一种微流控芯片固相肽合成方法及装置

1.本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种微流控芯片固相肽合成方法及装置。


背景技术：

2.当前，微流控芯片技术在高通量、低消耗、快速合成方面具有独特优势。与传统的药物开发程序相比，微流控作为一项革命性的技术，为生化反应的发生提供了一个小型化和高度可控的环境，当微流控芯片固相肽合成与分析检测方法集成联用时，能够进行高通量筛选和评估，有效降低了药物研发的时间和成本，对尺度转换和评估过程的经济可行性具有高价值。
3.然而，目前已有的研究大都是在连续流固定床反应形式下进行的微流控芯片固相肽合成，主要存在以下缺陷：（1）现有微流控芯片进行肽合成时，反应液与固相载体只能单向流动反应，固载树脂在出口位置挤压聚集严重，导致树脂上负载的活性位点无法与反应液充分接触反应，存在树脂球破裂情况，降低了化学反应的效率，很难实现更长肽链的合成。
4.（2）现有微流控芯片肽合成的序列多为五肽，片上合成时间不低于10min，得到的产物平均纯度约为85%。相对于微通道连续流反应器而言，10min的缩合反应时间较长，且得到的产物平均纯度约为85%，纯度较低，没有充分发挥出微尺度合成的优势。整体的技术合成路线有待改进提升，工艺参数需进一步精确优化。
5.（3）使用现有的微流控芯片进行合成反应，合成结束后通道中的固载树脂在通道直角处（死角处）易堆积黏壁，不易排出，导致芯片二次使用性能降低或无法重复使用，进而增大了研发生产的成本。
6.因此，要想有效使用微流控芯片技术推动肽类药物的合成与研发，就需要充分发挥微尺度反应的优势，开发出一条能使得反应液与固相载体在微反应器中充分接触反应的合成技术路线，通过合理的反应过程调控、工艺参数优化，实现短时间快速合成高纯度肽产物。


