基于双荧光染料标记的适配体检测赭曲霉毒素A的方法

基于双荧光染料标记的适配体检测赭曲霉毒素a的方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及基于双荧光染料标记的适配体检测赭曲霉毒素a的方法及使用的探针。


背景技术：

2.赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)是曲霉菌和青霉菌菌株等的次级代谢产物。赭曲霉毒素a可造成多种农作物(大麦、小麦、玉米、花生、燕麦等)、坚果、水果、食品、饲料和环境等的污染，ota污染物广泛，相关ota污染的事件经常发生。ota可通过食物链进入人体或动物体内，对人类和动物产生健康危害，产生多方面的毒性，如肾毒性、免疫毒性、致畸性和致癌性等。各个国家对很多食品中ota的最大可接受水平都有严格的限量标准。灵敏检测赭曲霉毒素a对于食品安全、环境保护、质量控制、污染物筛查、人体健康等都具有重要的意义。目前常用的ota检测方法往往依赖大型仪器如高效液相色谱、质谱等，这些仪器方法虽然具有定量准确等优势，但也有不少缺点例如仪器昂贵、需要专业的技术人员、操作步骤复杂、检测耗时、检测成本高等，不适用于快速现场检测。免疫分析技术也常用于ota的检测，需要采用抗体作为识别分子，免疫抗体的筛选和制备需要动物等，价格昂贵，而且稳定性有局限。因此，低成本、快速、灵敏检测ota具有很大的需求，但也面临挑战。
3.核酸适配体作为一种新型的亲和配体在分析传感领域显示出优势。核酸适配体可以从随机的核酸序列文库中筛选得到。适配体可通过化学的方法合成，容易制备，批间重现性好，多种功能团(如荧光染料)可修饰到适配体上。基于核酸适配体的检测技术在多个领域具有应用前景。利用高亲和力高选择性的赭曲霉毒素a的适配体可以发展新型的检测ota的分析传感方法，如电化学传感、光学检测等，但不少基于适配体的ota的方法仍存在一些局限，需要将适配体固定在电极表面或纳米材料表面、需要分离、检测时间长、步骤多、信号重现性差等。
4.因此，还需要改进的检测赭曲霉毒素a的方法。


