用于治疗冠状病毒感染的C5a抑制剂的制作方法

用于治疗冠状病毒感染的c5a抑制剂
1.本发明涉及由冠状病毒感染引起或与之相关的c5a活性医学病症的抑制剂，其中所述医学病症优选为(i)肺炎和/或(ii)发热。本发明还涉及c5a活性抑制剂在减少患有冠状病毒感染的受试者的炎症反应中的用途。本发明进一步涉及一种c5a活性抑制剂，用于在改善患有冠状病毒感染的受试者的器官功能、特别是肺功能和/或肝功能中使用。


背景技术：

2.c5a
3.c5a在补体激活后从c5上切割下来。在补体激活产物中，c5a是最有效的炎症肽之一，具有广泛的功能(guo rf和ward pa.2005.annu.rev.immunol.23:821-852)。c5a是一种存在于健康人的血液中的糖蛋白，分子量为11.2kda。c5a的多肽部分含有74个氨基酸，占8.2kda的分子量，而碳水化合物部分占大约3kda。c5a通过高亲和力c5a受体(c5ar和c5l2)发挥其作用(ward pa.2009.j.mol.med.87(4):375-378)。c5ar属于视紫红质型g蛋白偶联受体家族，具有七个跨膜区段；c5l2类似，但不是g蛋白偶联的。目前认为c5a主要通过c5a-c5ar相互作用发挥其生物学功能，因为几乎没有发现c5a-c5l2相互作用的生物学反应。c5ar广泛表达于骨髓细胞(包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞)以及许多器官(尤其是肺和肝脏)中的非骨髓细胞上，这表明了c5a/c5ar信号传导的重要性。c5a具有多种生物学功能(guo和ward,2005,同上)。c5a是嗜中性粒细胞的强趋化因子，并且对单核细胞和巨噬细胞也具有趋化活性。c5a在嗜中性粒细胞中引起活性氧爆发(o2消耗)并且增强吞噬作用和颗粒酶的释放。还已经发现c5a是一种血管扩张剂。已经证明c5a参与调节来自各种细胞类型的细胞因子表达，以增强嗜中性粒细胞上粘附分子的表达。发现当c5a在疾病环境中过度产生时会变得非常有害，因为它是在炎症反应链上游发挥功能的炎症反应的强诱导因子和增强因子。高剂量的c5a可能导致嗜中性粒细胞的非特异性趋化“脱敏”，从而引起广泛的功能障碍(huber-lang m等人2001.j.immunol.166(2):1193-1199)。
4.据报道，c5a会产生多种促炎症反应。例如，c5a刺激促炎症细胞因子(如tnf-α、il-1β、il-6、il-8和巨噬细胞移动抑制因子(mif))的合成以及从人白细胞中的释放(hopken u等人1996.eur j immunol 26(5):1103-1109；riedemann nc等人2004.j immunol173(2):1355-1359；strieter rm等人1992.am j pathol 141(2):397-407)。在tnf-α、巨噬细胞炎症蛋白(mip)-2、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子(cinc)-1和il-1β在肺泡上皮细胞中的产生中，c5a与lps产生强烈的协同作用(riedemann nc等人2002.j.immunol.168(4):1919-1925；rittirsch d等人2008.nat rev immunol 8(10):776-787)。
5.还已经证明c5a的阻断在各种物种的脓毒症实验模型和许多其他炎症(如缺血/再灌注损伤、肾脏疾病、移植物排斥、疟疾、类风湿性关节炎、感染性肠病、炎性肺病、狼疮样自身免疫性疾病、神经退行性疾病等)模型中具有保护作用，如在klos a.等人(klos a.等人2009.mol immunol 46(14):2753-2766)和allegretti m.等人(allegretti m等人2005.curr med chem 12(2):217-236)下部分综述。此外，最近已经发现c5a的阻断在小鼠
肿瘤模型中已显示出强大的治疗益处(markiewski mm等人2008.nat immunol 9(11):1225-1235)。
6.冠状病毒感染
7.在过去的几十年里，全世界发生了不同的冠状病毒爆发，其中特别是三种类型的病毒导致了高死亡率的疾病。严重急性呼吸综合征(sars)、中东呼吸综合征(mers)和最近的2019冠状病毒病(covid-19)。导致这些爆发的冠状病毒分别是sars-cov、mers-cov和sars-cov-2。
8.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)已经成为严重的公共卫生威胁[chen等人2020；medrxiv,2020:p.2020.02.16.20023903；chen等人[2]2020,the lancet,2020.395(10223):第507-513页；yu等人2020,microbes and infection,2020.22(2):第74-79页]。据信，湖北省以外地区的死亡率要低得多，这主要可归功于改善的医疗照顾，包括早期诊断以及及时且改善的医疗护理[zhao等人,medrxiv,2020:p.2020.03.17.20037572]。在中国以外的国家存在持续的传播。随着covid-19的继续传播，对各种级别的医疗护理的需求将激增。因此，为了有效降低死亡率，预防普通(轻症)病毒性肺炎发展为重症形式以及重症肺炎发展为危重病症或ards应当成为医学治疗的重点。
[0009]
covid-19可能呈现出长期无症状潜伏期的特征，与其他先前发生的致命冠状病毒感染、严重急性呼吸综合征(sars)和中东呼吸综合征(mers)相比，这可能是导致相对较高传播率的主要因素。covid-19患者典型地会出现诸如发热的流感样症状或包括干咳和呼吸急促在内的下呼吸道疾病的病征[chen等人[2]同上；chang等人jama,2020；wang等人ama,2020；xiao等人journal of medical virology,2020]。根据美国疾病控制与预防中心(cdc)的分析，在出现症状之前的潜伏期估计是在病毒暴露后2至14天之间的某个时间点。随着疾病进展为重症形式，它通常会影响包括肺、心脏、肝脏和凝血系统等在内的多个器官的功能[liu等人medrxiv,2020:p.2020.02.10.20021584；fan等人medrxiv,2020:p.2020.02.26.20026971；tang等人journal of thrombosis and haemostasis,2020.]。因此，死亡典型地是由呼吸衰竭和多器官功能障碍引起的，类似于其他病毒性肺炎诱导的脓毒症[zhang等人medrxiv,2020:p.2020.02.26.20028191]。脓毒症和ards大多发生在疾病发作后的第二周；生命之战通常发生在重症疾病的第三周[zhou等人the lancet,2020]。
[0010]
越来越多的数据表明，年龄较大、潜在的健康状况(例如心血管问题)和受损的免疫系统是可能导致更严重的疾病发作形式和更糟糕的结局的重要风险因素[huang等人the lancet,2020.395(10223):第497-506页]。与covid-19并存的与高死亡率相关的前三大共病是高血压、糖尿病和冠心病[zhou等人同上]。迫切需要为covid-19患者(尤其是具有上文提及的风险因素或共病的患者)制定安全且有效的治疗策略。
[0011]
covid-19已经成为对人类、尤其是对老年人的严重健康威胁。covid-19的特征可能在于病毒炎症和免疫介导的损伤的双重作用。基于本文公开的临床前以及临床发现，我们提出了在冠状病毒感染(特别是covid-19)进展中发生的致病性“补体风暴”事件。通过抗c5a疗法进行阻断在动物模型中提供了有效的治疗效果，并且在covid-19患者中进行了初步测试。抗c5a方法在对抗患有进行性/恶化的轻症形式以及重症形式的疾病的患者的covid-19中是一种可行的策略。
[0012]
本发明的技术问题
[0013]
本发明的问题之一是提供用于治疗由新型sars-cov2病毒引起的肺炎的治疗方法。
[0014]
到目前为止，还没有研究过抗c5a治疗是否能有效治疗由冠状病毒，更不用说高死亡率毒株sars-cov、mers-cov和sars-cov-2引起的肺炎。
[0015]
本技术的诸位发明人已经应用ifx-1(一种针对人c5a的高效中和mab)探索补体抑制在治疗h7n9病毒诱导的重症肺炎中的治疗潜力。据我们所知，这是第一次在患有冠状病毒感染的受试者中研究抗c5a治疗肺炎和相关症状。
[0016]
以下实验部分中公开的数据证明，在感染各种冠状病毒类型(包括sars-cov、mers-cov和sars-cov-2)时会发生过度的补体激活。
[0017]
诸位发明人已经发现，对感染sars-cov-2的人类患者进行抗c5a治疗显著减轻了covid-19的主要症状，即减少了发热，提高了淋巴细胞计数，降低了crp水平，并且改善了器官功能(特别是肺和肝功能)，如通过血液氧合和alt/ast水平的正常化所观察到的。在应用抗c5a治疗后，所有这些效果都以快速分辨的方式观察到。
[0018]
此外，诸位发明人公开了许多实验，它们提供了关于不同冠状病毒株感染如何导致大量补体激活的机制见解。
[0019]
这些结果表明，补体抑制(特别是c5a抑制)是治疗冠状病毒引起的疾病(特别是冠状病毒引起的呼吸综合征)的非常有前景的策略。
[0020]
以上概述不一定描述了与本发明相关的所有优点和本发明解决的所有问题。


技术实现要素：

[0021]
在第一方面，本发明涉及一种用于在治疗由冠状病毒感染引起或与之相关的医学病症中使用的c5a活性抑制剂，其中所述医学病症优选为(i)肺炎和/或(ii)发热。
[0022]
在第二方面，本发明涉及一种c5a活性抑制剂，用于在减少患有冠状病毒感染的受试者的炎症反应中使用。
[0023]
在第三方面，本发明涉及一种c5a活性抑制剂，用于在改善患有冠状病毒感染的受试者的器官功能、特别是肺功能和/或肝功能中使用。
具体实施方式
[0024]
定义
[0025]
在下文详细描述本发明之前，应理解，本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求限定。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科技术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
[0026]
优选地，本文所用的术语是如“a multilingual glossary of biotechnological terms:(iupac recommendations)”,leuenberger,h.g.w,nagel,b.和h.编辑(1995),helvetica chimica acta,ch-4010瑞士巴塞尔中所述定义的。
[0027]
贯穿本说明书及其后的权利要求，除非上下文另外要求，否则词语“包含(包括)(comprise)”以及变型如“包含(包括)(comprises)”和“包含(包括)(comprising)”将被理
解为暗示包括所陈述的整体或步骤或者多个整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者多个整体或步骤的组。
[0028]
贯穿本说明书的文本引用了若干文件(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书、genbank登录号、序列提交等)。本文的任何内容都不应解释为承认本发明因在先发明而无权早于此类披露内容。本文引用的一些文件的特征在于“通过引用并入”。在此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中叙述的定义或教导之间发生冲突的情况下，本说明书的文本优先。
[0029]
序列：本文提及的所有序列都在所附序列表中公开，所述序列表连同其全部内容和公开内容是本说明书的一部分。
[0030]
在本发明的上下文中，c5a特别是指人c5a。人c5a是一种74个氨基酸的肽，具有以下氨基酸序列：
[0031]
tlqkkieeia akykhsvvkk ccydgacvnn detceqraar islgprcika
[0032]
fteccvvasq lranishkdm qlgr(seq id no:1)。
[0033]
人c5的氨基酸序列可以在登录号uniprotkb p01031(co5_human)下找到。
[0034]
如本文所用，术语“c5a活性抑制剂”是指以任何方式降低c5a活性的任何化合物。这种活性降低可以通过直接或间接降低c5a的浓度，或通过降低c5a的活性，或通过防止c5a对其一种或多种受体(例如对c5ar或c5l2)发挥作用，或通过降低一种或多种c5a受体的浓度或活性来实现。
[0035]
在本发明的上下文中，表述“c5a受体”是指细胞表面上的任何潜在的c5a结合配体，尤其是指c5a可以与之结合并在所述受体上引发反应(例如所述受体的激活或抑制)的任何受体蛋白。术语“c5a受体”特别涵盖两种受体c5ar和c5l2。c5ar的替代名称是c5ar1和cd88。c5l2的替代名称是c5ar2。
[0036]
本发明的某些实施方案涉及干扰c5a受体(例如通过与c5a受体结合或通过阻断c5a受体的表达)的c5a抑制剂。在这些上下文中，术语“c5a受体”可以指代(i)c5ar或(ii)c5l2或(iii)c5ar和c5l2两者。这意味着一些c5a抑制剂仅干扰一种c5a受体(即c5ar或c5l2)，而其他c5a抑制剂干扰两种c5a受体(即c5ar和c5l2两者)。
[0037]
在本发明的上下文中，表述“蛋白质配体”是指由通过肽键连接的氨基酸构成，无论分子的总大小如何，并且能够与另一种分子特异性结合的任何分子。因此，表述“蛋白质配体”包括寡肽(≤100个氨基酸)和多肽(》100个氨基酸)。表述“蛋白质配体”还包括环肽，无论它们的大小如何。表述“蛋白质配体”特别涵盖抗体、抗体的抗原结合片段、抗体样蛋白和肽模拟物。
[0038]
如本文所用，如果第一化合物(例如蛋白质配体或核酸适配体)对第二化合物(例如靶蛋白)具有1mm或更小、优选100μm或更小、优选50μm或更小、优选30μm或更小、优选20μm或更小、优选10μm或更小、优选5μm或更小、更优选1μm或更小、更优选900nm或更小、更优选800nm或更小、更优选700nm或更小、更优选600nm或更小、更优选500nm或更小、更优选400nm或更小、更优选300nm或更小、更优选200nm或更小、甚至更优选100nm或更小、甚至更优选90nm或更小、甚至更优选80nm或更小、甚至更优选70nm或更小、甚至更优选60nm或更小、甚至更优选50nm或更小、甚至更优选40nm或更小、甚至更优选30nm或更小、甚至更优选20nm或更小、甚至更优选10nm或更小的解离常数kd，则认为所述第一化合物与所述第二化合物“结
合”。
[0039]
根据本发明的术语“结合”优选地涉及特异性结合。“特异性结合”意味着化合物(例如蛋白质配体或核酸适配体)与一种靶标(如其特异性的表位)的结合比与另一种靶标的结合更强。如果化合物以低于对第二靶标的解离常数(kd)的解离常数与第一靶标结合，则所述化合物与所述第一靶标的结合比所述第二靶标更强。优选地，对化合物特异性结合的靶标的解离常数(kd)是对化合物不特异性结合的靶标的解离常数(kd)的大于10分之一，优选大于20分之一，更优选大于50分之一，甚至更优选大于100分之一、200分之一、500分之一或1000分之一。
[0040]
如本文所用，术语“k
d”(通常以“mol/l”(有时缩写为“m”)测量)旨在指代化合物(例如蛋白质配体)与靶分子之间的特定相互作用的解离平衡常数。
[0041]
用于确定化合物的结合亲和力(即用于确定解离常数kd)的方法是本领域普通技术人员已知的并且可以例如从以下本领域已知的方法中选择：基于表面等离子体共振(spr)的技术、生物膜层干涉法(bli)、酶联免疫吸附测定(elisa)、流式细胞术、等温滴定量热法(itc)、分析型超速离心、放射免疫测定(ria或irma)和增强化学发光法(ecl)。典型地，解离常数kd是在20℃、25℃、30℃或37℃下确定的。如果没有另外特别指示，本文所叙述的kd值是在20℃下通过elisa确定的。
[0042]“表位”(也称为抗原决定簇)是大分子中被免疫系统(特别是被抗体、b细胞或t细胞)识别的部分。如本文所用，“表位”是大分子中能够与如本文所述的化合物(例如抗体或其抗原结合片段)结合的部分。在此上下文中，术语“结合”优选地涉及特异性结合。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别可以在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合会丧失，但是与后者的结合不会丧失。
[0043]“互补位”是抗体中与表位结合的部分。在本发明的上下文中，“互补位”是如本文所述的化合物(例如蛋白质配体)中与表位结合的部分。
[0044]
术语“抗体”典型地是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白或其抗原结合部分。术语“抗体”还包括所有重组形式的抗体，特别是本文所述的抗体，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化抗体、在真核生物(例如cho细胞)中表达的抗体、糖基化抗体以及如下所述的任何抗原结合抗体片段和衍生物。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为vh或vh)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为vl或v
l
)和轻链恒定区构成。vh和vl区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(cdr)，散布有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
[0045]
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”(或简言之“结合部分”)是指抗体的保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。已经证明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch结构域组成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接
