一种利用噬菌体降低细菌耐药性的方法及其应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用噬菌体降低细菌耐药性的方法及其应用。


背景技术：

2.细菌的耐药性分为固有耐药(intrins细菌耐药性ic resistance)和获得性耐药(acquired resistance)。固有耐药性又称天然耐药性，是由细菌染色体基因决定、代代相传，不会改变的，如链球菌对氨基糖苷类抗生素天然耐药；肠道g-杆菌对青霉素天然耐药；铜绿假单胞菌对多数抗生素均不敏感。获得性耐药性是由于细菌与抗生素接触后，由质粒介导，通过改变自身的代谢途径，使其不被抗生素杀灭。细菌的获得性耐药可因不再接触抗生素而消失，也可由质粒将耐药基因转移个染色体而代代相传，成为固有耐药。
3.目前，常用的降低或消除细菌耐药性的方法主要有：中药消除方法、化学消除方法和物理消除法。
4.（1）中药消除方法：中药消除耐药基因和耐药质粒的有关报道自20 世纪 80 年代开始逐渐增多，研究表明，这些中药大多属于清热解毒和清热燥湿药，其有效成分多样化，多为挥发油、黄酮、有机酸、多糖类、生物碱等（马驰 2011；轩弘源等 2019；张迎冰等 2017）。中药属纯天然药，以价格低廉、不会产生药物残留和耐药的多种优势，在我国畜牧业有着广阔的应用前景。
5.（2）化学消除方法：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，sds）是一种阴离子表面活性剂。研究表明，sds 可以作为耐药质粒的消除剂，主要作用机制有两方面：一方面是 sds可以溶解菌株的内膜蛋白，破坏质粒在细胞膜上的结合位点；另一方面是sds 进入细菌细胞质中，造成某些和质粒复制有关的蛋白质失活，使质粒不能够正常复制和分配到子代中，达到耐药质粒消除的目的。早在 1968 年 tomoeda m 等开始使用sds来消除大肠杆菌的耐药质粒，且研究发现消除效果与试验温度、sds 的浓度均密切相关。嵇辛勤等（2015）通过高温-sds 交替处理鸭源耐药性大肠杆菌至第7 代，耐药菌株恢复了对部分抗生素药物的敏感性。
6.（3）物理消除法：在多种物理条件下，如高温、高热和紫外线照射等，菌株的质粒dna分子发生裂解变性，失去原有的功能，因此可以利用这一原理来消除耐药质粒。项裕财（2001）研究发现用30 w的紫外线灯距离为43 cm垂直照射时，耐药质粒消除效果最佳。有研究者通过电击法消除了80%的耐药大肠杆菌的耐药质粒（李栋 2015）。实际上物理消除耐药质粒的条件并不适用于临床，因此研究者通常选择物理和化学相结合的方法（如高温-sds）来消除耐药质粒。
7.上述三种方法虽然能够对细菌的耐药性进行一定程度消除，但是，该三种方法均局限于体外的抑菌试验及耐药消除试验，对某代耐药细菌进行耐药性的消除，随着细菌的传代繁殖，其耐药性还有重新获得的可能。


