一种FeNiDSAs/N-CSs纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法

一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法
技术领域
1.本发明涉及比色传感检测技术领域，尤其涉及一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法。


背景技术：

2.hrp（辣根过氧化物酶）是一种天然的纳米酶，是传统比色测定所常用的一种天然酶，但因具有成本高且稳定性差的性质，已被现今的纳米酶所替代；纳米酶是一种具有过氧化物酶活性和良好稳定性的人工合成酶，基于纳米材料制成（主要利用过氧化物酶活性的fe3o4磁性粒子）；纳米酶的用途广泛，包括生物医学领域以及比色传感领域，生物医学领域常见的如免疫测定、生物传感器、抗菌剂、抗生物膜剂以及体内临床诊断和治疗，又或者辅助体内肿瘤治疗（使用过氧化物酶或类似氧化酶的纳米材料催化h2o2或o2来提高细胞内活性氧（ros）应激水平，对癌细胞造成损害）；在比色传感领域中，可在没有大型仪器的情况下更容易实现准确快速的检测，通过反应过程肉眼可见的颜色差异，更加简便地对药物和大分子物质进行体外检测，实现可视化分析；但纳米酶在比色传感领域使用时还存在以下不足之处：纳米酶活性低导致催化效率低，同时纳米酶技术面临着复杂的尺寸、组成和固有的低活性位点密度的不足。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了解决背景技术中纳米酶催化效率低以及纳米酶技术面临着复杂的尺寸、组成和固有的低活性位点密度的问题，而提出的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法。
4.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，包括以下步骤：s1：采用煅烧法或刻蚀法制备得到feni dsas/n-css纳米材料颗粒；s2：将0.25-5 mm的胆固醇、等浓度的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶（10-30 u ml-1
）以体积比0.2-2加到0.1 m pbs（ph=7.4）中，在37 ℃下孵育30分钟；然后，将上述孵育后的全部溶液加入到体积比为1:1:8的10 mm tmb、feni dsas/n-css纳米酶悬浮液和醋酸-醋酸钠缓冲液中，在室温下孵育10分钟；s3：设置丙烯酸甲酯（ma）与
·
oh混合溶液，加入s2中所获得的溶液进行epr测试；s4：通过改变s3步骤中所获得溶液的ph值，在其与条件相同的情况下记录不同波长下吸光度；s5：通过改变s2步骤中胆固醇被分解后的溶液与纳米酶的孵育时间，在其与条件
相同的情况下记录不同波长下吸光度；s6：在所述s3步骤中，具体记载440 nm处测量荧光硫铬的荧光强度。
5.在上述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法中，在所述s1中具体采用煅烧法制备得到feni dsas/n-css纳米颗粒，将fecl3、c4h6o4ni、葡萄糖、c3n4和mg2(oh)2co3以一定质量比混合后研磨30分钟，将混合物以恒定速率加热到800℃，并在该温度下的n2气氛中保持2小时；冷却至室温后，用0.3 m盐酸溶液在60℃下腐蚀粉末，然后将混合物搅拌18小时，分离过滤得到feni dsas/n-css纳米颗粒。
6.在上述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法中，所述feni dsas/n-css纳米材料为片状结构，其内掺杂的碳纳米片feni双金属单原子负载的纳米酶催化材料。
7.在上述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法中，在所述s4步骤中，具体的记载652 nm波长下的吸光度。
8.在上述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法中，在所述s5步骤中，具体的记载652 nm波长下的吸光度。
9.在上述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法中，在所述s2中胆固醇的浓度具体为2 mm。
10.在上述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法中，在所述s2中胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的浓度具体为10 u ml-1
。