技术实现要素：

5.本发明构建了一种双荧光染料标记的适配体用于分析ota。我们在可结合ota的适配体序列的两端分别标记荧光素(fam)染料和四甲基罗丹明(tmr)染料，作为检测ota的荧光探针。检测ota时，将适配体荧光探针与ota温育，然后在fam的激发波长下，测量fam和tmr的荧光强度，采用tmr的荧光强度和fam的荧光强度的比值(f
tmr
/f
fam
)作为检测信号用于ota的检测。所构建的荧光标记适配体与ota结合前后，荧光强度比值检测信号(f
tmr
/f
fam
)产生显著的变化，可实现检测ota。这种比率型的荧光检测模式可克服单纯依赖荧光强度变化检测方法信号容易波动的局限。
6.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.合理设计适配体序列，在适配体的两个末端分别标记上fam和tmr，通过改变适配体序列长度调控适配体上fam和tmr间的相对距离(这个相对距离意指空间上靠近程度，或
者可以理解成通过插入若干个t碱基使得tmr荧光强度和fam荧光强度比值在探针结合ota前后变化明显)等，使得荧光染料分子标记的适配体与ota结合前后tmr的荧光强度和fam的荧光强度的比值(f
tmr
/f
fam
)(采用f
tmr
/f
fam
时，随着ota浓度增加，f
tmr
/f
fam
逐渐升高，如果采用f
fam
/f
tmr
，随着ota浓度增加，f
fam
/f
tmr
降低)信号产生显著变化，且随着ota浓度的增加，f
tmr
/f
fam
信号逐渐上升。检测ota时，将荧光染料标记的适配体与ota温育，然后测定f
tmr
/f
fam
，根据f
tmr
/f
fam
信号的变化实现对ota的检测。
8.在一些实施方案中，本发明的两种荧光染料标记不受限制，只要两者如果空间靠近的话会发生荧光共振能量转移即可。
9.针对ota的检测，在一些实施方案中，所述荧光染料标记的核酸适配体探针如下：
10.seq id no:1dna序列：5'tmr-gat cgg gtg tgg gtg gcg taa agg gag cat c-3'fam，其5'末端带有四甲基罗丹明tmr标记，3'末端带有荧光素fam标记简称o31-3'fam-5'tmr。
11.seq id no:2dna序列：5'fam-gat cgg gtg tgg gtg gcg taa agg gag cat c-3'tmr，其5'末端带有fam标记，3'末端带有tmr标记，简称o31-5'fam-3'tmr。
12.seq id no:3dna序列：5'tmr-gat cgg gtg tgg gtg gcg taa agg gag cat ctt ttt ttt-3'fam，其5'末端带有tmr标记，3'末端带有fam标记，简称o31-t8-3'fam-5'tmr。
13.seq id no:4dna序列：5'fam-gat cgg gtg tgg gtg gcg taa agg gag cat ctt ttt ttt-3'tmr其5'末端带有fam标记，3'末端带有tmr标记，简称o31-t8-5'fam-3'tmr。
14.具体来说，本发明提供以下技术方案：
15.一方面，本发明提供检测赭曲霉毒素a的探针，其特征在于，所述探针包括赭曲霉毒素a的适配体和两种荧光染料标记，所述荧光染料标记位于所述适配体的两端，所述两种荧光染料标记在空间靠近时能够发生荧光共振能量转移。
16.在一些实施方案中，所述适配体的序列为gat cgg gtg tgg gtg gcg taa agg gag cat ct
x
，其中x为选自0至10的整数。
17.在一些实施方案中，所述荧光染料标记为fam和tmr。
18.在一些实施方案中，所述适配体的5'末端带有fam标记，3'末端带有tmr标记。
19.在一些实施方案中，x为8。
20.另一方面，本发明提供赭曲霉毒素a的检测方法，其特征在于，所述方法包括在结合缓冲溶液中将上述探针与赭曲霉毒素a混合，室温下温育，然后采用荧光光度计对样品进行荧光信号的测定，根据两种荧光染料标记的荧光强度的比值信号变化检测赭曲霉毒素a的存在及浓度。
21.在一些实施方案中，利用f
3'末端荧光染料的荧光强度
/f
5'末端荧光染料的荧光强度
的信号变化检测赭曲霉毒素a的存在及浓度。
22.在一些实施方案中，所述结合缓冲液包括20mm tris-hcl(ph 7.5)，120mm nacl,和20mm cacl2。
23.另一方面，本发明提供上述探针在制备检测赭曲霉毒素a的试剂盒中的用途。
24.另一方面，本发明提供检测赭曲霉毒素a的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述探针和结合缓冲液。
25.本发明具有如下的优点和效果：