的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)dab片段(ward等人,(1989)nature 341:544-546)，其由vh结构域组成；(vi)分离的互补决定区(cdr)；和(vii)两个或更多个分离的cdr的组合，所述两个或更多个分离的cdr可以任选地通过合成接头连接。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，从而使得它们能够成为单条蛋白质链，在其中vl和vh区配对以形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等人(1988)science 242:423-426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。另一例子是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽、(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链ch2恒定区和(iii)与ch2恒定区融合的免疫球蛋白重链ch3恒定区。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步披露于us 2003/0118592和us 2003/0133939中。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选所述片段。“抗原结合片段”的其他例子是所谓的微抗体，其源自单个cdr。例如，heap等人,2005描述了一种17个氨基酸残基的微抗体，其源自针对hiv-1的gp120包膜糖蛋白的抗体的重链cdr3(heap c.j.等人(2005)analysis of a 17-amino acid residue,virus-neutralizing microantibody.j.gen.virol.86:1791-1800)。其他例子包括包含两个或更多个相互融合(优选通过同源框架区)的cdr区的小抗体模拟物。qiu等人,2007已经描述了包含通过同源v
h fr2连接的v
h cdr1和v
l cdr3的这样一种小抗体模拟物(qiu x.-q.等人(2007)small antibody mimetics comprising two complementary-determining regions and a framework region for tumor targeting.nature biotechnology 25(8):921-929)。
[0046]
因此，如本文所用，术语“抗体或其抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。还包括通过包括例如噬菌体展示在内的技术选择以与靶分子或靶表位特异性结合的免疫球蛋白样蛋白。本发明的免疫球蛋白分子可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2(优选igg2a和igg2b)、igg3、igg4、iga1和iga2)或子类。
[0047]
可用于本发明的抗体及其抗原结合片段可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体或片段来自人、黑猩猩、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)、鸡、火鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗来源。特别优选的是，抗体具有人或鼠来源。用于在本发明中使用的抗体还包括这样的嵌合分子，其中源自一种物种(优选人)的抗体恒定区与源自另一种物种(例如小鼠)的抗原结合位点组合。此外，本发明的抗体包括这样的人源化分子，其中源自非人物种(例如源自小鼠)的抗体的抗原结合位点与人来源的恒定区和框架区组合。
[0048]
如本文所例示，本发明的抗体可以直接从表达所述抗体的杂交瘤获得，或者可以在宿主细胞(例如，cho细胞或淋巴细胞)中克隆和重组表达。宿主细胞的其他例子是微生物，如大肠杆菌(e.coli)和真菌(如酵母)。可替代地，它们可以在转基因非人动物或植物中重组产生。
[0049]
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与源自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而所述链的剩余区段与另一种物种或类别中的相应序列同源。典型地，轻链和重链两者的可变区都模拟源自一种哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分与源自另一种哺乳动物物种的抗体的序列同源。此类嵌合形式的一个明显优点是可变区可以便利地使用来自非人宿主生物的可容易获得的b细胞或杂交瘤与源自例如人细胞制品的恒定区的组合源自目前已知的来源。虽然可变区具有易于制备且特异性不受来源影响的优点，但当注射抗体时，人的恒定区比来自非人来源的恒定区更不可能引起人类受试者的免疫反应。然而，所述定义并不限于此特定例子。
[0050]
术语“人源化抗体”是指具有基本上源自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的剩余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域或仅包含移植到可变结构域中的适当框架区上的互补决定区(cdr)。抗原结合位点可以是野生型的或被一个或多个氨基酸取代修饰的，例如修饰以更接近地类似于人免疫球蛋白。人源化抗体的一些形式保留所有cdr序列(例如，人源化小鼠抗体，其含有来自小鼠抗体的所有六个cdr)。其他形式具有相对于原始抗体改变的一个或多个cdr。
[0051]
用于人源化抗体的不同方法是熟练技术人员已知的，如almagro和fransson,2008,frontiers in bioscience,13:1619-1633所综述，将其内容通过引用以其整体并入本文。almagro和fransson的综述文章简单总结于us 2012/0231008 a1(其是国际专利申请wo 2011/063980a1的国家阶段进入)中。将us 2012/0231008 a1和wo 2011/063980 a1的内容通过引用以其整体并入本文。
[0052]
如本文所用，“人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。本发明的人抗体包括从人免疫球蛋白文库或从对于一种或多种人免疫球蛋白而言是转基因的且不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体，如例如kucherlapati和jakobovits的美国专利号5,939,598中所述。
[0053]
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体对特定表位展示出单一结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体是由杂交瘤产生的，所述杂交瘤包括从非人动物(例如小鼠)获得的b细胞，所述b细胞与永生化细胞融合。
[0054]
如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体，如(a)从对于免疫球蛋白基因而言是转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或者由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化用于表达所述抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组的组合抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
[0055]
如本文所用，术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，如cho细胞、ns/0细胞、hek293细胞、hek293t细胞、植物细胞或真菌(包括酵母细胞)。
[0056]
如本文所用，关于产生这种抗体的转基因生物定义“异源抗体”。此术语是指这样的抗体，其具有对应于在不由转基因生物组成的生物中发现的氨基酸序列或编码核酸序
列，并且通常源自除转基因生物以外的物种。
[0057]
如本文所用，“异源杂交抗体”是指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异源杂交抗体。
[0058]
因此，适于在本发明中使用的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、多特异性抗体、重组抗体、异源抗体、异源杂交抗体、嵌合抗体、人源化(特别是cdr移植)抗体、去免疫抗体或人抗体、fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、由fab表达文库产生的片段、fd、fv、二硫键连接的fv(dsfv)、单链抗体(例如scfv)、双抗体(diabody)或四抗体(tetrabody)(holliger p.等人(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90(14),6444-6448)、纳米抗体(也称为单结构域抗体)、抗独特型(抗id)抗体(包括例如针对本文所述的抗体的抗id抗体)和上述任一种的表位结合片段。
[0059]
本文所述的抗体优选是分离的。如本文所用，“分离的抗体”旨在指代基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与c5a特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合除c5a以外的抗原的抗体)。然而，与人c5a的表位、亚型或变体特异性结合的分离的抗体可能与例如来自其他物种的其他相关抗原(例如c5a物种同源物，如大鼠c5a)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，“分离的”单克隆抗体的组合涉及具有不同特异性并且在明确定义的组合物中组合的抗体。
[0060]
如本文所用，如应用于对象的术语“天然存在的”是指对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物(包括病毒)中的可以从天然来源分离且尚未经实验室的人员有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0061]
如本文所用，术语“核酸适配体”是指已经通过重复多轮体外选择或selex(指数富集的配体系统进化)工程化以与靶分子结合的核酸分子(关于综述，参见：brody e.n.和gold l.(2000),aptamers as therapeutic and diagnostic agents.j.biotechnol.74(1):5-13)。核酸适配体可以是dna或rna分子。适配体可以含有修饰，例如经修饰的核苷酸(如2'-氟取代的嘧啶)，和/或可以包含一个或多个具有l-核糖单元(或l-脱氧核糖)而不是标准d-核糖单元(或d-脱氧核糖单元)的核苷酸。
[0062]
如本文所用，术语“抗体样蛋白”是指已经被工程化(例如通过环的诱变)以与靶分子特异性结合的蛋白质。典型地，这种抗体样蛋白包含至少一个在两端附接至蛋白支架的可变肽环。这种双重结构约束将抗体样蛋白的结合亲和力大大地增加至与抗体的结合亲和力相当的水平。可变肽环的长度典型地由10至20个氨基酸组成。支架蛋白可以是任何具有良好溶解特性的蛋白质。优选地，支架蛋白是小球状蛋白。抗体样蛋白包括但不限于亲和体(affibody)、亲和素(affilin)、亲和聚体(affimer)、亲和汀(affitin)、α抗体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)、亲合力多聚体(avimer)、darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)、fynomer、kunitz结构域肽和单抗体(monobody)(关于综述，参见：binz h.k.等人(2005)engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains.nat.biotechnol.23(10):1257-1268)。抗体样蛋白可以源自大型突变体文库，例如可以从大型噬菌体展示文库中淘选，并且可以以类似于常规抗体的方式分离。此外，可以通过球状蛋白中表面暴露的残基的组合诱变获得抗体样结合蛋白。抗体样蛋白有时被称为“肽适配体”或“抗体模拟物”。
[0063]
如本文所用，“肽模拟物”是设计用于模拟肽的小蛋白样链。肽模拟物典型地源自对现有肽的修饰以改变分子的特性。例如，它们可以源自改变分子的稳定性或生物学活性的修饰。这可以在从现有肽开发药物样化合物中发挥作用。这些修饰涉及天然不会发生的肽变化(如改变的骨架和非天然氨基酸的掺入)。
[0064]
在本发明的上下文中，术语“小分子”是指分子量为2kda或更小、优选分子量为1kda或更小的分子。术语“小分子”特别是指既不是寡肽也不是寡核苷酸的分子。
[0065]
在本发明的上下文中，通用表述“其中a与b竞争结合c”(例如在表述“其中所述抗体或其抗原结合片段与(a)下指示的抗体之一竞争结合c5a”中)用于定义位置a中所列化合物的结合特性。所述化合物a与c结合，并且化合物b也与c结合，但是化合物a和化合物b不能同时与c结合；即a和b与c上的相同表位(或至少与重叠表位)结合。在确定结合亲和力的上下文中，可以通过竞争elisa或通过基于表面等离子体共振(spr)的技术或通过上文所列的任何其他技术来确定结合中的这种竞争。如果没有另外明确陈述，通过elisa在20℃下使用等摩尔浓度的两种竞争性化合物来确定化合物的竞争性结合特性。
[0066]
ifx-1(替代名称：cacp29；inflarx gmbh，德国)是一种与c5a特异性结合的抗体。ifx-1的cdr序列和fr序列披露于wo 2015/140304 a1(表3)中，将其内容通过引用以其整体特此并入。它包含根据seq id no:34的可变重链序列和根据seq id no:359的可变轻链序列。
[0067]
inab708(inflarx gmbh，德国)是另一种与c5a特异性结合的抗体。inab708的cdr序列和fr序列也披露于wo 2015/140304 a1(表3)中，将其内容通过引用以其整体并入。它包含根据seq id no:36的可变重链序列和根据seq id no:37的可变轻链序列。
[0068]
medi-7814(medimmune)是一种重组人源化抗c5a抗体。与medi7814复合的人c5a的晶体结构可在rcsb蛋白质数据库中的4uu9(doi：10.2210/pdb4uu9/pdb)下获得。
[0069]
alxn-1007(alexion)是一种人源化抗c5a抗体。
[0070]
nox-d21(noxxon)是一种聚乙二醇化混合的l-rna/dna-适配体(spiegelmer
tm
)，序列为40kda peg-氨基己基-gcg aug(du)gg ugg uga agg guu guu ggg(du)gu cga cgc a(dc)g c(seq id no:34)。nox-d21靶向c5a(hyzewicz j,tanihata j,kuraoka m,nitahara-kasahara y,beylier t,ruegg ut,vater a和takeda s.2017.low-intensity training and the c5a complement antagonist nox-d21 rescue the mdx phenotype through modulation of inflammation.am.j.pathol.,187(5):1147-1161；印刷前电子出版：2017年3月18日)。
[0071]
依库珠单抗(替代名称：soliris
tm
，5g1-1；h5g1.1；alexion pharmaceuticals)是一种重组人源化单克隆igg2/4κ抗体，其通过鼠骨髓瘤细胞培养产生，并且通过标准生物工艺技术纯化。依库珠单抗与人c5特异性结合。依库珠单抗含有来自人igg2序列和人igg4序列的人恒定区以及移植到人框架轻链和重链可变区上的鼠互补决定区。依库珠单抗由两条448个氨基酸的重链和两条214个氨基酸的轻链构成，并且分子量为大约148kda。依库珠单抗的重链和轻链在例如wo 2016/061066 a1中分别披露为seq id no:1和seq id no:34。编码依库珠单抗的重链和轻链的核酸例如披露于美国专利号6,355,245中。
[0072]
alxn1210(替代名称：bnj441；alexion pharmaceuticals)是一种抗c5抗体。
alxn1210的重链和轻链在wo 2016/209956 a1中分别披露为seq id no:14和11。
[0073]
alxn5500(alexion)是一种人源化抗c5抗体。它是下一代依库珠单抗候选物。
[0074]
lfg316(替代名称：特度鲁单抗(tesidolumab)，nov-4；morphosys，novartis)是一种抗c5抗体。
[0075]
coversin
tm
(替代名称：ev 576；pas-coversin；rev 576；组织靶向性coversin
tm-akari；akari therapeutics，evolutec)是一种重组蛋白分子(16.7kda)，其源自来自非洲钝缘蜱(ornithodros moubata)蜱虫的唾液分子，在所述蜱虫中所述唾液分子帮助寄生虫在不引起宿主免疫反应的情况下进食。ev576蛋白(即coversin)的氨基酸序列以及其编码核苷酸序列示于wo 2008/029167的图2中。coversin
tm
与c5结合。
[0076]
ra101495(ra pharma)是c5的大环合成肽抑制剂(ricardo a,arata m,demarco s,dhamnaskar k,hammer r,fridkis-hareli m,rajagopal v,seyb k,tang g-q,tobe s和treco d.2015.preclinical evaluation of ra101495,a potent cyclic peptide inhibitor of c5 for the treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.blood 126:939)。
[0077]
(替代名称：抗c5适配体；arc-187；arc-1905；avacincaptad pegol钠；ophthotech corporation，archemix corporation)是一种抑制补体因子c5的聚乙二醇化rna适配体。arc1905(即zimura)的核苷酸序列在例如wo 2005/079363 a2中显示为seq id no:67，并且其结构示于wo 2005/079363 a2的图22中。
[0078]
amy-201(amyndas pharmaceuticals)是一种直接连接调控结构域和表面识别结构域的工程化形式的h因子；因此，它是一种微型fh分子。
[0079]
米考西普(mirococept)(替代名称：apt070和apt 070c；发起者：adprotech；开发者：inflazyme pharmaceuticals)由在重组细菌中制造并且用基于天然存在的膜结合的肉豆蔻酰静电开关肽的膜靶向两亲性肽修饰的人补体受体1的前三个短共有结构域组成(souza dg,esser d,bradford r,vieira at和teixeira mm.2005.apt070(mirococept),amembrane-localised complement inhibitor,inhibits inflammatory responses that follow intestinal ischaemia and reperfusion injury.br j pharmacol 145(8):1027-1034)。