11.在上述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法中，在所述s2中胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的浓度具体为20 u ml-1
。
12.在上述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法中，在所述s2中胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的浓度具体为30 u ml-1
。
13.与现有的技术相比，本发明优点在于：1：采用煅烧法和刻蚀法制备得到feni dsas/n-css纳米材料，可与双氧水作用迅速氧化tmb，并将其与胆固醇氧化酶相结合，被应用于胆固醇的紫外可见和荧光的双模式比色传感检测，且制备方法简单、经济。
14.2：由于feni双金属单原子产生的协同效应，使得纳米酶具有更好的催化活性，同时通过与胆固醇氧化酶相结合，实现对胆固醇的超灵敏双模式比色传感分析检测，具有优越的选择性，稳定性和线性相关性。
附图说明
15.图1为feni dsas/n-css纳米酶的性能和结构表征；其中（a）为：feni dsas/n-css纳米酶在ph=4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中与tmb + h2o2反应所测得的紫外光谱；其中（b）为：sem图；其中（c）为：tem图；其中（d）为：球差图；其中（e）为：stem图；其中（f-i）为：haadf-stem-eds元素映射图。
16.图2为feni dsas/n-css纳米酶的xrd图谱；图3为feni dsas/n-css纳米酶的高分辨率的xps光谱；其中（a）为：c 1s时的xps光谱；其中（b）为：n 1s时的xps光谱；其中（c）为：ni 2p时的xps光谱；其中（d）为：fe 2p时的xps光谱；图4是feni dsas/n-css纳米酶的性能分析示意图其中（a）为：加入丙烯酸甲酯（ma）之后，吸光度明显下降的示意图；其中（b）为：epr图；图5是调节缓冲溶液的ph值、反应时间后的优化实结构示意图；其中（a）为：改变缓冲溶液ph值得到的吸光度值折线；其中（b）为：吸光度值随反应时间变化的曲线；图6是tmb与h2o2的动力学测试示意图；其中（a-b）为：h2o2动力学测试图；其中（c-d）为：tmb动力学测试图；图7为胆固醇的荧光法比色传感分析示意图；其中（a）为：不同h2o2浓度对应的荧光强度；其中（b）为：关于h2o2浓度的标准曲线图；其中（c）为：不同胆固醇浓度对应的荧光强度；其中（d）为：关于胆固醇浓度的标准曲线图；图8为胆固醇的紫外可见法比色传感分析示意图：其中（a）为：不同h2o2浓度对应的吸光度值；其中（b）为：关于h2o2浓度的标准曲线图；其中（c）为：不同胆固醇浓度对应的吸光度值；其中（d）为：关于胆固醇浓度的标准曲线图。
实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
18.参照图1-8，一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，包括以下步骤：s1：采用煅烧法或刻蚀法制备得到feni dsas/n-css纳米材料颗粒；s2：将0.25-5 mm的胆固醇、等浓度的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶（10 u ml-1
）以体积比0.2-2加到0.1 m pbs（ph=7.4）中，在37 ℃下孵育30分钟；然后，将上述孵育后的全部溶液加入到体积比为1:1:8的10 mm tmb、feni dsas/n-css纳米酶悬浮液和醋酸-醋酸钠缓
冲液中；在室温下孵育10分钟；s3：设置丙烯酸甲酯（ma）与
·
oh混合溶液，加入s2中所获得的溶液进行epr测试；s4：通过改变s3步骤中所获得溶液的ph值，在其与条件相同的情况下记录；不同波长下吸光度；s5：通过改变s2步骤中胆固醇被分解后的溶液与纳米酶的孵育时间，在其与条件相同的情况下记录不同波长下吸光度；s6：在s3步骤中，具体记载440 nm处测量荧光硫铬的荧光强度；上述值得注意的有以下几点：在s1中具体采用煅烧法制备得到feni dsas/n-css纳米颗粒，将fecl3、c4h6o4ni、葡萄糖、c3n4和mg2(oh)2co3以一定质量比混合后研磨30分钟，将混合物以恒定速率加热到800℃，并在该温度下的n2气氛中保持2小时；冷却至室温后，用0.3 m盐酸溶液在60 ℃下腐蚀粉末，然后将混合物搅拌18小时，分离过滤得到feni dsas/n-css纳米颗粒。
19.feni dsas/n-css纳米材料为片状结构，其内掺杂的碳纳米片feni双金属单原子负载的纳米酶催化材料。
20.在s4步骤中，具体的记载652 nm波长下的吸光度。
21.在s5步骤中，具体的记载652 nm波长下的吸光度。