26.本发明提供具有双荧光染料标记的适配体，可实现利用两个荧光染料的荧光强度的比值信号来检测赭曲霉毒素a。在可高亲和力、高选择性识别赭曲霉毒素a的适配体的两端分别修饰荧光素(fam)和四甲基罗丹明(tmr)两种荧光染料，作为荧光探针。同一激发波长下，分别测定四甲基罗丹明的荧光强度和荧光素的荧光强度，采用四甲基罗丹明的荧光强度和荧光素的荧光强度的比值作为检测信号。该探针与赭曲霉毒素a结合前后，相应的荧光强度比值信号产生明显变化，可实现对目标分子赭曲霉毒素a的检测。在优化的实验条件下，可以实现对赭曲霉毒素a的检测，检测限为61pm。这种检测方法具有诸多优点，在均相溶液中进行，不需要分离、不需要固定分子、检测快速、信号稳定、操作简单、灵敏度高等优势。
附图说明
27.图1示出了o31-3'fam-5'tmr探针对ota的荧光信号响应情况，其中a示出了空白样品和含有ota的样品的荧光光谱图，b示出了空白样品和ota样品对应的荧光强度比值信号f
tmr
/f
fam
。
28.图2比较了不同适配体荧光探针对ota的f
tmr
/f
fam
信号响应情况。
29.图3示出了采用o31-t8-5'fam-3'tmr检测ota的结果。
30.图4示出了采用o31-t8-5'fam-3'tmr进行检测的选择性结果。
具体实施方式
31.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
32.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料和试剂，如无特殊说明，均为自常规试剂公司购买得到的。
33.所用带有荧光染料分子标记的dna序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成制备纯化。
34.检测ota时，在结合缓冲溶液(20mm tris-hcl(ph 7.5)，120mm nacl,和20mm cacl2)中将fam和tmr标记的适配体探针(终浓度为50nm)与ota混合，室温下温育30分钟(也可以温育更短时间，例如10分钟或更短时间)，然后采用荧光光度计(jasco fp-8300,日本)对样品进行荧光信号的测定。荧光光谱扫描时，激发波长设定为493纳米，荧光发射光谱的波长扫描范围为505纳米至650纳米，激发光和发射光的狭缝宽度均设定为5纳米，荧光检测均在25℃下进行。测定520纳米处的发射荧光强度，对应fam的荧光强度f
fam
，测定575纳米处的发射荧光强度，对应tmr的荧光强度f
tmr
。tmr的荧光强度与fam的荧光强度的比值信号f
tmr
/f
fam
用于检测ota。
35.实施例1：ota结合时seq id no:1dna o31-3'fam-5'tmr荧光信号变化
36.我们将50nm适配体荧光探针o31-3'fam-5'tmr与ota(青岛普瑞邦生物工程有限公司)在(20mm tris-hcl(ph 7.5)，120mm nacl,和20mm cacl2)中室温温育30分钟，然后利用荧光光度计分别测定空白样品(blank)和含有100nm ota的样品的测定荧光光谱信号，结果如图1a所示。空白样品的荧光光谱图显示在520纳米处和575纳米处，出现荧光峰，分别对应荧光探针的fam和tmr的荧光信号。ota加入前后，荧光光谱信号产生明显变化，这是由于ota和适配体荧光探针结合后，适配体构象发生改变，导致fam和tmr的荧光信号强度产生变化。
我们发现空白样品(空白样品是不含有ota的样品)和ota样品对应的荧光强度比值信号f
tmr
/f
fam
明显不同(空白样品对应f
tmr
/f
fam
为1.61，ota样品对应f
tmr
/f
fam
约1.02)，与空白样品的f
tmr
/f
fam
相比较，ota样品的f
tmr
/f
fam
降低，f
tmr
/f
fam
比值下降了约0.6。这一结果表示对于探针o31-3'fam-5'tmr，ota存在时，探针的f
tmr
/f
fam
降低。
37.实施例2：不同适配体探针对ota的荧光信号响应
38.我们设计了几种不同的探针seq id no:1dna、seq id no:2dna、seq id no:3dna、seq id no:4dna，我们比较了不同荧光探针对ota的信号响应。将50nm适配体荧光探针与ota在(20mm tris-hcl(ph 7.5),120mm nacl，和20mm cacl2)中室温温育30分钟，然后利用荧光光度计分别测定空白样品(blank)的f
tmr
/f
fam
值和含有100nm ota的样品的f
tmr
/f
fam
值。图2显示了不同荧光探针、空白样品和ota样品的f
tmr
/f
fam
信号。对于空白样品，不同的荧光探针显示了不同的f
tmr
/f
fam
值。ota存在时，不同的荧光探针给出了不同的f
tmr
/f
fam
信号变化，其中seq id no:1dna o31-3'fam-5'tmr，ota加入后，f
tmr
/f
fam
降低，降低约0.6。seq id no:2dna o31-5'fam-3'tmr，ota加入后，f
tmr
/f
fam
降低，降低约0.6。seq id no:3dnao31-t8-3'fam-5'tmr，ota加入后，f
tmr
