通过单壁碳纳米管递送外源核酸到植物细胞的方法与流程

aminopropyltriethoxysilane，apts)等正电荷修饰基团。将含有外源基因的质粒dna或体外转录获得的 mrna与表面修饰了pei的单壁碳纳米管通过静电作用相连接，得到 dna-swnt或mrna-swnt复合物。外源质粒可以是pbi221-gfp，优选的质粒包括植物基因过表达质粒和植物crispr基因编辑质粒； rna可以是sirna及mrna，优选的为含α-globin或其他植物管家基因5’utr及3’utr的mrna。
7.本发明所述的基于纳米颗粒的植物遗传转化方法，其特征在于，将所述dna-swnt/rna-swnt复合物与植物愈伤组织例如水稻愈伤组织共孵育，从而将外源基因递送至植物细胞；或者将所述 dna-swnt/rna-swnt复合物通过叶片注射而将外源基因递送至植物细胞例如本氏烟草。
8.具体操作步骤包括：
9.1)以羧基修饰的单壁碳纳米管为原料，制成羧基修饰单壁碳纳米管的悬液，活化单壁碳纳米管的羧基，然后加入pei修饰，获得 pei修饰的单壁碳纳米管的悬液；
10.2)提供含有外源目的基因的dna质粒或者rna序列；
11.3)将步骤1得到的悬液与步骤2的质粒dna或者rna序列混合，得到dna-swnt/rna-swnt复合物；
12.4)将所述dna-swnt/mrna-swnt复合物与植物愈伤组织例如水稻愈伤组织共孵育，从而将外源基因递送至植物细胞；或者将所述dna-swnt/mrna-swnt复合物通过叶片注射而将外源基因递送至植物细胞例如本氏烟草。
13.纳米材料的表面可进行电荷修饰，当纳米材料进行正电荷基团修饰后，可结合核酸分子。其中dna结构的质粒是较稳定的核酸结构， mrna同样可被带正电的纳米材料结合并同纳米颗粒一起进入植物组织及细胞中。发明人利用纳米材料与核酸的上述性质，在烟草叶片上皮细胞及水稻愈伤组织中验证了gfp质粒及mrna在上述植物细胞中的高效表达。
14.本发明与现有技术相比，有益效果在于：形成复合物的操作过程简单，只需将swnt颗粒与质粒dna/mrna直接孵育即可，所需时间短，直接孵育60min后可直接注射烟草叶片或滴加至水稻愈伤后即可实现转化。本发明提供了一种简单的、可重复的基于纳米颗粒的直接递送外源核酸序列的转化方法，无需借助外力即能穿越细胞壁递送外源核酸序列，这为植物基因功能的研究提供了重要的转化工具，也为利用基因编辑工具培育新品种奠定了基础。
附图说明
15.说明书附图用来帮助对本发明的进一步理解，因而构成本技术的一部分。但是，说明书附图仅仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限定。
16.图1：为实施例1swnt颗粒的透射电子显微镜图。
17.图2：为实施例2外源质粒载体的结构示意图。
18.图3：为实施例3的swnt负载外源dna的琼脂糖凝胶电泳图及实施例4的swnt负载mrna的琼脂糖凝胶电泳图。
19.图4：为实施例3dna-swnt复合物的透射电子显微镜图。
20.图5：为实施例5的烟草叶片激光共聚焦显微镜图，分别为烟草叶片表皮细胞的绿色荧光、明场照片及合并图片。
21.图6：为实施例6的水稻愈伤组织激光共聚焦显微镜图，分别为 dna质粒和mrna在水稻愈伤组织细胞中的绿色荧光、明场照片及合并图片。
具体实施方式
22.为了便于理解本发明，下文将结合实施例对本发明作更全面细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
23.实施例1：swnt-pei的制备
24.称取30mg cooh-swnt，用30ml无酶水悬起后，超声40min； 18000rpm离心1h后，取上清，632nm下测浓度后4℃放置过夜；通过浓度计算取2mg cooh-swnt，新配制的edc
–
nhs溶液，即 10mg edc和10mg nhs加入2.5ml ph为4.5-5.0的100mm的mes 溶液逐滴加入cooh-swnt悬液；超声15min后，cooh-swnt悬液加入预洗的100,000超滤管，用0.1
×
pbs洗3次；上述悬液加入 40mg pei(25 000mw)溶液，过夜16h以上；后加入无酶水洗去多余的pei及其他离子，无酶水洗5次，最终超滤浓缩至原始体积； 632nm下测得其浓度为68mg/l，透射电子显微镜图如图1所示。
25.实施例2：外源dna的制备
26.外源pbi221-gfp质粒载体的结构示意图见图2。将含 pbi221-gfp质粒的菌液在氨苄霉素抗性的平板上划线，37℃过夜培养，挑取单克隆于1.5ml离心管中摇菌，并于100ml锥形瓶中扩摇菌液，收集菌体后，提取质粒，并测质粒浓度为500-1000ng/μl。
27.实施例3：swnt负载外源dna实验
28.制备含有1μg dna的dna-swnt复合物。dna/swnt质量比分别为1:0.034、1:0.041、1:0.048、1:0.054、1:0.061、1:0.068。 tae(tris-乙酸盐-edta)缓冲液，含有40mm tris、20mm乙酸和1mm edta，用于电泳缓冲液和琼脂糖凝胶制备。纯质粒dna 和dna-swnt复合物在1％(w/v)琼脂糖凝胶(gel red)中以 120v电泳25分钟。结果显示dna/swnt质量比在1:0.048和 1:0.054之间的时候就能全部负载外源dna。按照1:0.05的比例进行室温连接，swnt负载外源dna的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。图4则显示了连接了dna的swnt透射电子显微镜图。