技术实现要素：

8.鉴于上述细菌耐药性常规消除方法存在的不足，本发明的目的地是提供一种利用噬菌体降低细菌耐药性的方法及其应用。
9.本发明采用的技术方案是：一种利用噬菌体降低细菌耐药性的方法，采用噬菌体连续对耐药细菌及其培养物进行三次以上共培养处理。
10.进一步地，所述噬菌体为大肠杆菌噬菌体rdp-ec-16029。
11.进一步地，所述噬菌体的处理滴度为10-2
mic。
12.进一步地，所述的耐药细菌为耐药的大肠杆菌、沙门氏菌或克雷伯菌。
13.本发明还提供一种利用噬菌体降低细菌耐药性的方法的应用，利用所述的方法，对耐药细菌进行处理，获得耐药性降低或消除的细菌。
14.一种耐药性降低的细菌，耐药细菌经所述方法处理后，其耐药质粒产生缺失突变。
15.进一步地，所述噬菌体为大肠杆菌噬菌体rdp-ec-16029，处理滴度为10-2
mic本发明与现有技术相比，具有的有益效果是：本发明采用噬菌体对耐药细菌进行处理，可以将噬菌体直接注射在动物体内，在动物体内实现对耐药细菌多代次处理作用，降低活体内病原菌的耐药性，减少耐药性的发生，效果持久稳定。并且，相对于传统方法，本发明的方法更安全高效。
附图说明
16.图1为本发明实施例中耐药菌处理前r质粒电泳图，m：marker；1：ec-1；2：sa-2，3：kp-3；图2为本发明实施例中对大肠杆菌耐药株处理后获得的消除子r质粒的电泳图，m：marker；1、2、3、4、5分别为不同消除子菌落的r质粒的电泳图；图3本发明实施例中对沙门氏菌耐药株处理后获得的消除子r质粒的电泳图，m：marker；1、2、3、4、5分别为不同消除子菌落的r质粒的电泳图；图4为本发明实施例中对克雷伯菌耐药株处理后获得的消除子r质粒的电泳图，m：marker；1、2、3、4、5分别为不同消除子菌落的r质粒的电泳图。
具体实施方式
17.为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
18.实施例 利用噬菌体对大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯菌耐药菌株进行消除实验1、耐药菌株的分离鉴定从山东不同发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基（麦康凯琼脂）上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5ml lb肉汤中，于37℃，200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16srna分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性大肠杆菌，命名为ec-1，于-80℃冰箱中保存。
19.在科马嘉沙门氏菌显色培养基上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的紫色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5ml lb肉汤中，于37℃，200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16srna分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性沙门氏菌，命名为sa-2，于-80℃冰箱中保存。
20.在科马嘉尿道菌群定位显色培养基上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面有金属光泽的菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5ml lb肉汤中，于37℃，200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16srna分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性克雷伯菌，命名为kp-3，于-80℃冰箱中保存。
21.2、致病性耐药菌耐药基因检测及r质粒提取将大肠杆菌ec-1接种划线于麦康凯平板，置于37℃恒温培养。挑选具有特征性的单个菌落接种于肉汤中，于37℃恒温水浴振荡器中培养。取菌液，室温下离心收集细菌沉淀，弃上清。每管加入混合液，重悬细菌沉淀，确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。往重悬混合液中加入，轻轻颠倒混匀一次，使细菌完全裂解，裂解反应不能超过2min。加入350ul solution iii随即颠倒离心管4~6次混匀，可见白色絮状物产生，室温下13000r/min离心10min。转移上清液至套有2ml收集管的hibind dna结合柱中，室温下10000r/min离心1min，倒弃收集管内的滤液。把柱子重新装回收集管，加入500ul hb buffer，室温下10000r/min离心1min，弃去滤液。把柱子重新装回收集管，加入500ul wash buffer，按上述条件10000r/min离心1min，弃去滤液。重复上步操作一次。弃去滤液，把柱子重新装回收集管，离心空柱子以除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。把柱子装在干净的离心管上，加入到柱子基质中，静置，离心洗脱出质粒，所得液体即为高纯度质粒。
22.sa-2与kp-3按照相同操作进行，提取相应质粒。
23.3、噬菌体的制备首先配制增殖培养基，其主要成分为：添加30%甘油的lb液体培养基。将宿主菌ec-1按照5%的接种量接种至增殖培养基中；将宿主菌在37℃的温度下培养至对数期；将噬菌体rdp-ec-16029原液100μl与宿主菌300μl均匀混合，静置15分钟使其感染。将混合液接至含10 ml新鲜液体培养基的试管中，于37℃下振荡培养约8小时。离心去除杂质：将上一步的混合液3000r/min离心15min，去除杂质，收集上清。
24.4、噬菌体对细菌的mic测定选用无菌 96 孔板进行实验，每排分别加入100ul lb肉汤。第一孔中加入10
ꢀµ
l噬菌体rdp-ec-16029，用移液枪吹打混匀。然后从第一孔中取 10
ꢀµ
l混合液加入第二孔，依次进行10系列倍比稀释，稀释到第十孔时吸出10ul丢掉，11，12孔暂留备用。在 1-10 孔中分别加入100
ꢀµ
l 稀释好的大肠杆菌菌液（1
×
105～2
×
10
5 cfu/m l）；第11 孔为阴性对照，加入100
ꢀµ
l mh肉汤；第12孔为阳性对照，加入100
ꢀµ
l稀释好的菌液。37℃培养24 h。观察与噬菌体作用的细菌的生长情况，没有细菌生长的最低浓度即为最低抑菌浓度，噬菌体对大肠杆菌的最低抑菌浓度为10-5 cfu/m l。
25.5、利用噬菌体对耐药菌株处理获得消除子将噬菌体rdp-ec-16029与分离获得的耐药性大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯菌进行混合培养：将噬菌体rdp-ec-16029进行10倍稀释，取-7倍的噬菌体进行试验，分别取100ul
大肠杆菌ec-1，沙门氏菌sa-2，克雷伯菌kp-3同步接种于不含抗生素的lb肉汤中，37℃温箱中培养24h；分别取100ul培养24小时后的混合物与噬菌体rdp-ec-16029同步接种于不含抗生素的lb肉汤中，37℃温箱中培养24h；分别取100ul二次培养24小时后的混合物与噬菌体rdp-ec-16029同步接种于不含抗生素的lb肉汤中，37℃温箱中培养24h。作用后第3次培养物保存。得到的细菌即为处理之后的细菌（消除子）。
26.分别取处理前原始的耐药菌株ec-1，sa-2，kp-3与处理后的ec-1，sa-2，kp-3进行药敏试验对比，结果表明，噬菌体处理后的细菌耐药性有所降低，如表1所示。
27.表1 耐药菌株处理前、后对抗生素药物的敏感性变化6、利用噬菌体对耐药菌株处理的效果与现有方法对比将噬菌体rdp-ec-16029与分离获得的耐药性大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯菌进行混合培养：将噬菌体rdp-ec-16029进行10倍系列稀释，取-7倍的噬菌体进行试验，分别取100ul噬菌体与100ul大肠杆菌ec-1，沙门氏菌sa-2，克雷伯菌kp-3同步接种于不含抗生素的lb肉汤中，37℃温箱中培养24h；分别取100ul培养24小时后的混合物与噬菌体rdp-ec-16029同步接种于不含抗生素的lb肉汤中，37℃温箱中培养24h；分别取100ul二次培养24小时后的混合物与噬菌体rdp-ec-16029同步接种于不含抗生素的lb肉汤中，37℃温箱中培养24h。作用后取3次培养物保存。
28.另取0.02% sds对上述三种耐药菌株进行处理（处理方法参考已报导的文献）作为消除对照。将培养后的菌液充分稀释后涂于na 琼脂平板，37℃培养12-18 h，获得大量的单菌落，各挑取100个单菌落分别点于na琼脂平板，和含抗生素ka+的na 琼脂平板上，倒置，37℃恒温培养 12 h选取在含药平板上不生长及不含药平板上生长的菌落，再次接种于含药培养基上进行验证，若不生长则该菌为消除子（耐药性消除的菌株）。结果如下表2所示。
29.表2 耐药消除试验结果
7、消除子r质粒提取鉴定按照上述描述的方法对消除子进行质粒提取，每种菌分别选取5个平行实验组。经琼脂糖凝胶电泳，检测原始菌株和消除子的质粒是否变化，是否存在耐药质粒的丢失现象。结果如图1-4所示，三种病原菌经噬菌体rdp-ec-16029处理后获得的消除子，均表现2～3个质粒条带的丢失，表明噬菌体rdp-ec-16029对耐药菌r质粒有很好的消除作用。