技术实现要素：

7.鉴于现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种微流控芯片固相肽合成方法及装置，它能够使反应液与树脂在微通道中充分接触反应，实现八肽及更长链肽的片上合成，有效提高合成反应的效率。
8.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种微流控芯片固相肽合成方法，具体包括如下步骤：s1、准备：在具有微通道的反应芯片的入口和出口分别通过管道连接进样器和逆推器，反应芯片出口侧的管道末端具有颗粒截留状态与颗粒放行状态；往微通道内注入溶胀后的树脂颗粒；
s2、脱保护反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器往微通道内注入脱保护液，然后利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得脱保护液与树脂颗粒在微通道和管道内往返混流并进行脱保护反应；s3、排液与洗涤：切换至颗粒截留状态，通过进样器多次注入洗涤液完成将脱保护混合液排出以及洗涤树脂颗粒，而树脂颗粒被截留在管道内；s4、缩合反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器注入缩合反应液，然后利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得缩合反应液与树脂颗粒在微通道和管道内往返混流并进行缩合反应；s5、再排液与洗涤：切换至颗粒截留状态，通过进样器多次注入洗涤液完成将缩合混合液排出以及洗涤树脂颗粒，而树脂颗粒被截留在管道内；s6、重复上述步骤s2-s5的循环反应以进行肽链的延伸，得到带保护基的n肽树脂；s7、最后脱保护反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器往微通道内注入脱保护液，然后利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得脱保护液与n肽树脂在微通道和管道内往返混流并进行脱保护反应；s8、切割、沉淀、烘干，得到目标多肽产物。
9.优选地，所述步骤s4中的缩合反应液的注入工序具体为：预先将带保护基的氨基酸与缩合试剂混合配置成活化氨基酸溶液；再用进样器把活化氨基酸溶液注入微通道。
10.优选地，所述步骤s4中的缩合反应液的注入工序具体为：先用进样器将带保护基的氨基酸注入微通道；再用进样器将缩合试剂注入微通道。
11.优选地，所述切割步骤具体为：通过进样器往微通道内注入切割液，然后利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得切割液与n肽树脂在微通道和管道内往复混流并进行切割反应，最后排出与分离树脂颗粒和切肽液。
12.优选地，所述步骤s2-s8均在常温下进行。
13.优选地，所述步骤s2与s7的反应过程中还进行用于动态监测脱保护反应进度的监测步骤。
14.优选地，所述监测步骤具体为：切换至颗粒截留状态，从反应芯片出口侧的管道末端收集脱保护混合液，采用荧光光谱法测试保护基的荧光谱图。
15.优选地，所述微通道采用蛇形微通道且其转弯处采用平滑弯角设计。
16.优选地，所述逆推器的容量大于流入逆推器内部的溶液最大容积，在进样器和逆推器的双向推拉过程中管道和微通道内呈固液气三相混流。
17.本发明还提供一种微流控芯片固相肽合成装置，包括反应芯片、进样器以及逆推器，所述反应芯片内设有微通道，所述反应芯片的入口通过管道连通至进样器的输出端，所述反应芯片的出口通过管道连通至逆推器的输出端，且反应芯片出口侧的管道末端具有颗粒截留状态与颗粒放行状态的两种状态且可切换。
有益效果
18.本发明在反应芯片入口和出口端分别设置进样器和逆推器，使得反应液与树脂颗粒在微通道中进行双向连续流循环反应，充分接触反应，实现单步缩合反应的时间降至5min内，有效提高合成反应的效率，实现短时间快速合成高纯度肽，首次实现八肽及更长链
肽的片上合成；通过对微流控芯片固相肽合成技术路线进行优化，优选出精确的工艺参数，能够进一步缩短反应的时间周期，降低了肽合成在药物研发方面的时间和费用成本。
19.本发明的脱保护反应和缩合反应过程中切换至颗粒放行状态，有利于降低树脂颗粒堵塞在滤头处而导致树脂颗粒破裂、逆推器动作不畅以及避免因堵塞程度不同导致的逆推器压力不易控制问题，能够保证在双向推拉混流反应过程中的通畅与平顺；本发明通过设计与制备微流控芯片反应器内部通道结构，蛇形弯角的平滑处理，因此当树脂颗粒流经弯角处时，即可顺畅通过，无粘附挂壁情况，且长时间反应后树脂颗粒仍形态完好，几乎无破损情况，能进行更长时间的反应，适用于合成长链肽；且在反应结束后，切换至颗粒放行状态，树脂颗粒能够顺利的全部排出反应芯片、无残留，微流控芯片能够进行重复利用，有效降低了应用的成本。
20.本发明通过对各个脱保护反应时间后的溶液进行荧光光谱测试，可以精确得知各时间段的脱保护反应进行程度，避免现有研究中以经验值或时间范围划定反应时间而造成的时间成本上的浪费，综合时间方面及快速合成考量，在相同脱保护情况下优选最短时间为工艺时间。另外，还能够确定何时脱保护进行完全，若要进一步提升产物的收率，就需要将时间控制在脱保护完全时。脱保护反应作为固相肽合成中至关重要的环节，此步骤的精确时间节点的把控能有效提高整个循环反应的效率。
21.本发明是在常温下进行，无需额外的加热步骤或保温设备就能够实现短时间快速合成目标肽，大大降低了反应能耗的同时又避免了加热产生的副产物问题，有利于高纯度肽的合成。并且，反应芯片体积小，便于组装携带，省去了传统反应器复杂的预加热和加热保温结构，极大简化了反应装置，在药物研发领域有着广阔的商用前景。