[0080]
拜卡西奥单抗(bikaciomab)(novelmed)是称为nm001的抗bb因子抗体的f(ab)2片段。抗体nm001是由在atcc登录号pta-8543下保藏的杂交瘤细胞系1d3产生的。
[0081]
兰帕利珠单抗(lampalizumab)(替代名称：抗d因子fab；fcfd4514s；rg7417；tnx-234；发起者：tanox，开发者：genentech)是一种人源化抗d因子fab片段，其通过与因子d上的外位点(exosite)结合来抑制d因子和替代补体途径。
[0082]
aln-cc5(alnylam)是一种靶向人、灵长类动物和啮齿动物c5的rnai治疗剂。靶向c5基因的示例性irna组合物描述于wo 2016/044419中。
[0083]
阿伐可泮(avacopan)(也以名称ccx168而已知；chemocentryx)是一种小分子(mw＝581.66g/mol)，其具有根据式i的结构：
[0084][0085]
阿伐可泮的iupac/化学名称为(2r,3s)-2-[4-(环戊基氨基)苯基]-1-(2-氟-6-甲基苯甲酰基)-n-[4-甲基-3-(三氟甲基)苯基]哌啶-3-甲酰胺。阿伐可泮是c5ar的选择性抑制剂。在本发明的上下文中，术语“阿伐可泮”是指根据式i的化合物并且是指其生理上可耐受的盐。
[0086]
也适于实施本发明的与阿伐可泮类似的化合物披露于国际专利申请wo 2010/075257a1和wo 2011/163640 a1中，将其内容通过引用以其整体并入本文。因此，在一些实施方案中，c5a活性抑制剂是具有式ii的化合物
[0087][0088]
及其药学上可接受的盐、水合物和旋转异构体；其中
[0089]
c1选自芳基和杂芳基，其中杂芳基具有1-3个选自n、o和s的杂原子作为环成员；并且其中所述芳基和杂芳基任选地被1至3个r1取代基取代；
[0090]
c2选自芳基和杂芳基，其中杂芳基具有1-3个选自n、o和s的杂原子作为环成员；并且其中所述芳基和杂芳基任选地被1至3个r2取代基取代；
[0091]
c3选自c
1-8
烷基或杂烷基、c
3-8
环烷基、c
3-8
环烷基-c
1-4
烷基、芳基、芳基-c
1-4
烷基、杂芳基、杂芳基-c
1-4
烷基、杂环烷基或杂环烷基-c
1-4
烷基，其中杂环烷基基团或部分具有1-3个选自n、o和s的杂原子，并且其中杂芳基具有1-3个选自n、o和s的杂原子作为环成员，并且每个c3任选地被1-3个r3取代基取代；
[0092]
每个r1独立地选自卤素、-cn、-rc、-co2ra、-conrarb、-c(o)ra、-oc(o)nrarb、-nrbc(o)ra、-nrbc(o)2rc、-nr
a-c(o)nrarb、-nrac(o)nrarb、-nrarb、-ora和-s(o)2nrarb；其中每个ra和rb独立地选自氢、c
1-8
烷基和c
1-8
卤代烷基，或者当附接至同一氮原子时可以与氮原子组合以形成具有0至2个选自n、o或s的另外的杂原子作为环成员的五或六元环，并且任选地被一个或两个氧代基取代；每个rc独立地选自c
1-8
烷基或杂烷基、c
1-8
卤代烷基、c
3-6
环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，并且其中ra、rb和rc的脂族和环状部分任选地被一至三个卤素、羟基、甲基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基进一步取代；并且任选地当两个r1取代基在相邻原子上时组合以形成稠合五或六元碳环或杂环；
[0093]
每个r2独立地选自卤素、-cn、-no2、-rf、-co2rd、-conrdre、-c(o)rd、-oc(o)nrdre、-nrec(o)rd、-nrec(o)2rf、-nrdc(o)nrdre、-nrdc(o)nrdre、-nrdre、-ord和-s(o)2nrdre；其中每个
rd和re独立地选自氢、c
1-8
烷基和c
1-8
卤代烷基，或者当附接至同一氮原子时可以与氮原子组合以形成具有0至2个选自n、o或s的另外的杂原子作为环成员的五或六元环，并且任选地被一个或两个氧代基取代；每个r独立地选自c
1-8
烷基或杂烷基、c
1-8
卤代烷基、c
3-6
环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，并且其中rd、re和rf的脂族和环状部分任选地被一至三个卤素、羟基、甲基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基进一步取代，并且任选地当两个r2基团在相邻原子上时，将它们组合以形成五或六元环；
[0094]
每个r3独立地选自卤素、-cn、-ri、-co2rg、-conrgrh、-c(o)rg、-c(o)ri、-oc(o)nrgrh、-nrhc(o)rg、-nrhco2ri、-nrgc(o)nrgrh、-nrgrh、-org、-orj、-s(o)2nrgrh、-x
4-rj、-nh-x
4-rj、-o-x
4-rj、-x
4-nrgrh、-x
4-nhrj、-x
4-conrgrh、-x
4-nrhc(o)rg、-x
4-co2rg、-o-x
4-co2rg、-nh-x
4-co2rg、-x
4-nrhco2ri、-o-x
4-nrhco2ri、-nhrj和-nhch2rj，其中x4是c
1-4
亚烷基；每个rg和rh独立地选自氢、c
1-8
烷基或杂烷基、c
3-6
环烷基和c
1-8
卤代烷基，或者当附接至同一氮原子时可以与氮原子组合以形成具有0至2个选自n、o或s的另外的杂原子作为环成员的四、五或六元环，并且任选地被一个或两个氧代基取代；每个ri独立地选自c
1-8
烷基或杂烷基、c
1-8
卤代烷基、c
3-6
环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；并且每个rj选自c
3-6
环烷基、咪唑基、嘧啶基、吡咯啉基、哌啶基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基和s,s-二氧代-四氢硫代吡喃基，并且其中rg、rh、ri和rj的脂族和环状部分任选地被一至三个卤素、甲基、cf3、羟基、c
1-4
烷氧基、c
1-4
烷氧基-c
1-4
烷基、-c(o)o-c
1-8
烷基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基进一步取代，并且任选地当两个r3基团在相邻原子上时，将它们组合以形成五或六元环；并且
[0095]
x是氢或ch3。
[0096]
与阿伐可泮类似但具有改善的溶解度特征的化合物披露于wo 2017/176620 a2中，将其内容通过引用以其整体并入本文。因此，在一些其他实施方案中，c5a活性抑制剂是下式iii的化合物：
[0097][0098][0099]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0100]
r1选自h、-o-ch
2-o-p(o)oraorb、-o-c(o)-c
1-6
亚烷基-l
2-x1、o-p(o)oraorb和-o-c(o)-a
1-(c
1-3
亚烷基)
n-c
4-7
杂环基，其中c
4-7
杂环基任选地被1至6个rc基团取代；
[0101]
a1选自c
6-10
芳基、c
3-10
环烷基、c
5-10
杂芳基和c
5-10
杂环基，其中的每一个任选地被1至5个可以相同或不同的r
x
取代；
[0102]
n＝0或1；
[0103]
l2独立地选自键、-o-c(o)-c
1-6
亚烷基-和-nr
d-c(o)-c
1-6
亚烷基-；
[0104]
x1独立地选自-nrerf、-p(o)oraorb、-o-p(o)oraorb和-co2h；
[0105]
r2选自h、-l
3-c
1-6
亚烷基-l
4-x2、-l
3-(c
1-6
亚烷基)
m-a
2-x2、-p(o)oraoc(o)-c
1-6
烷基、-p(o)oranrgrh和-p(o)oraorb；
[0106]
l3独立地选自-c(o)-o-和-c(o)-；
[0107]
l4独立地选自键、-o-c(o)-c
2-6
亚烯基-、-o-c(o)-c
1-6
亚烷基-和-nr
d-c(o)-c
1-6
亚烷基-，其中-nr
d-c(o)-c
1-6
亚烷基-和-o-c(o)-c
1-6
亚烷基-中的c
1-6
亚烷基任选地被nrerf取代；
[0108]
x2独立地选自-nr
krl
、-p(o)oraorb、-o-p(o)oraorb和-co2h；
[0109]
m＝0或1；
[0110]
a2选自c
6-10
芳基、c
3-10
环烷基、c
5-10
杂芳基和c
5-10
杂环基，其中的每一个任选地被1至5个可以相同或不同的r
x
取代；
[0111]
r3是h或-l
5-p(o)oraorb，其中l5独立地选自键和-ch
2-o-；
[0112]
每个r
x
独立地选自卤素、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
杂烷基、cn、nr
yrz
、sry和ory；
[0113]
每个rc独立地选自卤素、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
杂烷基、cn、nr
yrz
、sry和ory；
[0114]
每个ra、rb、rd、re、rf、rg、rk、r
l
、ry和rz独立地选自h和c
1-6
烷基；
[0115]
每个rh独立地选自h和c
1-6
烷基，其中c
1-6
烷基任选地被1至5个独立地选自以下的取代基取代：co2h、nr
irj
、c
6-10
芳基、c
3-10
环烷基、c
5-10
杂芳基和c
5-10
杂环基，其中每个ri和rj独立地是h或c
1-6
烷基；
[0116]
其中r1、r2和r3中的两个是h，并且r1、r2和r3中的一个不是h。
[0117]
pmx-53是c5ar(cd88)的有效拮抗剂。它是由六个氨基酸构成的环状肽，具有以下序列：ac-phe-环(orn-pro-d-cha-trp-arg)，其中在orn-2与arg-6之间具有内酰胺桥。由于pmx-53含有至少一个d-氨基酸(即d-cha)，因此它不包括在本技术的随附序列表中。pmx-53可通过bio-techne gmbh(wiesbaden-nordenstadt，德国)商购获得，目录号5473。
[0118]
也适于实施本发明的与pmx-53类似的化合物披露于国际专利申请wo 99/00406a1、wo 03/033528a1和wo 2008/009062 a1中，将其通过引用以其整体并入本文。因此，在一些实施方案中，c5a活性抑制剂是式iv的环状肽或肽模拟化合物
[0119][0120][0121]
其中a是h、烷基、芳基、nh2、nh-烷基、n(烷基)2、nh-芳基、nh-酰基、nh-苯甲酰基、nhso3、nhso
2-烷基、nhso
2-芳基、oh、o-烷基或o-芳基；
[0122]
b是烷基、芳基、苯基、苄基、萘基或吲哚基团，或d-或l-氨基酸的侧链，但不是甘氨酸、d-苯丙氨酸、l-高苯丙氨酸、l-色氨酸、l-高色氨酸、l-酪氨酸或l-高酪氨酸的侧链；
[0123]
c是d-、l-或高氨基酸的侧链，但不是异亮氨酸、苯丙氨酸或环己基丙氨酸的侧链；
[0124]
d是中性d-氨基酸的侧链，但不是甘氨酸或d-丙氨酸的侧链、大平面侧链或大带电
荷侧链；
[0125]
e是大取代基，但不是d-色氨酸、l-n-甲基色氨酸、l-高苯丙氨酸、l-2-萘基l-四氢异喹啉、l-环己基丙氨酸、d-亮氨酸、l-芴基丙氨酸或l-组氨酸的侧链；
[0126]
f是l-精氨酸、l-高精氨酸、l-瓜氨酸或l-刀豆氨酸或其生物等排体的侧链；并且
[0127]
x1是-(ch2)nnh-或(ch2)ns-(其中n是从1至4的整数)；-(ch2)2o-；-(ch2)3o；-(ch2)
3-；-(ch2)
4-；-ch
2-cochrnh-；或-ch
2-chcochrnh-，其中r是任何常见或不常见氨基酸的侧链。
[0128]
在此上下文中，术语“常见氨基酸”是指由标准遗传密码定义的二十种蛋白质氨基酸。术语“不常见氨基酸”包括但不限于d-氨基酸，高氨基酸，n-烷基氨基酸，脱氢氨基酸，除苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以外的芳族氨基酸，邻、间或对氨基苯甲酸，鸟氨酸，瓜氨酸，刀豆氨酸，正亮氨酸，δ-谷氨酸，氨基丁酸，l-芴基丙氨酸，l-3-苯并噻吩基丙氨酸和α,α-二取代氨基酸。
[0129]
适于实施本发明的c5ar(cd88)的特定拮抗剂包括pmx95、pmx218、pmx200、pmx273、pmx205和pmx201，如wo 2008/009062 a1中所披露。
[0130]
克隆s5/1是一种识别c5a(cd88)的人受体的单克隆抗体。克隆s5/1是针对包含c5ar的n末端结构域(met1-asn31)的合成肽产生的。已经证明所述抗体可抑制c5a与其受体的结合。它可经由hycult biotech(荷兰乌登)商购获得，目录号hm2094。
[0131]
克隆7h110是一种识别c5a(cd88)的人受体的单克隆小鼠抗体。它可经由biomol gmbh(德国汉堡)商购获得；目录号c2439-60n。
[0132]
如本文所用，“患者”意指可以受益于用本文所述的化合物(即用本文所述的c5a活性抑制剂)治疗的任何哺乳动物或鸟类。优选地，“患者”选自实验动物(例如小鼠或大鼠)、家畜(包括例如豚鼠、兔、鸡、火鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗)或灵长类动物(包括黑猩猩和人)。特别优选的是，“患者”是人。
[0133]
如本文所用，疾病或障碍的“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指完成以下一项或多项：(a)降低障碍的严重程度和/或持续时间；(b)限制或预防所治疗的一种或多种障碍所特有的症状的发展；(c)抑制所治疗的一种或多种障碍所特有的症状的恶化；(d)限制或预防先前患有一种或多种障碍的患者的所述一种或多种障碍的复发；以及(e)限制或预防先前具有一种或多种障碍的症状的患者的症状的复发。
[0134]
如本文所用，疾病或障碍的“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”或“预防(prophylaxis)”意指预防在受试者中发生障碍。
[0135]“有效量”是足以达到预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量将随着诸如药剂的性质、施用途径、接受治疗剂的动物的大小和种类以及施用目的的因素而变化。每种单独情况下的有效量可以由熟练技术人员根据本领域确立的方法凭经验确定。
[0136]“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的用于在动物中、更特别是在人中使用。
[0137]
本发明的实施方案
[0138]
现在将进一步描述本发明。在以下段落中更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指示相反含义，否则下文定义的每个方面都可以与其他任何一个或多个方面组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征都可以与指示为优选或有利的其他任何一个或多个
特征组合。
[0139]
在第一方面，本发明涉及用于在治疗由冠状病毒感染引起或与之相关的医学病症中使用的c5a活性抑制剂，其中所述医学病症优选为(i)肺炎和/或(ii)发热。
[0140]
在第二方面，本发明涉及c5a活性抑制剂，用于在减少患有冠状病毒感染的受试者的炎症反应中使用。
[0141]
在第三方面，本发明涉及c5a活性抑制剂，用于在改善患有冠状病毒感染的受试者的器官功能、特别是肺功能和/或肝功能中使用。
[0142]
根据权利要求1至3中任一项所述的用于所述用途的c5a活性抑制剂，其中所述冠状病毒选自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2。
[0143]
冠状病毒是：一种典型地导致上呼吸道感染(uri)的感染人的常见病毒。已经鉴定出七种不同类型的人类冠状病毒。大多数人一生中将感染至少一种类型的冠状病毒。病毒通过咳嗽和打喷嚏、密切的个人接触、接触被病毒污染的物体或表面而通过空气传播，并且极少数地通过粪便污染传播。由大多数冠状病毒引起的疾病通常持续时间很短，并且其特征在于流鼻涕、咽喉痛、感觉不适、咳嗽和发热。
[0144]
据报道会引起重症症状的人类冠状病毒的非限制性例子包括mers-cov(引起中东呼吸综合征或mers的β冠状病毒)、sars-cov(引起严重急性呼吸综合征或sars的β冠状病毒)和新的2019新型冠状病毒(2019-ncov)爆发。
[0145]
在本发明的第一至第三方面的一个优选实施方案中，受试者患有sars、mers或covid-19，特别是covid-19。
[0146]
在本发明的第一至第三方面的一个优选实施方案中，所述治疗导致以下一项或多项：
[0147]-c反应蛋白的减少；
[0148]-发热的减少；
[0149]-血液中淋巴细胞计数的增加；
[0150]-降低alt/ast；和/或
[0151]-增加氧指数(pao2/fio2)。
[0152]
健康人的c反应蛋白通常在0-5mg/l的范围内。患有冠状病毒感染(例如covid-19)的患者具有约50mg/l(参见chen等人the lancet 2020oi.org/10.1016/s0140-6736)。因此，如果c反应蛋白降低至小于40mg/l、优选小于30mg/l、更优选小于10mg/l、更优选小于5mg/l，则实现c反应蛋白的降低。
[0153]
健康人的血液中的淋巴细胞计数通常在1.1至3.2x 109/l的范围内。患有轻度冠状病毒感染(例如covid-19)的患者在0.6至1.2x 109/l的范围内，中值为0.9x 109/l，而更严重的(例如covid-19)感染导致0.5至0.9x109/l的范围，中值为0.8x 109/l(参见wang等人jama doi:10.1001/jama.2020.1585)。因此，如果相应患者的淋巴细胞计数增加至少20％、优选至少50％、更优选至少100％，则实现血液中淋巴细胞计数的增加。按绝对值来说，本发明的用于所述用途的c5a抑制剂将患者的淋巴细胞计数增加到至少1.0x 109/l，更优选至少1.3x 109/l。
[0154]
健康人的丙氨酸转氨酶(alt)通常在9-50u/l的范围内。患有轻度冠状病毒感染(例如covid-19)的患者在15-36u/l的范围内，中值为23u/l，而更严重的(例如covid-19)感
染导致19-57u/l的范围，中值为35u/l(参见wang等人jama doi:10.1001/jama.2020.1585)。因此，如果相应患者的alt降低至少20％、优选至少50％、更优选至少100％，则实现alt的降低。