22.图1是feni dsas/n-css纳米酶的性能和结构表征。通过图1的投射电镜图像表明，成功制备了n掺杂的碳纳米片feni双金属单原子负载的纳米酶催化材料。
23.图2是feni dsas/n-css纳米酶的xrd图谱，采用xrd进一步检测晶体结构，显示为c(120)晶面。
24.图3是feni dsas/n-css纳米酶的x-射线光电子能谱（xps）图。通过xps检测feni dsas/n-css表面化学状态，可知材料中各元素的价态和结合能。
25.图4是feni dsas/n-css纳米酶的性能分析。为了验证所制备的纳米酶材料具有过氧化物酶活性，需要对反应过程中的
·
oh进行检测。在紫外可见部分，采用了丙烯酸甲酯（ma），由于ma是
·
oh的消除剂，因此加入ma之后，吸光度值会降低。荧光部分，th本身荧光强度较弱，但经
·
oh氧化后生成硫胺素，硫胺素具有较强的荧光强度，因此也可验证催化机理。最后，进行epr测试，作为更有效的数据支撑。
26.图5是实验条件优化。基于上述研究目标和研究基础，调节缓冲溶液的ph值、反应时间等优化实验条件。通过改变缓冲溶液的ph值，在相同条件下测量在652 nm处的吸光度值，可以明显观察到ph为4.0的缓冲溶液得到的吸光度值是最大的。关于反应时间的优化，改变胆固醇被分解后的溶液与材料的反应时间，根据图5可以得出10分钟是最优良的反应时间。
27.图6是动力学测试。为了验证材料与底物的亲和力，通过紫外可见进行了关于tmb与h2o2的动力学测试。通过改变tmb的浓度或者h2o2的浓度，并固定其中一种物质的浓度，在652 nm处进行180 s的时间测量。通过米氏方程数据处理之后，可以得到对应的km值和v
max
。tmb的动力学测试km值为0.87 mm，h2o2动力学测试km值为0.99 mm，由此可见，feni dsas/n-css与底物显示出良好的亲和力。
28.图7是胆固醇的荧光法比色传感分析。如图7所示，以th为荧光探针，建立了h2o2和胆固醇的荧光检测方法。实验结果表明，h2o2浓度越高，能得到的荧光强度就越大，胆固醇也
一样。在5-40 mm的范围内获得了与h2o2浓度的良好线性相关性。对于胆固醇，在0.25 mm至5 mm的范围内实现了线性关系，这表明feni dsas/n-css纳米酶具有优异的催化性能。
29.图8是胆固醇的紫外可见法比色传感分析。如图8所示，随着h2o2浓度的增加，体系在652 nm处的吸光度升高。当h2o2浓度为5 mm至50 mm时，得到了良好的线性关系。这些结果表明，基于feni dsas/n-dss的精确响应的比色传感器在h2o2的测定中是可行的。同时，随着胆固醇浓度的增加，氧化过程中产生的h2o2越多，相应的吸光度也会增加，肉眼可见溶液颜色会更蓝。该传感器在0.25 mm至5 mm的范围内实现了良好的线性关系。
实施例
30.在本实施例中，改变纳米材料合成时的煅烧温度（500℃
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700℃），其它实验条件参照实施例一，保持不变，在此条件下，得到的产物feni dsas/n-css颗粒无法实现多孔纳米片结构，比表面积小，同时金属单原子原子化利用率低，催化位点少，由此得到的feni dsas/n-css的催化性能也大幅下降。
实施例
31.在本实施例中，改变纳米材料合成时fecl3、c4h6o4ni、葡萄糖、c3n4和mg2(oh)2co3的质量比（1:1:1:1:1以及1:1:20:20:20），其它实验条件参照实施例一，保持不变，在此条件下，得到的产物feni dsas/n-css颗粒无法形成双原子结构，难实现协同催化效应，性能也大幅下降。
实施例
32.在本实施例中，改变胆固醇被分解后的溶液与纳米酶孵育的时间（5-8 min），其它实验条件参照实施例一，保持不变，在此条件下，纳米酶催化氧化时间较短，所产生的ox-tmb和荧光硫铬的量较少，最终测试结果不佳。
实施例
33.在本实施例中，改变胆固醇被胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶分解的时间（10-20 min），其它实验条件参照实施例一，保持不变，在此条件下，胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶催化氧化胆固醇时间较短，产生的h2o2较少，导致最终测试结果不佳。
实施例
34.在本实施例中，改变s2中胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的浓度的浓度（具体为20 u ml-1
），其它实验条件参照实施例一，保持不变，在此条件下，胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶催化氧化胆固醇时间相对有所提高。
实施例