29.实施例4：swnt负载mrna实验
30.制备含有1μg mrna的mrna-swnt复合物。mrna/swnt 质量比分别为1:0.001、1:0.002、1:0.004、1:0.006、1:0.008、1:0.01。 tae(tris-乙酸盐-edta)缓冲液，含有40mm tris、20mm乙酸和1mm edta，用于电泳缓冲液和琼脂糖凝胶制备。mrna和 dna-swnt复合物在2％(w/v)琼脂糖凝胶(gel red)中以90v 电泳30分钟。结果显示mrna/swnt质量比在1:0.008和1:0.01 之间的时候就能全部负载mrna。按照1:0.01的比例进行室温连接， swnt负载mrna的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。
31.实施例5：烟草叶片的转化实验
32.将dna-swnt复合物通过叶片注射而将外源dna递送至本氏烟草细胞中。具体操作步骤包括：1)选取生长状态良好的约4周龄野生型烟草；2)将dna-msn复合物通过注射器注
射的方法注射入叶片，约200μl每剂次；3)将注射后的烟草置于培养室培养(23℃， 16h光照/8h黑暗)；4)注射后72小时在激光共聚焦显微镜下观察外源基因gfp的表达情况。
33.实验过程中，本氏烟草种子播撒在灭菌的营养土与蛭石1:1的土壤混合物中发芽，放入标准的苗圃托盘。约23℃下16小时光照/18 小时黑暗培养。发芽的幼苗随后移植至新的土壤混合物中继续培养生长至4周龄用。实验时是用附着在植物上的完整叶片上进行的，并培养至数据采集时。选健康和完全发育的本氏烟草(4周龄)的叶子进行实验。用1ml无针注射器吸取200μl dna-swnt溶液(或任何对照溶液)。轻轻按压注射器，施加温和的压力小心以免损坏叶子，完成侵染。侵染后48-72小时之后，截取叶片在激光共聚焦下进行荧光蛋白表达的观察。外源目的基因为红色荧光蛋白rfp、绿色荧光蛋白gfp、黄色荧光蛋白yfp。以外源目的基因绿色荧光蛋白为例，取叶片或愈伤组织在激光共聚焦显微镜下观察，采用波长为488nm 的激发光，能够观察到绿色荧光的细胞即为阳性结果。截取叶片在激光共聚焦下进行绿色荧光蛋白表达的观察。结果如图5所示。
34.实施例6：水稻愈伤组织的转化实验
35.日本晴水稻种子消毒后，播种于n6培养基上诱导产生愈伤组织； dna-swnt溶液室温孵育60min/mrna-swnt 4℃孵育60min后滴加至水稻愈伤组织共同培养72h后，在激光共聚焦下进行绿色荧光蛋白表达的观察。结果如图6所示。通过实验发现，外源基因在水稻愈伤中转化效率高，滴加dna-swnt复合物的水稻愈伤的组织2d 时可实现大于80％的转化效率，且第6d时仍能检测到较强的荧光信号。外源mrna在水稻愈伤中转化效率高，滴加mrna-swnt复合物的水稻愈伤的组织2d时可实现大于80％的转化效率，且第4d时仍能检测到较强的荧光信号。
36.通过在烟草叶片上皮细胞及水稻愈伤组织中验证gfp质粒及 mrna在上述植物细胞中的高效表达，清楚地证明了外源基因通过 dna-swnt/mrna-swnt复合物已经成功转化到上述植物细胞中。
37.以上所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做出任何形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用以上所公开的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种单壁碳纳米管(swnt)与外源质粒dna或者rna通过静电结合的复合物，其特征在于，对swnt进行了正电荷修饰。2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，在swnt上修饰有羧基，通过所述羧基修饰有聚乙烯亚胺(pei)、氨基功能化peg(nh
2-peg)或3-氨丙基三乙氧基硅烷。3.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的swnt的粒径为1*100nm。4.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述rna是sirna或者mrna。5.根据权利要求4所述的复合物，其特征在于，所述rna是含α-globin或其他植物管家基因5’utr和3’utr的mrna。6.权利要求1所述的复合物在植物遗传转化外源核酸序列方面的应用。7.权利要求1所述的复合物在水稻、烟草遗传转化外源核酸序列方面的应用。8.一种植物遗传转化方法，其特征在于，将权利要求1所述dna-swnt或者rna-swnt复合物与植物愈伤组织例如水稻愈伤组织共孵育，从而将外源基因递送至植物细胞；或者将所述dna-swnt或者rna-swnt复合物通过叶片注射而将外源基因递送至植物细胞例如本氏烟草。

技术总结
本发明公开了一种基于单壁碳纳米管(SWNT)向植物细胞递送质粒DNA或mRNA的方法。所述的单壁碳纳米管能够高效的负载表达质粒DNA或RNA，能够将其递送至烟草叶片及水稻愈伤组织细胞中，并实现外源基因的表达。本发明提供的单壁碳纳米管具有较小的粒径，所述的递送方法无需任何外力，只需与愈伤组织共同孵育或直接侵染叶片即可实现外源核酸序列的递送，可作为有效递送基因编辑工具的方法。作为有效递送基因编辑工具的方法。作为有效递送基因编辑工具的方法。


技术研发人员：曹宇虹 蔡垚 刘祝江
受保护的技术使用者：国家纳米科学中心
技术研发日：2021.12.27
技术公布日：2023/7/11