[0155]
健康人的天冬氨酸转氨酶(ast)通常在15-40u/l的范围内。患有轻度冠状病毒感染(例如covid-19)的患者在21-38u/l的范围内，中值为29u/l，而更严重的(例如covid-19)感染导致30-70u/l的范围，中值为52u/l(参见wang等人jama doi:10.1001/jama.2020.1585)。因此，如果相应患者的ast降低至少20％、优选至少50％、更优选至少100％，则实现ast的降低。
[0156]
健康患者的氧指数pao2/fio2在400-500mmhg的范围内。患有冠状病毒感染(例如covid-19)的患者在103-234mm hg的范围内，中值为136mmhg。因此，如果相应患者的氧指数pao2/fio2增加至少20％、优选至少50％、更优选至少100％，则实现氧指数pao2/fio2的增加。按绝对值来说，本发明的用于所述用途的c5a抑制剂将患者的氧指数pao2/fio2增加到至少250mm hg，更优选至少300mm hg。
[0157]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，c5a活性抑制剂：
[0158]-降低c5的浓度(例如，通过抑制c3转化酶的形成和/或活性；通过抑制c5转化酶的形成和/或活性；通过抑制c5基因的转录；通过阻断c5 mrna的翻译；通过增加c5 mrna的降解；通过增加c5蛋白的降解；或通过防止c5从肝脏中分泌)；
[0159]-抑制c5切割为c5a和c5b(例如，通过抑制c5转化酶或通过与c5上的切割位点结合，从而阻断切割)；
[0160]-降低c5a的浓度(例如，通过增加c5a蛋白的降解)；
[0161]-抑制c5a与c5a受体之间的结合(例如，通过与c5a结合或通过与c5a受体结合)；
[0162]-降低c5a受体的浓度(例如，通过抑制c5a受体基因的转录；通过阻断c5a受体mrna的翻译；通过增加c5a受体mrna的降解；通过增加c5a受体蛋白的降解)；和/或
[0163]-抑制c5a受体的活性。
[0164]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，c5a活性抑制剂选自蛋白质配体(如上所定义)；寡核苷酸；和小分子(如上所定义)。充当c5a活性抑制剂的寡核苷酸可以例如通过与核酸分子结合(从而抑制转录和/或翻译)或通过与蛋白质结合(例如当寡核苷酸是核酸适配体时)来实现它们的抑制作用。
[0165]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，c5a活性抑制剂是与c5蛋白或与c5a蛋白或与c5a受体蛋白特异性结合的蛋白质配体。在其他实施方案中，蛋白质配体选自：
[0166]
(i)抗体(例如抗c5抗体、抗c5a抗体、抗c5ar抗体或抗c5l2抗体)，
[0167]
(ii)抗体的抗原结合片段，
[0168]
(iii)抗体样蛋白，
[0169]
(iv)c5a的抑制性变体，
[0170]
(v)c5a受体的抑制性变体(例如诱饵受体)，
[0171]
(vi)作用于补体途径的蛋白质(例如coversin)，和
[0172]
(vii)肽(例如ra101495(ra pharma，马萨诸塞州剑桥)；pmx-53(bio-techne gmbh(德国威斯巴登诺丹斯塔德))。
[0173]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，c5a活性抑制剂是蛋白质配体或寡核苷
酸，优选蛋白质配体，所述蛋白质配体或寡核苷酸与由人c5a的氨基酸序列ndetceqra(seq id no:2)和shkdmql(seq id no:3)形成的构象表位特异性结合。与由根据seq id no:2和3的氨基酸序列形成的构象表位结合意味着蛋白质配体或寡核苷酸与根据seq id no:2的氨基酸序列内的至少一个氨基酸结合并且与根据seq id no:3的氨基酸序列内的至少一个氨基酸结合。seq id no:2对应于人c5a的氨基酸30-38。seq id no:3对应于人c5a的氨基酸66-72。
[0174]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体或寡核苷酸、优选蛋白质配体与根据detceqr(seq id no:4)的氨基酸序列内的至少一个氨基酸结合。seq id no:4对应于人c5a的氨基酸31-37。
[0175]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体或寡核苷酸、优选蛋白质配体与根据hkdmq(seq id no:5)的氨基酸序列内的至少一个氨基酸结合，更优选与氨基酸序列kdm内的至少一个氨基酸结合。seq id no:5对应于人c5a的氨基酸67-71；序列kdm对应于人c5a的氨基酸68-70。
[0176]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体或寡核苷酸、优选蛋白质配体与氨基酸序列detceqr(seq id no:4)内的至少一个氨基酸结合并且与氨基酸序列hkdmq(seq id no:5)内的至少一个氨基酸结合。
[0177]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体或寡核苷酸、优选蛋白质配体与氨基酸序列detceqr(seq id no:4)内的至少一个氨基酸结合并且与氨基酸序列kdm内的至少一个氨基酸结合。
[0178]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，形成c5a的构象表位的两个序列(例如根据seq id no:2和3；seq id no:4和5；或seq id no:4和序列kdm的序列对)由不参与与本发明的结合部分结合的1-50个连续氨基酸隔开。在下文中，此类不参与与本发明的结合部分结合的氨基酸将被称为“非结合氨基酸”。形成构象表位的两个序列优选由6-45个连续非结合氨基酸、更优选由12-40个连续非结合氨基酸、更优选由18-35个连续非结合氨基酸、更优选由24-30个连续非结合氨基酸、更优选由25-29个连续非结合氨基酸、甚至更优选由26-28个连续非结合氨基酸、最优选由27个连续非结合氨基酸隔开。
[0179]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，与c5a的构象表位特异性结合的蛋白质配体或寡核苷酸、优选蛋白质配体与人c5a具有这样的结合常数，其中kd值为10nm或更小、优选9nm或更小、更优选8nm或更小、更优选7nm或更小、更优选6nm或更小、更优选5nm或更小、更优选4nm或更小、更优选3nm或更小、更优选2nm或更小、甚至更优选1nm或更小。在本发明的任何方面的一些实施方案中，结合部分与人c5a之间的解离常数kd在1pm(皮摩尔)与5nm(纳摩尔)之间、更优选在2pm与4nm之间、更优选在5pm与3nm之间、更优选在10pm与2nm之间、更优选在50pm与1nm之间、更优选在100pm与900pm之间、更优选在200pm与800pm之间、更优选在300pm与700pm之间、甚至更优选在400pm与600pm之间。
[0180]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，与c5a特异性结合的蛋白质配体或寡核苷酸、优选蛋白质配体展现出对由一种分子c5a(特别是人c5a)诱导的生物学效应的至少75％的阻断活性、优选至少80％的阻断活性、更优选至少85％的阻断活性、更优选至少90％的阻断活性、更优选至少95％的阻断活性。这些特定的阻断活性是指这样的实施方案，其中结合部分包含与c5a、优选人c5a结合的单个互补位。在其中结合部分包含两个或更多个c5a
特异性互补位的实施方案中，当一个结合部分分子与一定数量的c5a分子(等于结合部分中存在的c5a特异性互补位的数量)接触时，实现至少75％、优选至少80％、更优选至少85％等的所述阻断活性。换言之，当本文所述的结合部分的互补位和c5a以等摩尔浓度存在时，结合部分展现出对由c5a诱导的生物学效应的至少75％的阻断活性、优选至少80％的阻断活性、更优选至少85％的阻断活性、更优选至少90％的阻断活性、更优选至少95％的阻断活性。一种优选的待被阻断的生物学效应是c5a诱导的溶菌酶从人全血细胞中的释放。用于确定这种c5a诱导的溶菌酶释放及其阻断的测定描述于例如wo 2011/063980a1和相应的美国国家阶段申请us 2012/0231008 a1中。
[0181]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
[0182]
(i)如seq id no:6所示的重链cdr3序列；或
[0183]
(ii)如seq id no:7所示的重链cdr3序列；
[0184]
其中重链cdr3序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加。
[0185]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
[0186]
(iii)如seq id no:8所示的轻链cdr3序列；或
[0187]
(iv)如seq id no:9所示的轻链cdr3序列；
[0188]
其中轻链cdr3序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加。
[0189]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
[0190]
(i)如seq id no:6所示的重链cdr3序列和如seq id no:8所示的轻链cdr3序列；或
[0191]
(ii)如seq id no:7所示的重链cdr3序列和如seq id no:9所示的轻链cdr3序列；
[0192]
其中重链cdr3序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；并且
[0193]
其中轻链cdr3序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加。
[0194]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下序列中的至少一个：
[0195]
(v)根据seq id no:10的重链cdr2序列；
[0196]
(vi)根据seq id no:11的重链cdr2序列；
[0197]
(vii)根据seq id no:12的轻链cdr2序列；
[0198]
(viii)根据seq id no:13的轻链cdr2序列；
[0199]
(ix)根据seq id no:14的重链cdr1序列；
[0200]
(x)根据seq id no:15的重链cdr1序列；
[0201]
(xi)根据seq id no:16的轻链cdr1序列；或
[0202]
(xii)根据seq id no:17的轻链cdr1序列；
[0203]
其中重链cdr2序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；
[0204]
其中轻链cdr2序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；
[0205]
其中重链cdr1序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；并且
[0206]
其中轻链cdr1序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加。
[0207]
在特定实施方案中，在根据seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16和seq id no:17的每个氨基酸序列中上文所叙述的这些任选变化的总数(即每个序列中交换、缺失和添加的总数)是1或2。
[0208]
在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段中存在的所有cdr的交换、缺失和添加累计的总数在1与5之间(例如1、2、3、4或5)。
[0209]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，包含如下表1所列的重链cdr3、重链cdr2和重链cdr1序列的a至h集之一，
[0210]
其中每个重链cdr3序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；
[0211]
其中每个重链cdr2序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；并且
[0212]
其中每个重链cdr1序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加。
[0213]
表1：适于在本发明的抗体或其片段中使用的重链cdr序列集
[0214][0215][0216]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，包含如表2所列的轻链cdr3、轻链cdr2和轻链cdr1序列的以下i至iv集之一，其中每个轻链cdr3序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；
[0217]
其中每个轻链cdr2序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；并且
[0218]
其中每个轻链cdr1序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加。
[0219]
表2：适于在本发明的抗体或其片段中使用的轻链cdr序列集
[0220]
由于抗体ifx-1的cdr2轻链序列(seq id no:12)与抗体inab708的cdr2轻链序列(seq id no:13)相同，因此包括seq id no:13的集对于包括seq id no:12的集来说将是冗余的。因此，该表仅列出了四个轻链cdr序列集。
[0221]
轻链集编号cdr3序列cdr2序列cdr1序列iseq id no:8seq id no:12seq id no:16iiseq id no:8seq id no:12seq id no:17iiiseq id no:9seq id no:12seq id no:16ivseq id no:9seq id no:12seq id no:17
[0222]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，包含上表1中所列的重链cdr集a-h之一和上表2中所列的轻链cdr集i-iv之一，即以下集的组合之一：a-i、a-ii、a-iii、a-iv、b-i、b-ii、b-iii、b-iv、c-i、c-ii、c-iii、c-iv、d-i、d-ii、d-iii、d-iv、e-i、e-ii、e-iii、e-iv、f-i、f-ii、f-iii、f-iv、g-i、g-ii、g-iii、g-iv、h-i、h-ii、h-iii或h-iv(其中组合a-i和h-iv是特别优选的)，
[0223]
其中每个重链cdr3序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；
[0224]
其中每个重链cdr2序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；
[0225]
其中每个重链cdr1序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；
[0226]
其中每个轻链cdr3序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，特别是保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；
[0227]
其中每个轻链cdr2序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加；并且
[0228]
其中每个轻链cdr1序列任选地包含1、2或3个氨基酸交换，优选保守氨基酸交换；1、2或3个氨基酸缺失；和/或1、2或3个氨基酸添加。
[0229]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，包含含有(i)ifx-1的vh结构域或(ii)inab708的vh结构域、基本上由其组成或由其组成的vh结构域。
[0230]
定义ifx-1和inab708的vh结构域的fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4序列示于下表3中。
[0231]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，蛋白质配体是抗体或其抗原结合片段，包含含有(i)ifx-1的vl结构域或(ii)inab708的vl结构域、基本上由其组成或由其组成的vl结构域。
[0232]
定义ifx-1和inab708的vl结构域的fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4序列示于下表3中。
[0233]
表3：抗体ifx-1和inab708的cdr和fr序列(chothia分类方式)
[0234][0235]
在一些实施方案中，用于在本发明中使用的抗体或其抗原结合片段包含：
[0236]
(i)具有根据seq id no:34的氨基酸序列的可变重链和具有根据seq id no:35的氨基酸序列的可变轻链序列或与seq id no:34和35具有至少90％、至少93％或至少95％氨基酸序列同一性的变体，所述变体包含如上所述的轻链和重链cdr1至cdr3或其变体的根据seq id no:6、8、10、12、14和16的氨基酸序列；
[0237]
(ii)具有seq id no:36的氨基酸序列的可变重链序列和具有根据seq id no:37的氨基酸序列的可变轻链序列或与seq id no:36和37具有至少90％氨基酸序列同一性的变体，所述变体包含如上所述的轻链和重链cdr1至cdr3或其变体的根据seq id no:7、9、11、13、15和17的氨基酸序列。
[0238]
在以上方面，cdr没有变化或具有最小的变化，即如上所概述的1、2或3个氨基酸，并且大部分氨基酸修饰是在框架区中。
[0239]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，c5a活性抑制剂是与c5或与c5a或与c5a受体特异性结合的寡核苷酸。在其他实施方案中，寡核苷酸是核酸适配体。核酸适配体可以
选自dna适配体、d-rna适配体和l-rna适配体(例如，spiegelmers
tm
)。
