后置于37℃、5％co2的培养箱中继续培养。
[0157]
8.3敲除效率检测
[0158]
电转3～4天后各取1.0
×
105个t细胞利用facs检测trac和b2m基因的敲除效率，其中所用抗体为fitc anti-cd3(clone ucth1,biolegend)，pe anti-β2m(clone 2m2,biolegend)，647anti-hla-dr,dp,dq(clone t
ü
39,biolegend)，结果如图10a，b所示，trac和b2m基因的敲除效率分别为46.58％和48.85％。
[0159]
8.4敲除后car-t细胞中trac和b2m基因的鉴定
[0160]
取1.0
×
104个实施例八8.2中敲除后的car-t细胞，利用总dna提取试剂盒提取全基因组，对trac和b2m基因分别利用引物trac-f,trac-r和b2m-f,b2m-r(见表1)进行扩增，胶回收扩增产物(trac:500bp；b2m:592bp)后进行测序。测序结果如图10c，d所示，car-t细胞中基因trac和b2m敲除成功，表明通用型car-t细胞制备成功。
[0161]
8.5敲除后car-t细胞的纯化
[0162]
本发明利用磁珠分选的方式对trac-/b2m-car-t细胞进行纯化。具体为：(1)取电转3～4天后1.0
×
105个car-t细胞与biotin anti-cd3 antibody(catalog 317319,biolegend)室温共孵育30分钟，孵育结束后pbs洗涤3次，按照说明书将细胞与anti-biotin microbeads(catalog 130-090-485,miltenyi)共孵育，孵育结束后洗涤3次，置于磁力架中收集未吸附的细胞；(2)将(1)中未吸附的细胞与biotin anti-β2m antibody(catalog 316308,biolegend)室温共孵育30分钟，孵育结束后pbs洗涤3次，将细胞与anti-biotin microbeads共孵育，孵育结束后洗涤3次，置于磁力架中收集未吸附上的细胞；(3)将(2)中未吸附的细胞与biotin anti-hla-dr antibody(catalog 307614,biolegend)室温共孵育
30分钟，孵育结束后pbs洗涤3次，将细胞与anti-biotin microbeads共孵育，孵育结束后洗涤3次，置于磁力架中收集未吸附上的细胞，最后按照1
×
106个/ml重悬car-t细胞并加入10ng/mlil-7和10ng/mlil-15刺激因子，置于37℃、5％co2继续培养用于后续实验。
[0163]
实施例九体外检测通用型car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
[0164]
9.1体外检测car-t细胞对bcma
+
/cd47
+-hela细胞的杀伤活性
[0165]
将bcma
+
/cd47
+-hela细胞按照每孔5000个细胞、100μl/孔(复孔)缓慢加入非标记杀伤检测仪(rtca)仪器专用96孔板中，置于仪器中培养至cell index数值位于1.0～2.0之间，按照e:t为3:1的比例加入car-t细胞以及对照细胞，启动仪器继续检测，结果如图9所示，双特异性通用型car-t(car-h32、car-h31)的杀伤活性强于单特异性car-t(car-hu388、car-sirpαv)。
[0166]
9.2体外检测通用型car-t细胞对rpmi-8226、mm.1s细胞的杀伤活性
[0167]
将通用car-t细胞、对照t细胞、空白细胞分别与2
×
104个肿瘤细胞rpmi-8226-luciferase、mm.1s-luciferase按照e:t为4:1、2:1、1:1、1:2的比例混合后加入96孔板中，每组设置复孔，置于37℃、5％co2培养箱中共培养24h后每孔加入5μl荧光素酶底物，吹打混匀，立即置于多功能酶标仪中测定rlu(relative light unit)，利用荧光强度定量杀伤效率。杀伤效率计算公式为：[1-(实验孔读数/对照孔读数)]
×
100％。结果如图11所示，在两种肿瘤细胞中具有相似的杀伤活性，双特异性通用型car-t(car-h32、car-h31)的杀伤活性强于单特异性car-t(car-hu388、car-sirpαv)。
[0168]
9.3体内检测car-t细胞在mm小鼠移植模型中的抗肿瘤活性
[0169]
将mm.1s-luciferase和rpmi-8226-luciferase细胞分别按照每只2
×
106个细胞通过尾静脉接种至6～10周龄的ncg小鼠中，接种10天后在活体成像仪中检测肿瘤生长情况并将其随机分为5组，每组5只。分别于接种肿瘤细胞后第13天，将通用car-t和mock-t细胞按照每只4
×
106个细胞通过尾静脉接种至对应组别，其中对照组接种相同体积的pbs。观察统计实验组和对照组每只小鼠的生存状态，观察统计时间长度为100天。利用kaplan-meier法绘制小鼠生存曲线并通过log-rank(mantel-cox)检验统计比较各组小鼠生存期的差异性。结果如图12所示，双特异性通用型car-h32组生存期显著长于单特异性car-t(car-hu388、car-sirpαv)，表明双特异性car-t细胞有效的避免了靶点逃逸引起的疗效降低以及肿瘤复发等问题。
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表1本发明中涉及所需引物序列
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引物名称引物序列(5
’‑3’
)call001gtcctggctgctcttctacaaggcall002ggtacgtgctgttgaactgttccvhh-forgtcctggctgctcttctacaaggvhh-revggtacgtgctgttgaactgttcctrac-fccttgtccatcactggcatctrac-rggttttggtggcaatggatab2m-fgccgatgtacagacagcaaab2m-rtcgacgccctaaactttgtc