技术特征：
1.一种利用噬菌体降低细菌耐药性的方法，其特征在于：采用噬菌体连续对耐药细菌及其培养物进行三次以上共培养处理。2.根据权利要求1所述的利用噬菌体降低细菌耐药性的方法，其特征在于：所述噬菌体为大肠杆菌噬菌体rdp-ec-16029。3.根据权利要求1所述的利用噬菌体降低细菌耐药性的方法，其特征在于：所述噬菌体的处理滴度为10-2
mic。4.根据权利要求1所述的利用噬菌体降低细菌耐药性的方法，其特征在于：所述的耐药细菌为耐药的大肠杆菌、沙门氏菌或克雷伯菌。5.一种如权利要求1-4任一项所述的利用噬菌体降低细菌耐药性的方法的应用，其特征在于：利用所述的方法，对耐药细菌进行处理，获得耐药性降低或消除的细菌。6.一种耐药性降低的细菌，其特征在于：耐药细菌经权利要求1-4任一项所述的方法处理后，其耐药质粒产生缺失突变。7.根据权利要求6所述的耐药性降低的细菌，其特征在于：所述噬菌体为大肠杆菌噬菌体rdp-ec-16029，处理滴度为10-2
mic。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用噬菌体降低细菌耐药性的方法及其应用。一种利用噬菌体降低细菌耐药性的方法，该方法采用噬菌体连续对耐药细菌及其培养物进行三次以上共培养处理。本发明采用噬菌体对耐药细菌进行处理，可以将噬菌体直接注射在动物体内，在动物体内实现对耐药细菌多代次处理作用，降低活体内病原菌的耐药性，减少耐药性的发生，效果持久稳定。并且，相对于传统方法，本发明的方法更安全高效。法更安全高效。法更安全高效。


技术研发人员：杜新永 盖春云 李纪兆 张得彦 王海霞
受保护的技术使用者：青岛润达生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.27
技术公布日：2023/7/11