/f
fam
略有增加，增加值约为0.1。seq id no:4dna o31-t8-5'fam-3'tmr，ota加入前后，f
tmr
/f
fam
信号变化幅度最大，ota存在时，f
tmr
/f
fam
信号明显增加，增加值约为2.6。相应的实验结果表明所设计的探针seq id no:4dna o31-t8-5'fam-3'tmr具有更灵敏的信号变化，是优选的荧光探针。可能是fam和tmr标记位置比较合适，而且两者空间距离比较合适，因此f
tmr
/f
fam
信号增加，而且变化幅度大，可用于检测ota。
39.实施例3：采用seq id no:4dna o31-t8-5'fam-3'tmr检测ota
40.seq id no:4dna o31-t8-5'fam-3'tmr可用于比率型检测ota，根据f
tmr
/f
fam
信号的改变实现对ota检测。我们将50nm o31-t8-5'fam-3'tmr与ota在反应缓冲溶液(20mm tris-hcl(ph 7.5),120mm nacl，和20mm cacl2)中在25℃温育30分钟，然后采用荧光光度计测定f
tmr
/f
fam
信号。随着ota浓度增加，f
tmr
/f
fam
信号逐渐升高，如图3所示。ota的检测范围为0.061nm至500nm，检测限为0.061nm。
41.实施例4：检测方法选择性的考察
42.我们考察了分析方法检测ota时的选择性。我们考察多种小分子，包括赭曲霉毒素b(otb)、黄曲霉毒素b1(afb1)、伏马毒素b1(fb1)、伏马毒素b2(fb2)和玉米赤霉烯酮(zae)(上述试剂均购自青岛普瑞邦生物工程有限公司)采用相同的实验条件进行检测，50nm seq id no:4dna o31-t8-5'fam-3'tmr与考察的小分子(浓度为200nm)在反应缓冲溶液(20mm tris-hcl(ph 7.5)，120mm nacl，和20mm cacl2)中温育30分钟后，采用荧光光度计测定f
tmr
/f
fam
信号。其他小分子如otb、afb1、fb1、fb2、zae存在时(浓度为200nm)，相对于空白样品荧光探针的f
tmr
/f
fam
信号值(4.42)没有显著变化，分别为4.51，4.43，4.43，4.42，4.43，而200nm ota存在时荧光探针的f
tmr
/f
fam
信号明显增加(6.96)，表明检测方法具有选择性(图4)。
43.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.检测赭曲霉毒素a的探针，其特征在于，所述探针包括赭曲霉毒素a的适配体和两种荧光染料标记，所述荧光染料标记位于所述适配体的两端，所述适配体的序列为gat cgg gtg tgg gtg gcg taa agg gag cat ct
x
，其中x为选自0至10的整数，所述两种荧光染料标记在空间靠近时能够发生荧光共振能量转移。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光染料标记为fam和tmr。3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，所述适配体的5'末端带有荧光素fam标记，3'末端带有tmr标记。4.根据权利要求1-3中任一项所述的探针，其特征在于，x为8。5.检测赭曲霉毒素a的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的探针和结合缓冲液。6.赭曲霉毒素a的检测方法，其特征在于，所述方法包括在结合缓冲溶液中将权利要求1-4中任一项所述的探针与赭曲霉毒素a混合，室温下温育，然后采用荧光光度计对样品进行荧光信号的测定，根据两种荧光染料标记的荧光强度的比值信号变化检测赭曲霉毒素a的存在及浓度。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用f
3'末端荧光染料的荧光强度
/f
5'末端荧光染料的荧光强度
的信号变化检测赭曲霉毒素a的存在及浓度。8.根据权利要求5所述的试剂盒或根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述结合缓冲液包括20mm tris-hcl(ph 7.5)，120mm nacl，和20mm cacl2。9.权利要求1-4中任一项所述的探针在制备检测赭曲霉毒素a的试剂盒中的用途。

技术总结
本发明提供检测赭曲霉毒素A的探针，其特征在于，所述探针包括赭曲霉毒素A的适配体和两种荧光染料标记，所述荧光染料标记位于所述适配体的两端，所述适配体的序列为GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAG CAT CT


技术研发人员：赵强 孙安荣 于皓
受保护的技术使用者：中国科学院生态环境研究中心
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/7/7