附图说明
22.图1为本发明合成装置示意图。
具体实施方式实施例1
23.本实施例提供一种微流控芯片固相肽合成方法，用于合成八肽-血管紧张素ⅱ（h-asp-arg-val-tyr-ile-his-pro-phe-oh），具体包括如下步骤：s1、准备：在具有微通道100的反应芯片10的入口和出口分别通过管道连接进样器20和逆推器30，所述微通道100采用蛇形微通道且其转弯处采用平滑弯角设计，反应芯片10出口侧的管道末端具有颗粒截留状态与颗粒放行状态；取213mg fmoc-phe-wang resin置于二氯甲烷溶液中溶胀5min后再通过进样器20往微通道100内注入溶胀后的树脂颗粒；s2、脱保护反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器20往微通道100内注入脱保护液，脱保护液为含20％哌啶的dmf，然后利用进样器20和逆推器30的双向推拉作用使得脱保护液与树脂颗粒在微通道100和管道内往返混流并进行脱保护反应，脱保护反应时间2min，将氨基酸的保护基团脱下来；s3、排液与洗涤：切换至颗粒截留状态，通过进样器20多次注入洗涤液dmf完成将脱保护混合液排出以及洗涤树脂颗粒，而树脂颗粒被截留在管道内；
s4、缩合反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器20往微通道100内注入配置好的缩合反应液，缩合反应液由带保护基的氨基酸与缩合试剂混合配置成活化氨基酸溶液，氨基酸和缩合试剂与树脂颗粒的投料比均为5:1，缩合试剂为在dmf中的n,n-二异丙基碳二亚胺dic和2-肟氰乙酸乙酯oxyma pure，然后利用进样器20和逆推器30的双向推拉作用使得缩合反应液与树脂颗粒在微通道100和管道内往返混流并进行缩合反应，反应时间5min；s5、再排液与洗涤：切换至颗粒截留状态，通过进样器20多次注入洗涤液dmf完成将缩合混合液排出以及洗涤树脂颗粒，而树脂颗粒被截留在管道内；s6、重复上述步骤s2-s5的循环反应以进行肽链的延伸，得到带保护基的8肽树脂fmoc-asp(otbu)-arg(pbf)-val-tyr（tbu）-ile-his(trt)-pro-phe-wang resin；s7、最后脱保护反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器20往微通道100内注入脱保护液，然后利用进样器20和逆推器30的双向推拉作用使得脱保护液与8肽树脂在微通道100和管道内往返混流并进行脱保护反应；s8、切割、沉淀、烘干，得到目标多肽产物，粗肽纯度达94.65％。
24.所述切割步骤具体为：通过进样器20往微通道100内注入切割液，切割液为含5％二硫苏糖醇dtt的三氟乙酸tfa，然后利用进样器20和逆推器30的双向推拉作用使得切割液与n肽树脂在微通道100和管道内往复混流并进行切割反应，最后排出与分离树脂颗粒和切肽液；然后用甲基叔丁基醚mtbe沉淀切肽液并烘干即可得到八肽-血管紧张素ⅱ。
25.上述步骤s2-s8均在常温下进行，无需额外的加热步骤或保温设备就能够实现短时间快速合成目标肽，大大降低了反应能耗的同时又避免了加热产生的副产物问题，有利于高纯度肽的合成。并且，微流控芯片反应器体积小，便于组装携带，省去了传统反应器复杂的预加热和加热保温结构，极大简化了反应装置，在药物研发领域有着广阔的商用前景。
26.另外，所述步骤s2与s7的反应过程中还进行用于动态监测脱保护反应进度的监测步骤，所述监测步骤具体为：切换至颗粒截留状态，从反应芯片10出口侧的管道末端收集脱保护混合液，采用荧光光谱法测试保护基的荧光谱图，fmoc基团在314nm附近有特征的荧光发射，随着脱保护反应时间的延长，fmoc基团会被从延伸的肽链上切掉而在溶液中富集，通过谱峰的强弱便可直观判定在哪个时刻脱保护反应进行完全、达到精确调控脱保护反应时间的目的，解决了现有研究中以经验值或充足的时间来完成反应的不确定性。
27.如图1所示，本实施例合成方法采用的微流控芯片固相肽合成装置，包括反应芯片10、进样器20以及逆推器30，所述反应芯片10内设有微通道100，所述反应芯片10的入口通过管道连通至进样器20的输出端，所述反应芯片10的出口通过管道连通至逆推器30的输出端。所述反应芯片10出口侧的管道末端具有颗粒截留状态与颗粒放行状态的两种状态且可切换，具体的切换方式可以采用在管道末端安装砂芯滤头再安装逆推器30，即切换至颗粒截留状态；而拆除砂芯滤头而在管道末端直连逆推器30，即切换至颗粒放行状态。当然，两种状态的切换，也可以在管道与逆推器30相接处设置滤芯位置可切换的滤头组件，或者其他结构设计。
28.本实施例的进样器20和逆推器30均可以采用由注射泵控制的注射器，通过注射泵的泵压及方向的控制实现进样器20和逆推器30交叉推进与回拉，并使得管道和微通道100内的树脂颗粒和反应液往复混流，促进树脂颗粒上负载的活性位点与反应液充分接触反应。所用氨基酸的浓度始终取决于合成规模及其在所用溶剂（dmf）中的溶解度。另，所述逆
推器30的容量大于流入逆推器30内部的溶液最大容积，在进样器20和逆推器30的双向推拉过程中管道和微通道100内呈固液气三相混流，增加混流效果以及树脂颗粒流动不堵塞，适合于长链肽的合成。
实施例2
29.本实施例与上述实施例1的工艺操作区别在于缩合反应液的注入工序具体为：先用进样器20将带保护基的氨基酸注入微通道100；再用进样器20将缩合试剂注入微通道100。