[0240]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，c5a活性抑制剂降低c5蛋白或c5a受体蛋白的表达。在其他实施方案中，所述降低c5蛋白或c5a受体蛋白的表达的c5a活性抑制剂是选自反义dna、反义rna、sirna和mirna的寡核苷酸。
[0241]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，c5a受体是c5ar和/或c5l2。在本发明的任何方面的优选实施方案中，c5a受体是c5ar(也称为cd88或c5ar1)。
[0242]
在本发明的任何方面的一些实施方案中，c5a活性抑制剂选自：
[0243]
(a)ifx-1、inab708、medi-7814、alxn-1007或nox-d21，或其抗原结合片段；
[0244]
(b)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与(a)下所指示的抗体之一竞争结合c5a；
[0245]
(c)依库珠单抗、alxn1210、alxn5500或lfg316，或其抗原结合片段；
[0246]
(d)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与(c)下所指示的抗体之一竞争结合c5；
[0247]
(e)coversin或ra101495；
[0248]
(f)抗体或其抗原结合片段或蛋白质或大环肽，其中所述抗体或其抗原结合片段或大环肽与(e)下所指示的蛋白质或肽之一竞争结合c5；
[0249]
(g)zimura；
[0250]
(h)抗体或其抗原结合片段或适配体，其中所述抗体或其抗原结合片段或适配体与zimura竞争结合c5；
[0251]
(i)amy-201或米考西普；
[0252]
(j)抗体或其抗原结合片段或蛋白质，其中所述抗体或其抗原结合片段或蛋白质与(i)下所指示的蛋白质之一竞争结合c3b；
[0253]
(k)拜卡西奥单抗；
[0254]
(l)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与拜卡西奥单抗竞争结合因子b；
[0255]
(m)兰帕利珠单抗；
[0256]
(n)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与兰帕利珠单抗竞争结合因子d；
[0257]
(o)aln-cc5；
[0258]
(p)阿伐可泮或根据式ii或iii的化合物或pmx-53或根据式iv的化合物；
[0259]
(q)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与阿伐可泮或pmx-53竞争结合c5ar；
[0260]
(r)克隆s5/1或克隆7h110，或其抗原结合片段；和
[0261]
(s)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与(r)下所指示的抗体之一竞争结合c5ar。
[0262]
药物组合物和施用方式
[0263]
在本发明的任何方面的实践中，化合物(例如本文所述的c5a活性抑制剂)或包含所述化合物的药物组合物可以通过本领域确立的任何途径施用至患者，所述途径在患者中提供足够水平的化合物。它可以全身或局部施用。这种施用可以是肠胃外的、经粘膜的(例
如，口服的、经鼻的、经直肠的、阴道内的、舌下的、粘膜下的)、经皮的或通过吸入。优选地，施用是肠胃外的，例如经由静脉内或腹膜内注射，并且还包括但不限于动脉内、肌内、皮内和皮下施用。如果局部施用本文所述的化合物(例如本文所述的c5a活性抑制剂)或包含所述化合物的药物组合物，则可以将它直接注射到待治疗的器官或组织中。
[0264]
适于口服施用的药物组合物可以以胶囊剂或片剂；以散剂或颗粒剂；以溶液剂、糖浆剂或混悬剂(在水性或非水性液体中)；以可食用的泡沫剂或甜品(whip)；或以乳剂提供。片剂或硬明胶胶囊剂可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软明胶胶囊剂可以包含植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。溶液剂和糖浆剂可以包含水、多元醇和糖。
[0265]
可以用延迟活性剂在胃肠道中的崩解和/或吸收的材料对旨在用于口服施用的活性剂进行包被或混合(例如，可以使用单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)。因此，活性剂的持续释放可以在多个小时内实现，并且如果需要，可以保护活性剂免于在胃内降解。由于特定的ph或酶促条件，可以配制用于口服施用的药物组合物以促进活性剂在特定胃肠道位置处的释放。
[0266]
适于经皮施用的药物组合物可以以离散的贴剂提供，旨在与接受者的表皮保持长时间的密切接触。适于外用施用的药物组合物可以以软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂提供。对于外用施用至皮肤、口腔、眼部或其他外露组织，优选使用外用软膏剂或乳膏剂。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。可替代地，可以用水包油乳基质或油包水基质将活性成分配制成乳膏剂。适于外用施用至眼部的药物组合物包括滴眼剂。在这些组合物中，可以将活性成分溶解或悬浮于合适的载体中，例如水性溶剂中。适于在口腔中外用施用的药物组合物包括糖锭剂(lozenge)、锭剂(pastille)和漱口剂。
[0267]
适于经鼻施用的药物组合物可以包含固体载体，如粉末(优选具有在20至500微米范围内的粒度)。散剂可以以吸鼻烟的方式(即，通过鼻子从靠近鼻子的保持散剂的容器中快速吸入)施用。可替代地，适于经鼻施用的组合物可以包含液体载体，例如鼻用喷雾剂或滴鼻剂。这些组合物可以包含活性成分的水溶液或油溶液。用于通过吸入施用的组合物可以在特别适合的装置中提供，所述装置包括但不限于加压气雾剂、喷雾器或吹入器，它们可以构造成提供预定剂量的活性成分。药物组合物也可以经由鼻腔施用至肺。
[0268]
适于直肠施用的药物组合物可以以栓剂或灌肠剂提供。适于阴道施用的药物组合物可以以阴道栓、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂配制品提供。
[0269]
适于肠胃外施用的药物组合物包括水性和非水性无菌注射溶液剂或混悬剂，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与预期接受者的血液基本上等渗的溶质。例如，可以存在于此类组合物中的其他组分包括水、醇、多元醇、甘油和植物油。适于肠胃外施用的组合物可以提供在单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿瓶和小瓶)中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要恰在使用前添加无菌液体载体(例如，无菌注射用盐水溶液)。临时注射溶液剂和混悬剂可以由无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。
[0270]
在一个优选实施方案中，本文所述的化合物(例如本文所述的c5a活性抑制剂)根据常规程序被配制为适于静脉内施用至人的药物组合物。典型地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂(如
利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。通常，将成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在气密密封的容器中的干燥的冻干粉或无水浓缩物，所述气密密封的容器如指明活性剂的量的安瓿瓶或小药囊。在通过输注施用组合物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶进行配药。在通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿瓶无菌盐水，使得可以在施用前将成分混合。
[0271]
在另一个实施方案中，例如，可以在控释系统中递送化合物(例如本文所述的c5a活性抑制剂)或包含所述化合物的药物组合物。例如，可以使用静脉内输注、植入式渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其他施用方式来施用化合物。在一个实施方案中，可以使用泵(参见sefton(1987)crc crit.ref.biomed.eng.14:201；buchwald等人(1980)surgery 88:507；saudek等人(1989)n.eng.j.med.321:574)。在另一个实施方案中，可以在囊泡(特别是脂质体)中递送化合物(参见langer(1990)science 249:1527-1533；treat等人(1989)liposomes in the therapy of infectious disease and cancer,lopez-berestein和fidler(编辑),liss,纽约州,353-365；wo 91/04014；u.s.4,704,355)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参见medical applications of controlled release(1974)langer和wise(编辑),crc press:佛罗里达州博卡拉顿；controlled drug bioavailability,drug product design and performance,(1984)smolen和ball(编辑),wiley:纽约州；ranger和peppas(1953)j.macromol.sci.rev.macromol.chem.23:61；还参见levy等人(1985)science 228:190；during等人(1989)ann.neurol.25:351；howard等人(1989)j.neurosurg.71:105)。
[0272]
在又另一个实施方案中，可以将控释系统放置在治疗靶点(即，靶细胞、组织或器官)附近，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见例如，goodson(1984)115-138medical applications of controlled release,第2卷)。langer(1990,science 249:1527-1533)的综述中讨论了其他控释系统。
[0273]
在一个具体实施方案中，可能需要将本文所述的化合物(例如本文所述的c5a活性抑制剂)或包含所述化合物的药物组合物局部施用至需要治疗的区域。这可以通过例如但不限于以下的方式来实现：手术期间的局部输注、外用应用(例如，与手术后的伤口敷料结合)、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜(如硅橡胶膜)或纤维。
[0274]
优选的有效剂量的选择将由熟练技术人员基于考虑本领域普通技术人员已知的若干因素来确定。此类因素包括药物组合物(例如多肽或载体)的特定形式及其药代动力学参数，如生物利用度、代谢、半衰期等，这些参数将在典型地用于获得药物化合物的监管批准的常规开发程序中确定。考虑剂量的其他因素包括待预防和或治疗的病症或疾病或待在正常个体中获得的益处、患者的体重、施用途径、施用是急性还是慢性、伴随药物治疗和熟知的影响施用的药剂的功效的其他因素。因此，应当根据从业者的判断和每名患者的情况，例如，根据标准临床技术，根据个体患者的病症和免疫状态来决定准确的剂量。
[0275]
本发明的c5a活性抑制剂(特别是ifx-1)的优选剂量是每天200mg至500mg、优选每天250mg至350mg、更优选每天300mg的剂量。优选每天一次，更优选用在第1天、第2天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天施用c5a活性抑制剂(特别是ifx-1)的剂量方案应用所述剂量。
[0276]
优选地，通过肠胃外应用、更优选静脉内施用来施用c5a活性抑制剂，特别是ifx-1。
附图说明
[0277]
图1.sars-cov、mers-cov和sars-cov 2的核衣壳蛋白与masp-2结合。
[0278]
(a)在2mm cacl2或1mm edta的存在下，使来自用gfp-n和gfp-载体转染的293t细胞的裂解物经受用缀合至琼脂糖珠的flag标记的全长(fl)masp-2或截短突变体(cub1-egf-cub2和ccp1-ccp2-sp)进行的免疫沉淀。用抗gfp和抗flag抗体进行免疫印迹。将孵育的igg珠和flag珠用作阴性对照。(b)将来自用flag-n或flag-载体转染的293t细胞的裂解物与人血清(hs)和小鼠血清(ms)混合，并且使其经受用抗flag琼脂糖珠进行的免疫沉淀。用抗flag和抗masp-2抗体探测吸附物。将纯化的重组masp-2上样作为标记。(c)在2mm cacl2的存在下，使来自用全长gfp-n及其突变体δ321-323和δ116-124转染的293t细胞的裂解物经受用masp-2-flag缀合的琼脂糖珠进行的免疫沉淀，并且通过用抗gfp和抗flag抗体进行的免疫印迹进行分析。(d)在2mm cacl2的存在下，使来自表达gfp-mers-cov n及其截短突变体δ104-112的293t细胞的裂解物经受用masp-2-flag缀合的琼脂糖珠进行的免疫沉淀，并且如上文所提及的进行分析。(e)在2mm cacl2的存在下，使来自表达sars-cov-2的ha标记的n的293t细胞的裂解物经受用masp-2-flag缀合的琼脂糖珠进行的免疫沉淀，用抗ha和抗flag抗体探测吸附物。
[0279]
图2.核衣壳蛋白诱导masp-2自体激活和c4切割。
[0280]
(a)将来自表达masp-2-myc的细胞的裂解物与纯化的n或mbl混合，并且在2mm cacl2的存在下，使其经受用masp-2-flag缀合的琼脂糖珠进行的免疫沉淀。用抗myc抗体进行免疫印迹。(b)将纯化的masp-2-flag在有/没有n、mbl和甘露聚糖的情况下在37℃下孵育12h。用抗flag抗体探测被切割的masp-2。(c)在4℃下，在甘露聚糖包被的板中，将纯化的masp-2和n蛋白在有/没有抗n单克隆抗体的情况下与预缀合的mbl一起孵育。用抗masp-2抗体检测masp-2的结合。通过非配对双尾学生t检验，相比于hsa的*p《0.05和**p《0.01。(d)将c4与masp-2、mbl、甘露聚糖、n蛋白和hsa在37℃下一起孵育1h、6h、12h和24h。用抗c4α链抗体检测c4和被切割的截短c4片段。(e)将c4与masp-2、mbl、甘露聚糖、n蛋白、c1inh或masp-2单克隆抗体在37℃下一起孵育1h。用c4α链抗体检测c4和被切割的c4。(f-h)c4b沉积与sars-cov、hcov-229e、sars-cov-2和mers-cov的n蛋白浓度相关。
[0281]
图3.n蛋白在体内增强lps诱导的肺炎
[0282]
(a)将balb/c小鼠(10只/组)经由尾静脉用1
×
109pfu ad-sars n/ad-空或盐水对照感染，并且在第6天经由尾静脉给予lps(5mg/kg)。在lps注射前30min经由尾静脉注射抗masp-2抗体(200μg/kg)或c1inh(4mg/kg)。记录小鼠的死亡率，通过gehan-breslow-wilcoxon检验的*p《0.05和**p《0.01。将肺石蜡切片通过he染色进行分析(b)。将小鼠经由尾静脉用1
×
108pfu ad-sars n/ad-空感染，并且在第6天通过滴鼻法和经由尾静脉给予lps(5mg/kg)。lps激发后6h将小鼠处死。将冷冻肺切片用抗c4b抗体染色(c)。如红色信号所指示的，通过原位pla测量冷冻肺切片中sars-cov n和masp-2复合物的形成。将沉积的c3片段用fitc标记的抗c3c抗体染色(绿色)，比例尺＝50μm(d)。(e)将小鼠用1
×
109pfu ad-mers n/ad-空预感染并且如上文所提及的用lps、抗体或c1inh处理，观察存活的小鼠。(f)
使masp2-/-和masp2
+/+
c57bl/6n小鼠感染表达n的腺病毒并且如上文所提及的注射lps，观察存活的小鼠。
[0283]
图4.covid-19患者中的补体激活
[0284]
(a-e)将来自死后尸检的多聚甲醛固定的肺组织用于石蜡组织切片以及用抗mbl、抗masp-2、抗c4α链、抗c3或c5b-9进行的免疫组织化学染色。用olympus bx52显微镜在10
×
物镜下进行显微摄影。(f)将来自健康人、轻症或重症covid-19患者的血清c5a通过elisa进行分析。
[0285]
图5.用抗c5a抗体治疗covid-19患者
[0286]
(a)两名患者的疾病发作、sars-cov-2rna检测和住院治疗的时间线。(b)1号患者(左)和2号患者(右)中的流速、高流量鼻氧吸入分数(fio2)、经皮氧饱和度(spo2)和氧合指数(pao2/fio2)或spo2/fio2。(c)1号患者(左)和2号患者(右)的体温(temp)、c反应蛋白(crp)水平和血液淋巴细胞数(lym)变化。(d)1号患者(左)和2号患者(右)的肝功能变化。alt：丙氨酸转氨酶；ast：天冬氨酸转氨酶；tp：总蛋白；alb：白蛋白。
[0287]
图6.mbl途径被sars/mers-cov或sars-cov-2的n蛋白过度激活的示意图
[0288]
(a)病毒与细胞表面结合并且s蛋白激活mbl。(b)病毒进入细胞并且表达包括n蛋白在内的病毒蛋白。(c)n蛋白在细胞被病毒复制和免疫系统攻击裂解后释放。(d)细胞外可溶性n蛋白二聚体与masp-2相互作用，诱导masp-2自体激活和与mbl结合。(e)masp-2的加速激活诱导mbl途径下游的补体级联过度激活，并且通过分泌或补体介导的细胞毒性促进细胞裂解和n蛋白释放，这可能导致不受控制的组织损伤和炎症。
[0289]
图7.鉴定参与与masp-2相互作用的n蛋白的关键基序。
[0290]
(a)masp-2和sars-cov n蛋白的结构域和突变体。(b)在2mm cacl2的存在下，使来自用全长gfp-n(1-422)及其截短突变体1-176、176-251、252-361和362-422转染的293t细胞的裂解物经受用masp-2-flag缀合的琼脂糖珠进行的免疫沉淀，并且通过用抗gfp和抗flag抗体进行的免疫印迹进行分析。将与来自用flag-载体(pcdna3-flag)转染的细胞的裂解物一起孵育的flag珠用作阴性对照。(c)n蛋白二聚化的免疫沉淀分析。将来自表达flag标记的sars-cov n、hcov-229e n或sars-cov n的突变体(δ281-322、δ321-323)的293t细胞的裂解物与抗flag琼脂糖珠一起孵育，并且使n缀合的琼脂糖珠平衡并且经受用来自表达相应的gfp标记的n蛋白的293t细胞的裂解物进行的免疫沉淀，并且通过用抗gfp进行的免疫印迹进行分析。(d)sars-cov n、mers-cov n、hku5-cov n、sars-cov-2n和bat-sars样cov n序列的比较。二级结构要素是基于espript算法定义的。线指示螺旋，并且箭头表示β链。
[0291]
图8.