35.在本实施例中，改变s2中胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的浓度的浓度（具体为30 u ml-1
），其它实验条件参照实施例一以及实施例二，保持不变，在此条件下，胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶催化氧化胆固醇时间进一步有所提高。
36.根据实施例一到实施例七可知，feni dsas/n-css纳米酶作为过氧化物酶模拟物与胆固醇氧化酶结合的建构过程中纳米酶的合成手段、胆固醇被分解时间和胆固醇被分解后的溶液与材料的反应时间是至关重要的。
37.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：采用煅烧法或刻蚀法制备得到feni dsas/n-css纳米材料颗粒；s2：将0.25-5 mm的胆固醇、等浓度的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶（10-30 u ml-1
）以体积比0.2-2加到0.1 m pbs（ph=7.4）中，在37℃下孵育30分钟；然后，将上述孵育后的全部溶液加入到体积比为1:1:8的10 mm tmb、feni dsas/n-css纳米酶悬浮液和醋酸-醋酸钠缓冲液中，在室温下孵育10 分钟；s3：设置丙烯酸甲酯（ma）与
·
oh混合溶液，加入s2中所获得的溶液进行epr测试；s4：通过改变s3步骤中所获得溶液的ph值，在其与条件相同的情况下记录不同波长下吸光度；s5：通过改变s2步骤中胆固醇被分解后的溶液与纳米酶的孵育时间，在其与条件相同的情况下记录不同波长下吸光度；s6：在所述s3步骤中，具体记录440 nm处测量荧光硫铬的荧光强度。2.根据权利要求1所述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，在所述s1中具体采用煅烧法制备得到feni dsas/n-css纳米颗粒，将fecl3、c4h6o4ni、葡萄糖、c3n4和mg2(oh)2co3以一定质量比混合后研磨30分钟，将混合物以恒定速率加热到800℃，并在该温度下的n2气氛中保持2小时；冷却至室温后，用0.3 m盐酸溶液在60℃下腐蚀粉末，然后将混合物搅拌18小时，分离过滤得到feni dsas/n-css纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，所述feni dsas/n-css纳米材料为片状结构，其内掺杂的碳纳米片feni双金属单原子负载的纳米酶催化材料。4.根据权利要求1所述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，在所述s4步骤中，具体的记载652 nm波长下的吸光度。5.根据权利要求1所述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，在所述s5步骤中，具体的记载652 nm波长下的吸光度。6.根据权利要求1所述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，在所述s2中胆固醇的浓度具体为2 mm。7.根据权利要求6所述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，在所述s2中胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的浓度具体为10 u ml-1
。8.根据权利要求6所述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，在所述s2中胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的浓度具体为20 u ml-1
。9.根据权利要求6所述的一种feni dsas/n-css纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，其特征在于，在所述s2中胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的浓度具体为30 u ml-1
。

技术总结
本发明公开了一种FeNi DSAs/N-CSs纳米酶用于胆固醇比色传感检测的分析方法，包括以下步骤：S1：采用煅烧法或刻蚀法制备得到FeNi DSAs/N-CSs纳米材料颗粒；S2：将0.25-5 mM的胆固醇、等浓度的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶（10-30 U mL-1


技术研发人员：张露 郑佳滢 李佳琪 徐帆 艾青映 冯九菊
受保护的技术使用者：浙江师范大学
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/7/7