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以上具体实施例仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人
员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种抗bcma的纳米抗体(nb)，其特征在于，包含以下中的任一者：(1)一种抗bcma蛋白的纳米抗体，命名为bcma-nb381，氨基酸序列如seq id no.1所示；(2)一种抗bcma蛋白的纳米抗体，命名为bcma-nb388，氨基酸序列如seq id no.2所示；(3)一种抗bcma蛋白的纳米抗体，命名为bcma-nb394，氨基酸序列如seq id no.3所示。2.一种抗bcma的人源化纳米抗体(hunb)，其特征在于，根据权利要求1中(1)、(2)和(3)所述改造的抗bcma蛋白的人源化纳米抗体，命名为bcma-hu381、bcma-hu388和bcma-hu394，氨基酸序列如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示。所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。3.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2任一项所述的抗bcma的纳米抗体。4.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求3所述的分离的核酸。5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求4所述的重组载体。6.一种抗bcma的纳米抗体的制备方法，其特征在于，其包括：培养如权利要求5所述的宿主细胞，以获得所述抗bcma的纳米抗体。7.一种重组蛋白及其药物组合物，其特征在于，包含权利要求1和2中任一重组蛋白用于相关疾病诊断或与活性剂联合使用，所述活性剂包括免疫检查点相关制剂和/或抗体偶联药和/或双(多)特异性抗体和/或放射性核素和/或激酶抑制剂。8.一种抗bcma的嵌合抗原受体car，其特征在于，所述嵌合抗原受体car包含信号肽、可识别bcma抗原的抗原识别区、铰链区、跨膜区和信号转导结构域，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.9所示；所述嵌合抗原受体car的抗原识别区包括如权利要求2所述的抗bcma的人源化纳米抗体hu388；所述信号肽为cd8α信号肽；所述铰链区包括cd8；所述跨膜区包括cd28跨膜域；所述信号转导结构域包括cd3ζ；所述信号转导结构域还包括4-1bb胞内区。9.一种抗bcma和cd47的双特异性嵌合抗原受体car-h31和car-h32，其特征在于，所述嵌合抗原受体car包含可识别bcma和cd47抗原的抗原识别区、铰链区、跨膜区和信号转导结构域，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.11和seq id no.12所示；所述嵌合抗原受体car的抗原识别区包括如权利要求2所述的抗bcma的人源化纳米抗体hu388和cd47天然配体sirpα胞外v区(sirpαv)。10.一种car-t细胞，其特征在于，其包括如权利要求8和9所述的嵌合抗原受体；所述car-t细胞包括通用型car-t细胞和自体car-t细胞中的至少一种。11.如权利要求1或2所述的抗bcma的纳米抗体或如权利要求3所述的分离的核酸或如权利要求4所述的重组载体或如权利要求5所述的宿主细胞或如权利要求7所述的重组蛋白及其药物组合物或如权利要求8和9所述的嵌合抗原受体或如权利要求10所述的car-t细胞在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用；
所述产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种；所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病、b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种；所述实体瘤包括骨肉瘤、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈癌中的至少一种。

技术总结
本发明公开了一种抗BCMA的纳米抗体及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明利用CRISPR/Cas9技术敲除T细胞中B2M和TRAC基因制备获得通用型CAR-T细胞；将靶向BCMA的纳米抗体和CD47的天然配体SIRPα胞外N端V区、CD28跨膜区、4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区串联构建成一种双靶向嵌合抗原受体，用于多发性骨髓瘤的治疗，以解决CAR-T细胞疗法在治疗多发性骨髓瘤中面临的高复发问题。本发明制备的通用型CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞具有较强的杀伤活性，有效的改善了治疗效果，并为后续开发具有高效、持久抗肿瘤活性的过继性免疫疗法提供一种关键材料。疫疗法提供一种关键材料。疫疗法提供一种关键材料。


技术研发人员：仝爱平 路琪中 李和贤 吴志国 王玮 杨寒朔 牛挺 魏于全
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2022.09.23
技术公布日：2023/7/11