[0292]
sars-cov和mers-cov的n蛋白加速补体凝集素途径级联。(a)图2d中提及的c4切割率是在密度分析和绘图后根据公式截短的c4/(截短的c4+剩余的c4)
×
100％计算的。数据提供为三个测试的平均值
±
s.d.。通过非配对双尾学生t检验，*p《0.05和**p《0.01。(b)图2e中提及的c4切割率的密度分析。(c)将c4与masp-2、mbl、甘露聚糖、mers-cov n蛋白或突变型n蛋白在37℃下一起孵育1h或2h。用抗c4α链抗体测量c4和被切割的c4片段。(d)在ca-mg(lp+ap)或mg-egta缓冲液(仅ap)中稀释的c1q耗尽的血清中激活的c3沉积与n蛋白浓度相关。(e)激活的c3沉积与n蛋白浓度相关。(f)c5b-9沉积与n蛋白浓度相关。(g)在存在或不
存在sars-cov核衣壳蛋白的情况下，血清中小鼠巨噬细胞的助噬素细胞吞噬试验。将hsa用作阴性对照。点表示来自两个重复实验的平均值。误差条，平均值
±
s.d.。通过非配对双尾学生t检验，*p《0.05和**p《0.01。
[0293]
图9.
[0294]
sars-cov核衣壳蛋白在体内加速补体凝集素途径级联。(a)将小鼠经由尾静脉用1
×
108pfu ad-n/ad-空感染三次(第1、2、3天)，并且在第6天通过滴鼻法和经由尾静脉给予lps(5mg/kg)。lps激发后6h将小鼠处死。如红色信号所指示的，使用山羊抗masp-2抗体、小鼠抗n抗体和相应的二级试剂通过原位pla测量冷冻肺切片中sars-cov n和masp-2复合物的形成。将沉积的c3c片段用fitc标记的抗c3c抗体染色(绿色)。将细胞核(蓝色)用dapi复染。lps+ad-空是图3d所示的lps+ad-n的阴性对照小鼠。(b)小鼠masp2基因敲除的简图。为了通过crispr/cas介导的基因组工程化创建masp2敲除小鼠模型(c57bl/6n)，选择小鼠masp2基因的外显子9至外显子11作为靶位点。
[0295]
图10
[0296]
两名患者的胸部计算机断层扫描图。示出了最严重的平面。1号患者的ct扫描显示，与抗c5a施用前6天相比，重症肺炎发生在不同的肺部区域。
[0297]
实施例
[0298]
摘要：
[0299]
过度的免疫反应促成sars-cov、mers-cov和sars-cov-2的发病机制和致死性，但是机制仍不清楚。在这项研究中，发现sars-cov、mers-cov和sars-cov-2的n蛋白与masp-2(补体激活的凝集素途径中的关键丝氨酸蛋白酶)结合，导致组成型补体激活和炎性肺损伤加重。无论是阻断n蛋白-masp-2相互作用还是抑制补体激活都可以在体外和体内显著缓解n蛋白诱导的补体过度激活和肺损伤。在covid-19患者中也观察到补体过度激活，并且当将恶化的患者用抗c5a单克隆抗体治疗时，观察到有希望的抑制作用。补体抑制可能代表了用于由这些高致病性β-冠状病毒诱导的肺炎的共同治疗方法。补体激活的凝集素途径是用于治疗高致病性冠状病毒诱导的肺炎的靶标。
[0300]
简介
[0301]
严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)被确定为此疾病的新型病原体。在sars爆发后近十年，一种新的动物源性冠状病毒中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)被确定为中东呼吸综合征的病原体(3)。近日，一种新的冠状病毒sars-cov-2迅速传播到世界各地。截至2020年3月18日，sars-cov-2已经感染超过180,000人，死亡率为3.9％。病毒感染引起与sars-cov感染类似的重症非典型肺炎(4)。尽管正在积极研究这些疾病的发病机制，但仍不十分清楚为什么病毒感染会导致高死亡率的呼吸衰竭(5)。sars-cov核衣壳(n)蛋白是一种46kda的病毒rna结合蛋白，通过blastp，与其他已知冠状病毒的n蛋白只有20％-30％的同源性(6)，而高致病性冠状病毒的n蛋白更类似，包括sars-cov-2(91％)和mers-cov(51％)(5,7)(8)。n蛋白是sars-cov感染期间患者血清样本中最丰富的病毒结构蛋白之一(9)。n蛋白可能在病毒发病机制中发挥作用，因为经由重组痘苗病毒(10)或委内瑞拉马脑炎病毒复制子颗粒(11)预施用n蛋白而不是其他病毒蛋白会在用sars-cov激发的老年小鼠中导致重症肺炎。
[0302]
补体系统作为对感染做出快速反应的免疫监视系统发挥功能。补体系统的激活导
致病原体消除、炎症调节适应性免疫反应。然而，失调的补体激活已经牵涉由高致病性病毒诱导的急性肺部疾病的发展(12,13)。补体系统可以经由经典途径(cp)、凝集素途径(lp)或替代途径(ap)激活(14)。在lp中，甘露聚糖结合凝集素(mbl)(或纤胶凝蛋白)与病毒表面或病毒感染的细胞表面上的甘露聚糖和n-乙酰葡糖胺残基的碳水化合物阵列结合，导致mbl相关丝氨酸蛋白酶-2(masp-2)(唯一已知的可以直接启动补体级联的mbl相关蛋白酶)的激活(15,16)。mbl在体外以剂量依赖性、钙依赖性且甘露聚糖可抑制的方式与sars-cov感染的细胞结合，增强补体c4在sars-cov上的沉积(17)。sars-cov刺突(s)蛋白上的n-连接的糖基化位点n330对于与mbl的特异性相互作用至关重要(18)。尽管在sars患者中发现了更高水平的激活的补体c3和c4片段(这指示补体途径的激活)(19,20)，但sars-cov诱导的补体激活机制尚不十分清楚。在sars-cov-2感染中是否会发生类似的发病机制也是未知的。
[0303]
先前，我们证明了n蛋白与许多宿主蛋白(包括map19(22)(mbl相关丝氨酸蛋白酶-2(masp-2)的选择性剪接产物))相互作用。因此，在这项研究中，深入研究了sars-cov、mers-cov和sars-cov-2n蛋白与masp-2的相互作用，并且还阐明了这些相互作用对宿主免疫和炎症的病理影响，这为针对当前covid-19流行病的基于免疫调节的疗法提供了机制支持。
[0304]
结果
[0305]
sars-cov、sars-cov-2和mers-cov的n蛋白与masp-2相互作用
[0306]
为了研究sars-cov的n蛋白与masp-2之间的结合，并且为了描绘这两种蛋白质的相互作用结构域，使表达flag标记的全长masp-2、n末端cub1-egf-cub2区或c末端ccp1-ccp1-sp区(图7a)的人293t细胞的裂解物经受使用抗flag抗体缀合的琼脂糖珠进行的抗flag免疫沉淀。接下来，在2mm cacl2或1mm edta的存在下，将免疫沉淀物与表达gfp标记的sars-cov n蛋白(gfp-sars n)或截短突变体的293t细胞裂解物一起孵育。通过免疫印迹用抗flag或抗gfp抗体探测吸附物。仅在cacl2的存在下观察到flag-masp-2与gfp-sars n之间的缔合物(图1a)，这与masp-2-mbl结合和masp-2自体激活需要ca
2+
一致。masp-2的ccp1-ccp2-sp区(图1a)和n蛋白的n末端结构域(残基1-175)(图7a和图7b)对于缔合至关重要，而阴性对照或其他截短的区域不结合，并且gfp标记的全长或截短的n蛋白不与小鼠igg缀合的珠共免疫沉淀(图1a和图7b)。
[0307]
最早可以在症状发作后1天在患者血清中检测到sars-cov n蛋白(24)。为了模拟血清中的sars-cov n蛋白缔合物，将flag标记的n蛋白(1ng/ml)添加到人或小鼠血清中，并且用抗flag抗体缀合的琼脂糖珠沉淀。sars-cov n蛋白与源自人和小鼠血清两者的masp-2都相互作用(图1b)。进一步的截短和缺失分析表明，位于sars-cov n蛋白的螺旋基序(残基115-130)中的氨基酸残基116-124对于与masp-2的相互作用是必不可少的(图1c)。然而，masp-2与sars-cov nδ321-323(一种无法形成n蛋白二聚体的突变体)(图7c)的缔合并未受到很大影响(图1c)。
[0308]
sars-cov n蛋白中用于masp2相互作用的关键基序(残基116-124)与sars-cov-2n(115-123)和mers-cov n(104-112)中的相应基序(图7d)具有高度同一性，这表明sars-cov2和mers cov的n蛋白也会与masp2相互作用。正如所预期的那样，外源表达的mers-cov n和sars-cov-2n两者都与masp-2缔合(图1d和图1e)，并且mers-cov n的δ104-112缺失突变体展现出预测的减少的缔合(图1d)。因此，冠状病毒n蛋白中的共同基序对于masp-2结合
很重要。
[0309]
sars-cov、mers-cov和sars-cov-2的n蛋白增强masp-2依赖性补体激活masp-2的ccp1-ccp2-sp结构域负责自我激活和底物结合活性，进而介导补体凝集素途径激活(25)。上文所展示的masp-2:sars-cov n蛋白缔合表明n蛋白可以调节masp-2激活和需要切割的二聚化。为了展示masp-2:masp-2结合，在存在/不存在n蛋白和mbl的情况下，将flag标记的masp-2缀合的珠与表达myc标记的masp-2的293t细胞的裂解物一起孵育。sars-cov n蛋白增强了masp-2-myc与masp-2-flag的结合，摩尔化学计量大约相等(图2a)。接下来，在有或没有sars-cov n蛋白的情况下，将纯化的masp-2-flag与甘露聚糖和mbl一起孵育。在sars-cov n蛋白的存在下，产生了更高水平的由masp-2自体激活产生的被切割的masp-2片段(残基445-686)(图2b)。
[0310]
为了研究sars-cov n蛋白对masp-2的mbl结合能力的影响，将纯化的mbl和masp-2(26)在4℃下在甘露聚糖包被的微孔板孔中孵育以避免masp2激活，并且使用抗masp2抗体评估masp-2:mbl结合的动力学。与人血清白蛋白(hsa)(用作n蛋白阴性对照的结合缓冲液中的高浓度组分)相比，在相对较低浓度的sars-cov n蛋白(1％至0.1％的masp2)和ca
2+
的存在下，masp-2与mbl的结合显著增强，并且抗n蛋白抗体有效地逆转了这种增强(图2c)。此外，与全长sars-cov n蛋白相比，携带δ116-124或δ321-323缺失的sars-cov n蛋白或来自致病性较低的人类冠状病毒229e-cov的n蛋白对masp-2:mbl结合几乎没有影响或没有影响(图2c)。这些结果表明，sars-cov n蛋白增强的masp-2激活不仅依赖于masp-2缔合，还依赖于n蛋白二聚化。
[0311]
激活后，在补体系统的凝集素途径中，masp2切割补体组分c2和c4以产生c3转化酶。接下来，通过c4切割评估sars-cov n蛋白对lp补体激活的影响。在存在/不存在等摩尔n蛋白的情况下，将纯化的c4与masp-2、甘露聚糖、mbl一起孵育，并且在甘露聚糖和mbl的存在下观察到sars-cov n蛋白显著增强了c4切割(图2d和图8a)。因此，sars-cov n蛋白的突变体(δ116-124和δ321-323)以及来自h229e-cov的n蛋白不能促进masp-2介导的c4水解(图2e和图8b)。值得注意的是，一种抗masp-2单克隆抗体或masp-2抑制剂c1inh(27)阻断了sars-cov增强的c4水解，这表明n蛋白增强的c4切割依赖于masp-2激活(图2e和图8b)。此外，还发现mers-cov n增强c4切割(图8c)。这些结果表明，n蛋白促进c4切割，因此促进通过masp-2缔合和激活进行的补体激活。
[0312]
通过补体沉积测定进一步研究了sars-cov n蛋白经由凝集素途径对补体激活的影响。在所指示的n蛋白的存在下，将纯化的c4与固定的mbl masp-2复合物一起孵育。sars-cov、mers-cov和sars-cov2的n蛋白(而不是h229e-cov n)以剂量依赖性方式增强了c4b沉积，这种沉积依赖于masp 2的活性(图2f、图2g和图2h)。然后，在存在/不存在sars-cov n蛋白的情况下，将固定的甘露聚糖与c1q耗尽的血清(以消除经典途径)(28)一起孵育，并且通过抗激活的c3抗体检测沉积的c3片段(c3b、ic3b和c3dg)。与c4b沉积相一致，激活的c3的沉积随着sars-cov n蛋白水平(高达约40nm)的增加而明显增加(图8d)，这表明c3转化酶的活性增强。在高浓度n蛋白的存在下c3b沉积减少(图8d和图8e)，这可能是由于当表面包被有高密度c3b时，血清中的可溶性抑制剂(如因子h和因子i)进一步切割c3b(29,30)。此外，sars cov n蛋白对含有egta的无钙缓冲液中激活的c3沉积几乎没有影响或没有影响，这表明sars cov n蛋白通过凝集素途径(lp)而不是替代途径(ap)(其中c3激活与ca
2+
无关)增强
了c3激活发生(图8e)。我们进一步测试了c5b 9复合物的沉积。由于放大的补体级联，sars-cov n蛋白在与患者血清中观察到的浓度类似的低得多的浓度下诱导了显著增加的复合物沉积(图8f)(24)。
[0313]
激活的补体在通过c3b或c5b介导的调理作用对病原体和细胞碎片的有效吞噬中起关键作用(31)。为了研究补体依赖性吞噬作用，在有或没有sars-cov n蛋白的情况下，将大肠杆菌和小鼠腹腔巨噬细胞在稀释的c1q耗尽的血清中一起孵育。将结合的c3或其大片段c3b(c3切割后的产物)用fitc标记的抗c3c抗体染色，并且对含有fitc阳性巨噬细胞的c3缀合的大肠杆菌在显微镜下计数。与补体激活相一致，与hsa对照相比，sars-cov n蛋白增强了在含有包括masp-2在内的补体组分的小鼠血清的存在下小鼠腹腔巨噬细胞的补体依赖性吞噬作用(图8g)。这些发现表明，sars-cov n蛋白通过非经典途径有效地促进了补体系统的激活和调理作用。
[0314]
sars-cov和mers-cov的n蛋白通过masp-2参与的补体激活加重lps诱导的肺炎