30.以上显示和描述了本发明创造的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明创造精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于，具体包括如下步骤：s1、准备：在具有微通道的反应芯片的入口和出口分别通过管道连接进样器和逆推器，反应芯片出口侧的管道末端具有颗粒截留状态与颗粒放行状态；往微通道内注入溶胀后的树脂颗粒；s2、脱保护反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器往微通道内注入脱保护液，然后利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得脱保护液与树脂颗粒在微通道和管道内往返混流并进行脱保护反应；s3、排液与洗涤：切换至颗粒截留状态，通过进样器多次注入洗涤液完成将脱保护混合液排出以及洗涤树脂颗粒，而树脂颗粒被截留在管道内；s4、缩合反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器注入缩合反应液，然后利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得缩合反应液与树脂颗粒在微通道和管道内往返混流并进行缩合反应；s5、再排液与洗涤：切换至颗粒截留状态，通过进样器多次注入洗涤液完成将缩合混合液排出以及洗涤树脂颗粒，而树脂颗粒被截留在管道内；s6、重复上述步骤s2-s5的循环反应以进行肽链的延伸，得到带保护基的n肽树脂；s7、最后脱保护反应：切换至颗粒放行状态，通过进样器往微通道内注入脱保护液，然后利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得脱保护液与n肽树脂在微通道和管道内往返混流并进行脱保护反应；s8、切割、沉淀、烘干，得到目标多肽产物。2.根据权利要求1所述的微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于：所述步骤s4中的缩合反应液的注入工序具体为：预先将带保护基的氨基酸与缩合试剂混合配置成活化氨基酸溶液；再用进样器把活化氨基酸溶液注入微通道。3.根据权利要求1所述的微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于：所述步骤s4中的缩合反应液的注入工序具体为：先用进样器将带保护基的氨基酸注入微通道；再用进样器将缩合试剂注入微通道。4.根据权利要求1所述的微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于：所述切割步骤具体为：通过进样器往微通道内注入切割液，然后利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得切割液与n肽树脂在微通道和管道内往复混流并进行切割反应，最后排出与分离树脂颗粒和切肽液。5.根据权利要求1所述的微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于：所述步骤s2-s8均在常温下进行。6.根据权利要求1所述的微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于：所述步骤s2与s7的反应过程中还进行用于动态监测脱保护反应进度的监测步骤。7.根据权利要求6所述的微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于：所述监测步骤具体为：切换至颗粒截留状态，从反应芯片出口侧的管道末端收集脱保护混合液，采用荧光光谱法测试保护基的荧光谱图。8.根据权利要求1所述的微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于：所述微通道采用蛇形微通道且其转弯处采用平滑弯角设计。9.根据权利要求1所述的微流控芯片固相肽合成方法，其特征在于：所述逆推器的容量
大于流入逆推器内部的溶液最大容积，在进样器和逆推器的双向推拉过程中管道和微通道内呈固液气三相混流。10.一种微流控芯片固相肽合成装置，其特征在于：包括反应芯片、进样器以及逆推器，所述反应芯片内设有微通道，所述反应芯片的入口通过管道连通至进样器的输出端，所述反应芯片的出口通过管道连通至逆推器的输出端，且反应芯片出口侧的管道末端具有颗粒截留状态与颗粒放行状态的两种状态且可切换。

技术总结
本发明涉及一种微流控芯片固相肽合成方法及装置，步骤：往微通道内注入溶胀后的树脂颗粒；利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得脱保护液与树脂颗粒在微通道和管道内往返混流并进行脱保护反应；排液与洗涤；利用进样器和逆推器的双向推拉作用使得缩合反应液与树脂颗粒在微通道和管道内往返混流并进行缩合反应；再排液与洗涤；重复上述循环反应得到带保护基的N肽树脂；脱保护反应、切割、沉淀、烘干。本发明在反应芯片两端设置进样器和逆推器，使得反应液与固载树脂在微通道中进行双向连续流循环反应，充分接触反应，实现单步缩合反应的时间降至5min内，有效提高合成反应效率，首次实现八肽及更长链肽的片上合成，且芯片能够重复利用。片能够重复利用。片能够重复利用。


技术研发人员：田佳鑫 何润泽 洪文晶
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/7/7