[0315]
补体的持续激活导致不受控制的炎症。为了研究n蛋白增强的masp-2激活对炎症的影响，将小鼠用表达sars-cov n(ad-sars n)或其突变体的腺病毒(1
×
109pfu)或仅腺病毒媒介物(ad-空)预感染。然后将小鼠用含有mbl结合基序的lps激发以激活lp并且诱导炎症(32)。预暴露于腺病毒媒介物的10只小鼠中有8只在用5mg/kg lps激发时存活(图3a)，而预暴露于ad-sars n的所有10只小鼠在施用相同剂量的lps后12h内死亡(图3a)。在死亡小鼠中也观察到严重的肺损伤和大量炎症细胞浸润(图3b)。与先前的发现相一致，分别在n蛋白中携带δ116-124或δ321-323缺失的ad-229e n和ad-sars n的预感染对小鼠死亡率的影响显著降低。重要的是，当将抗masp-2抗体或c1inh与lps施用在ad-sars n预感染的小鼠中同时施用时，由lps诱导的死亡率显著降低(图3a)。在这些小鼠中也观察到严重的肺损伤和大量炎症细胞浸润(图3b)。这些结果共同证明，sars-cov n蛋白经由masp-2激活(其从而启动lp参与的补体级联反应)极大地增强了lps诱导的炎症。
[0316]
为了在小鼠中研究由lps和n蛋白诱导的补体激活，用lps(5mg/kg)激发预感染ad-sars n(1
×
108pfu)的小鼠。施用lps后6h，将小鼠处死，并且使多聚甲醛固定的肺组织经受用抗c4b抗体进行的免疫组织化学染色(图3c)或用fitc标记的抗c3c抗体进行的免疫荧光分析(图3d)。与用lps和ad-空处理的小鼠肺中的弱染色相比，在表达sars-cov n蛋白的小鼠中，肺中的c4b和激活的c3沉积显著增加(图3c和图3d)。
[0317]
通过用抗n和抗masp-2抗体进行的原位邻位连接测定(pla)进一步评估masp-2与n蛋白的体内缔合(图3d，图9a)，并且在来自表达sars-cov n的小鼠的肺细胞中大量观察到红点(其仅当sars-cov n和masp-2相互结合时才可检测到)，但是在阴性对照动物中没有观察到。这些结果证实了在小鼠肺组织中masp-2被sars-cov n原位直接结合和激活。
[0318]
类似地，当将用lps激发的小鼠用表达mers-cov n蛋白(ad-mers n)而不是其δ104-112突变体(ad-mers nδ104-112)的腺病毒预感染持续7天后的24h内，它们患有严重的肺炎并且100％死亡，这部分被c1inh和抗masp-2抗体拯救(图3e)。这些结果表明，sars-cov和mers-cov两者都使用n蛋白通过masp-2介导的凝集素途径促进补体激活。
[0319]
通过同样的方式使用具有masp-2蛋白酶活性缺陷的masp2敲除小鼠进一步研究了n蛋白的致病性(图9b)。将小鼠用ad-sars n或ad-mers n(1
×
108pfu)预感染5天，然后用lps激发。与野生型小鼠相比，masp2敲除小鼠存活时间更长，并且存活率更高(图3f)，这可
能是归因于由于masp-2缺陷导致的补体激活受损。
[0320]
补体级联在covid-19患者的肺中被过度激活
[0321]
由于sars-cov和sars-cov-2仅在小鼠中诱导轻度肺损伤，并且法规不允许对包括小鼠适应的sars-cov在内的活sars-cov进行研究，因此获得了在covid-19患者中发生补体lp途径的过度激活的临床证据。收集死于covid-19的患者的多聚甲醛固定的肺组织，并且使其经受用mbl、masp-2、c4α、c3或c5b-9抗体进行的免疫组织化学染色。患者肺组织中的mbl、masp-2、c4、c3和c5b-9呈强阳性染色(图4)，这表明补体组分沉积在i型和ii型肺泡上皮细胞以及炎症细胞、一些增生的肺细胞和带有坏死细胞碎片的肺泡腔中的渗出物中。此外，在covid-19患者中(特别是在危重患者中)也观察到血清c5a水平显著升高。这些结果表明，补体途径在covid-19患者的肺中被积极激活。
[0322]
补体靶向性疗法显示出针对covid-19的有希望的疗效
[0323]
过度的炎症和细胞因子风暴可能促成covid-19的严重程度和致死性，这可能归因于补体途径的不受限制的激活。因此，下调masp-2以及其下游信号分子(如强效过敏毒素c5a)可能为控制由sars-cov-2诱导的肺炎提供了新方法。
[0324]
基于我们的发现以及重组c5a抗体在covid-19疗法中的潜力和应用，所述抗体(其处于化脓性汗腺炎的ii期临床试验中)被国家药品监督管理局(nmda)快速批准进行治疗covid-19的ii期临床试验(2020l0003)，所述抗体包含seq id no:34的可变重链序列和seq id no:35的可变轻链序列(从相同细胞系生长的具有这些可变区的igg抗体可互换地称为ifx-1或bdb-001)。经火神山医院(huoshensan hospital)伦理委员会批准和患者的知情同意，同时进行“轻症covid-19患者中的多中心、随机双盲安慰剂对照试验”和开放标签“重症和危重covid-19患者中的双群组临床试验”。虽然在试验完成时将在其他地方报告来自covid-19群组中更多患者的更大数据集，但在此我们报告在开放标签试验中施用抗c5a疗法的前2名患者。
[0325]
1号患者(一名54岁的武汉市男性居民)在症状发作后的第4天(患病第5天)因发热住进东西湖医院(dongxihu hospital)。通过sars-cov-2的rrt-pcr证实了sars-cov-2的感染，并且胸部ct扫描显示双侧不透明。从患病第9天疾病加重，高热(38.7℃至39.8℃)，对室内空气的spo2《93％，ct扫描显示肺炎进展，并且肝损伤严重。在患病第10天到第13天施用泼尼松(40mg/天，持续4天)，但是病症恶化，因此在患病第14天，将患者转移到武汉火神山医院(一家为重症covid-19患者紧急建立的新医院)(图5a)，并且这名患者被认为是处于危重病症的重症病例，患有中度ards(氧合指数《150)，呼吸频率30/min，并且当暴露于室内空气1分钟时，经皮氧饱和度(spo2)下降至77％。提供支持性护理，包括高流量鼻氧(hfno)至目标spo2》95％(图5b，左)。他还被施用抗生素(莫西沙星)和人血清白蛋白,，同时中止泼尼松。在患病第15天早上开始用抗c5a单克隆抗体(bdb001)进行治疗。在第1、2、3、5、7、9、11和13天，将抗体以300mg/d的剂量在250ml盐水中静脉内给予。未观察到不良事件，并且在接下来的几天临床病症得到改善，当日晚上体温正常(图5c，左)，氧合指数(pao2/fio2)(图5b，左)和淋巴细胞数(图5c，左)增加，c反应蛋白(crp)浓度降低(图5c，左)，并且肝功能显著改善(显示为alt、ast降低，并且总血清蛋白和血清白蛋白浓度增加，图5d，左)。吸入o2分数和高流量鼻氧(hfno)的气体流速最终从最高值降低(80％，40l/min至30％，20l/min)至目标spo2》95％(图.5b，左)。由于使危重病症的患者在临时建立的医院进行ct扫描的风险很高
(距离和下雨天气)，因此在抗c5a施用之前没有ct扫描可用于评价。然而，与第1剂后10天相比，第1剂后20天肺炎显著改善(图10)。
[0326]
2号患者是一名67岁的男性，他在发热和咳嗽症状发作后的第5天(患病6天)住进第六医院。ct扫描显示左肺上叶不透明(图10)。在患病第11天，rrt-pcr也证实了sars-cov-2的感染。将抗病毒药(阿比多尔)和抗生素(莫西沙星)与其他支持治疗一起施用。到第8天，病症恶化，出现剧烈咳嗽和高热(39.7℃，图5c，右)。甲基泼尼松龙(40mg/天，从患病后第8天开始持续7天)显示症状几乎没有改善。在第10天，将患者转入武汉火神山医院(图5a)，病情持续恶化，如通过spo2(第14天对室内空气，《90％)、高热(第10-13天》39℃)，图5c，右)和患病第11天胸部ct显示肺炎(图10)所显示。患者报告了严重咳嗽、胸部紧迫感和呼吸困难。必须给予hfno以维持spo2》95％。在患病第14天早上施用抗c5a，并且与1号患者一样继续施用。随后，在当日观察到正常体温(图5c，右)。第二天(患病第15天)报告了咳嗽、呼吸困难和胸闷有所好转。在接下来的几天也观察到c反应蛋白(crp)水平显著降低、白细胞和淋巴细胞数显著增加(图5c，右)。肝功能逐渐改善(图5d，右，第15天的数据不可用)。维持spo2》95％所需的流速和吸入o2分数逐渐降低，伴随spo2/fio2逐渐增加(图5b，右)。第26天(第1剂后12天)的胸部ct也显示肺炎减少(图5b)。
[0327]
这些数据表明，2名患者显著受益于抗c5a单克隆抗体疗法。
[0328]
讨论
[0329]
在过去的17年里，相继出现的sars-cov、mers-cov和sars-cov-2突破了物种壁垒，并且给人类带来了新的传染病和社会恐慌。所有这些高致病性冠状病毒都会引起急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征(ards)，从而导致严重程度和致死率增加。感染病毒的患者可能因严重的免疫损伤而患上非典型肺炎。特征在于大量释放促炎症细胞因子和趋化因子(称为“细胞因子风暴”)的过度人免疫反应(5)被认为是由高致病性冠状病毒(包括最新的sars-cov-2)引起的重症肺炎的主要起始因素(4)。尽管免疫发病机制已经部分牵涉sars或mers，但导致病毒诱导的宿主免疫系统过度激活的机制仍知之甚少。
[0330]
在此，诸位发明人公开了sars-cov、mers-cov和sars-cov-2具有共同的机制，将病毒n蛋白与mbl的结合和增强、masp-2的ca
2+
依赖性自体激活(导致不受控制的补体级联的激活、补体沉积和c4的切割增强)联系起来(图1-图2和图6)。n蛋白与masp-2的结合放大了masp-2介导的凝集素途径激活的作用。n蛋白突变体不能与masp-2相互作用，也不能形成n二聚体，并且对masp-2介导的凝集素途径激活几乎没有影响或没有影响(图1c和图1d)，这表明n蛋白的作用依赖于结合和二聚化。
[0331]
作为一把“双刃剑”，补体对于针对病原体的先天免疫至关重要。过敏毒素(如c3a和c5a)可以激活免疫细胞，从而诱导各种细胞因子的释放。激活的补体级联产生细胞溶解末端补体复合物c5b-9以及c3b和c5b片段(31,33)。这些肽诱导花生四烯酸代谢物(包括前列腺素(pg)e2、血栓素b2和白三烯)的合成(32,34)，所述代谢物进一步诱导嗜中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的募集和激活，并且刺激许多促炎症细胞因子和介质的产生(35)。这些细胞因子触发并且维持炎症过程，并且帮助先天免疫对抗病毒。然而，补体参与的先天免疫激活必须进行微调，因为不受限制的补体激活总是会导致弥散性血管内凝血(dic)、炎症、细胞死亡和免疫麻痹，并且最终导致多器官衰竭和死亡。冠状病毒n蛋白增强补体激活的惊人发现为由sars-cov、mers-cov和sars-cov-2感染诱导的肺炎的病因提供了
新的见解。此外，我们还发现ad-sars n或ad-mers n的预感染明显增加了lps诱导的肺炎的死亡率(图3)，它还可能加重由继发性细菌感染释放的大量lps引起的组织损伤(37,38)。
[0332]
在冠状病毒的发病机制中n蛋白介导的masp-2的参与以及因此的补体级联过度激活提供了使用已知的c5a/c5ar途径抑制剂的策略，从而为治疗sars、mers或最新的covid-19提供新方法。首先，抗体中和血清中的n蛋白有效地减轻了lps/ad-sars n或lps/ad-mers n激发的小鼠的肺损伤并且降低死亡率。巧合的是，产生较高水平的n蛋白特异性抗体而不是刺突蛋白特异性抗体的sars患者往往更容易康复，这表明n抗体的水平与sars的结局相关(39)。根据我们的发现，类似的机制可能存在于mers-cov或sars-cov-2感染中。
[0333]
其次，masp2基因敲除小鼠在lps诱导的、n蛋白增强的小鼠肺炎模型中显示出显著的轻症症状和更短的病程，证实了masp-2在这种重症肺炎中的有害作用。因此，抗masp-2抗体或masp-2抑制剂c1inh的施用显示出有希望的治疗效果(图3)。具有更高亲和力和中和活性的改进的masp-2抗体(如oms721(40)(其对血栓性微血管病显示出有希望的效果))或可注射的c1inh药物(如haegarda)可以提供有效的保护。进一步的临床评价对于进行治疗sars-cov 2诱导的肺炎治疗具有价值。
[0334]
第三，我们已经观察到死亡患者的肺组织中补体级联的过度激活，这与ad-sars n预感染和lps引发的小鼠模型中的观察结果一致。高水平c5a在重症而不是轻症covid-19患者的血清中积累。因此，补体级联产物靶向性免疫调节对于致病性冠状病毒相关疾病中的炎症控制可能有效将是有意义的。在这个途径中，c5a是最有效的触发炎症的补体蛋白。基于我们的观察结果和staidson(bdb001)和inflarx gmbh(ifx-1，由相同的工程化细胞系生产)在其他疾病的ii期试验中的安全性记录，重组抗c5a抗体bdb001被nmda批准用于进行治疗重症和危重covid-19患者的临床试验。至少在前两名病症都恶化的患者中，抗c5a抗体显示出快速且有希望的效果，超出了临床医生的预期。尽管最终功效将直到临床试验完成才会公布，但值得期待的是抗c5a抗体将为covid-19的治疗提供新方法。
[0335]
材料与方法
[0336]
细胞培养和转染
[0337]
293t细胞系获自北京协和医学院细胞资源中心(cell resource center of peking union medical college)。使细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(fbs)(hyclone)、2mm l-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)(invitrogen)中生长。根据制造商的方案，将细胞使用lipofectamine 2000(invitrogen)用质粒dna转染。
[0338]
载体和蛋白质的表位标记
[0339]
将sars-cov的n基因(genbank登录号ay274119)通过rt-pcr从患者血清样品的sa rs-cov rna中扩增(上游引物：5
’‑
cggaattccatatgtctgataatggaccccaa-3’；下游引物：5
’‑
cgggatccttatgcctgagttgaatcagc-3’)并且克隆到基于pcd na3的flag载体(invitrogen)、pcmv-myc(clontech)、pgex-4t-2(ge health care)以及pegfpc1(clontech)的bglii和ecori位点中。mers-cov的n基因是化学合成的(huaxinrcomm technology co.,ltd)，并且将其在bamhi和ecori位点处克隆到基于pcdn a3的flag载体中。sarscov-2的n基因是化学合成的(general biosystems(anhui)co.ltd)，并且将其在kpni和xbai位点处克隆到基于pcdna3.1的ha载体中。
maxisorb板在室温下每个孔用在100mm na2co3/nahco3(ph 9.6)中的10μg甘露聚糖包被过夜。在每个步骤后，将板用pbst(300μl/孔)洗涤三次。通过与10mm tris-hcl(ph 7.4)、150mm nacl和2％hsa在室温下一起孵育2-3h来阻断残余的结合位点。将血清样品在有或没有2mm cacl2和n蛋白的情况下在含有150mm nacl、0.5mm mgcl2、0.05％tween-20和0.1％明胶的10mm tris-hcl(ph 7.4)中以1:80稀释。所有样品和缓冲液都在冰上制备。然后将板依次在4℃下孵育1h并且在37℃下孵育1.5h，然后洗涤。所有孵育体积都为100μl。使用抗体检测补体结合，然后洗涤。分别使用抗c4α链抗体(santa cruz)、抗激活的c3抗体(santa cruz)和抗c5b-9抗体(calbiochem)进行c4、激活的c3和c5b-9的检测。使用hrp缀合的绵羊抗小鼠抗体或驴抗兔抗体(r&d)检测抗体结合。使用tmb室温孵育30-60min检测hrp的酶活性，并且用2m h2so4停止反应。使用酶标仪在450nm处测量od。
[0350]
masp-2:mbl结合测定。
[0351]
通过elisa评估masp-2与mbl的结合。如上文所提及，将nunc maxisorb板在室温下每个孔用在100mm na2co3/nahco3(ph 9.6)中的10μg甘露聚糖包被过夜并且用2％hsa封闭。将mbl蛋白(1μg/ml)在10mm tris-hcl(ph 7.4)、150mm nacl、5mm cacl2、100μg/ml hsa和0.5
‰
tritonx-100中在4℃下孵育2h。将纯化的masp-2和n(或对照)蛋白在不同时间添加到孔中，以分别获得0.2mg/ml和200ng/ml的最终浓度。将板在4℃下孵育32h后洗涤，并且用抗masp-2抗体，然后用hrp缀合的兔抗山羊抗体检测masp-2的结合。使用tmb在室温下孵育30-60min检测hrp的酶活性，并且用2m h2so4停止反应。使用酶标仪在450nm处测量od。
[0352]
助噬素细胞吞噬测定。
[0353]
将从腹腔分离的小鼠细胞洗涤并且在37℃下在96孔板中用rpmi 1640培养基(10％fbs)接种2h。将血清用1
×
pbs、1mm cacl2和2mm mgcl2稀释0.781％、1.562％、3.125％、6.25％、12.5％、25％、50％和100％。将稀释的血清、sars-cov n蛋白(100ng/ml)和大肠杆菌(与细胞的比率为10:1)添加到每个孔中，并且在37℃下孵育30分钟。将来自pet22b转化的大肠杆菌的洗脱物用作纯化的n蛋白的阴性对照，以排除由于可能激活补体的细菌组分的影响。停止反应，并且将细胞用10％中性福尔马林固定。用fitc-c3c抗体检测补体c3c沉积，并且对染色的细胞进行计数。点表示来自两个重复孔的平均值。误差条，平均值
±
s.d.。通过非配对双尾学生t检验，*p《0.05和**p《0.01。小鼠。
[0354]
产生masp缺陷型小鼠和lps激发
[0355]
balb/c小鼠组由军事医学科学院(academy of military medical sciences)的实验动物中心提供。masp-2-/-(ko)小鼠和阴性对照野生型(wt)小鼠由cyagen biosciences inc.提供。将所有小鼠都维持在军事医学科学院(中国)的实验动物中心。将小鼠(8-10只/组)经由尾静脉用1
×
10
8-9
pfu ad-n/ad-空(beijing bac biological technologies)或盐水对照感染三次(第1、2、3天)，并且在第5-6天经由尾静脉给予lps(5mg/kg)。在注射lps前30min，经由尾静脉注射抗masp-2单克隆抗体(200μg/kg，hbt)、抗n单克隆抗体(200μg/kg，sino biolgical)或c1inh(4mg/kg，calbiochem)。
[0356]
免疫组织化学
[0357]
4名在火神山医院死亡的患者的死后尸检是在医院伦理委员会和死者家属的批准下由卞修武(xiuwu bian)博士进行的。详细结果将在其他地方公布。将多聚甲醛固定的肺组织用于石蜡组织切片，并且如前所述的用mbl(santa cruz)、masp-2(santa cruz)、c4α链
(santa cruz)、c3(santa cruz)或c5b-9(calbiochem)抗体进行免疫组织化学染色。
[0358]
covid-19患者中c5a的检测。
[0359]
在医院伦理委员会的批准下收集来自轻症或重症covid-19患者的血清。重症患者被定义为发热或疑似呼吸道感染，加上以下中的一种：呼吸频率》30次呼吸/min、严重呼吸窘迫或对室内空气的spo2《90％。患有肺炎且没有重症肺炎病征的患者被定义为轻症病例。测定了来自10名轻症患者(5名男性，5名女性)的血清，其中平均年龄为56
±
12.1岁并且平均患病26.3
±
9.1天。从临床实验室收集来自身体健康的人的血清。通过双抗体夹心elisa(r&d)检测血清c5a水平。
[0360]
c5a抗体疗法。
[0361]
针对人c5a的小鼠-人(igg4)抗体(bdb-001注射剂)由staidson biopharmaceutical co.,ltd提供，它是根据良好生产规范(good manufacture protocol)制造的。在2019年注射剂被中国的国家药品监督管理局(nmda)批准用于进行健康受试者的i期临床试验。在sars-cov-2冠状病毒诱导的肺炎(covid-19)爆发后，在2020年2月7日抗体被nmda批准用于进行治疗covid-19的ii期临床试验(2020l00003)。向人施用抗体也被武汉火神山医院伦理委员会批准。在第1、2、3、5、7、9和11天静脉内(i.v.)施用在250ml盐水中的300mg抗c5a抗体。定期测定动脉血气(abg)测试、c反应蛋白(crp)、血常规(血rt)和肝功能。根据需要监测sao2、血压、心跳。
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技术特征：
1.一种用于在治疗由冠状病毒感染引起或与之相关的医学病症中使用的c5a活性抑制剂，其中所述医学病症优选为(i)肺炎和/或(ii)发热。2.一种c5a活性抑制剂，用于在减少患有冠状病毒感染的受试者的炎症反应中使用。3.一种c5a活性抑制剂，用于在改善患有冠状病毒感染的受试者的器官功能、特别是肺功能和/或肝功能中使用。4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于所述用途的c5a活性抑制剂，其中所述冠状病毒选自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2。5.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的c5a抑制剂，其中所述受试者患有sars、mers或covid-19。6.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的c5a抑制剂，其中所述治疗导致以下一项或多项：-c反应蛋白的减少；-发热的减少；-血液中淋巴细胞计数的增加；-降低alt/ast；和/或-氧指数(pao2/fio2)的增加。7.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的抑制剂，其中所述c5a活性抑制剂：-降低c5的浓度；-抑制c5切割为c5a和c5b；-降低c5a的浓度；-抑制c5a与c5a受体之间的结合；-降低c5a受体的浓度；和/或-抑制c5a受体的活性。8.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的化合物，其中所述c5a活性抑制剂是与c5或与c5a或与c5a受体特异性结合的蛋白质配体。9.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的c5a活性抑制剂，其中所述蛋白质配体选自：(i)抗体或其抗原结合片段，(iii)抗体样蛋白，(iv)c5a的抑制性变体，(v)c5a受体的抑制性变体，(vi)作用于补体途径的蛋白质，和(vii)肽。10.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的化合物，其中所述c5a活性抑制剂是与c5或与c5a或与c5a受体特异性结合的寡核苷酸。11.根据权利要求10所述的用于所述用途的化合物，其中所述寡核苷酸选自dna适配体、d-rna适配体和l-rna适配体。12.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的化合物，其中所述c5a活性抑制
剂降低c5蛋白或c5a受体蛋白的表达。13.根据权利要求12所述的用于所述用途的化合物，其中所述c5a活性抑制剂是选自反义dna、反义rna、sirna和mirna的寡核苷酸。14.根据权利要求7至13中任一项所述的用于所述用途的化合物，其中所述c5a受体是c5ar和/或c5l2。15.根据权利要求1至14中任一项所述的用于所述用途的化合物，其中所述c5a活性抑制剂选自：(a)medi-7814、alxn-1007或nox-d21，或其抗原结合片段；(b)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与(a)下所指示的抗体之一竞争结合c5a；(c)依库珠单抗、alxn1210、alxn5500或lfg316，或其抗原结合片段；(d)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与(c)下所指示的抗体之一竞争结合c5；(e)coversin或ra101495；(f)抗体或其抗原结合片段或蛋白质或大环肽，其中所述抗体或其抗原结合片段或蛋白质或大环肽与(e)下所指示的蛋白质或肽之一竞争结合c5；(g)zimura；(h)抗体或其抗原结合片段或适配体，其中所述抗体或其抗原结合片段或适配体与zimura竞争结合c5；(i)amy-201或米考西普；(j)抗体或其抗原结合片段或蛋白质，其中所述抗体或其抗原结合片段或蛋白质与(i)下所指示的蛋白质之一竞争结合c3b；(k)拜卡西奥单抗；(l)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与拜卡西奥单抗竞争结合因子b；(m)兰帕利珠单抗；(n)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与兰帕利珠单抗竞争结合因子d；(o)aln-cc5；(p)阿伐可泮或根据式ii或式iii的化合物；或pmx-53或根据式iv的化合物；(q)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与阿伐可泮或pmx-53竞争结合c5ar；(r)克隆s5/1或克隆7h110，或其抗原结合片段；和(s)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与(r)下所指示的抗体之一竞争结合c5ar。16.根据权利要求1至9中任一项所述的用于所述用途的c5a抑制剂，其中所述c5a抑制剂与由人c5a的氨基酸序列ndetceqra(seq id no:2)和shkdmql(seq id no:3)形成的构象表位特异性结合，并且其中所述c5a抑制剂与根据seq id no:2的氨基酸序列内的至少一个氨基酸结合并且
no:6、8、10、12、14和16的氨基酸序列；(ii)具有seq id no:36的氨基酸序列的可变重链序列和具有根据seq id no:37的氨基酸序列的可变轻链序列或与seq id no:36和37具有至少90％氨基酸序列同一性的变体，所述变体包含根据权利要求15至18所述的轻链和重链cdr1至cdr3或其变体的根据seq id no:7、9、11、13、15和17的氨基酸序列。

技术总结
本发明涉及一种由冠状病毒感染引起或与之相关的C5a活性医学病症的抑制剂。本发明还涉及C5a活性抑制剂在减少患有冠状病毒感染的受试者的炎症反应中的用途。本发明进一步涉及一种C5a活性抑制剂，用于在改善患有冠状病毒感染的受试者的器官功能、特别是肺功能和/或肝功能中使用。肝功能中使用。


技术研发人员：N
受保护的技术使用者：因弗拉克斯有限责任公司
技术研发日：2020.03.27
技术公布日：2023/7/7