一种具有降解葡聚糖和壳聚糖的双功能酶、基因及应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种具有降解葡聚糖和壳聚糖的双功能酶、基因及应用。


背景技术：

2.β-葡聚糖是由d-葡聚糖通过β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的非淀粉类多糖，是谷物水溶性膳食纤维的主要成分，其黏度大的特点使其在工业生产中造成不利影响。β-葡聚糖酶能够通过裂解β-葡聚糖分子中的1,3-β-糖苷键和1,4-β-糖苷键，使之成为低聚糖或单糖，降低其黏度。作为一种重要的糖苷水解酶，β-葡聚糖酶已被应用在啤酒酿造、饲料工业、生物燃料、生物防治等多个领域。壳聚糖又称为脱乙酰甲壳素，是由乙酰氨基葡萄糖和氨基脱氧葡萄糖通过β-1,4糖苷键组成的线性多糖。壳聚糖经壳聚糖酶降解能够得到聚合度在2～20之间的壳寡糖，又称为低聚壳聚糖，其由于高水溶性，高生物相容性、可生物降解性等优势被应用于畜禽养殖、医药保健、农业种植等领域。
3.自然界中的微生物是β-葡聚糖酶和壳聚糖酶的主要来源，但在工业应用中仍需要提高酶的催化活性，因此，挖掘高效的可以同时降解β-葡聚糖和壳聚糖的双功能酶及其基因具有重要的意义。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的第一个目的是提供一种具有降解葡聚糖和壳聚糖的双功能酶即glu7酶，该双功能酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
5.本发明的第二个目的是提供一种编码上述双功能酶的基因，该基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6.本发明的第三个目的是提供一种重组载体，该重组载体包括上述核苷酸序列如seq id no.2所示的基因片段。
7.本发明的第四个目的是提供一种工程菌，该工程菌包括上述重组载体或核苷酸序列如seq id no.2所示的基因片段。
8.本发明第五个目的是提供上述双功能酶在降解葡聚糖和壳聚糖方面的应用，该应用过程具体为：以葡聚糖和壳聚糖为底物，加入上述双功能酶，在40-60℃，ph为5-7条件下进行酶解反应。
9.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
10.进一步地，葡聚糖和壳聚糖的质量浓度均为1-10％。
11.进一步地，双功能酶的用量为1-5u/ml。
12.进一步地，酶解条件为50-60℃，ph为6-7。
13.进一步地，酶解过程中向反应体系中加入co
2+
、cu
2+
、fe
2+
、zn
2+
。
14.进一步地，酶解过程中向反应体系中加入co
2+
、cu
2+
、fe
2+
、zn
2+
的浓度为5-500mmol/l。
15.上述双功能酶应用在降解葡聚糖和壳聚糖方面时，为了提高酶活力，可通过发酵罐的形式对含有双功能酶基因的重组菌进行培养，然后发酵诱导，提纯来提高双功能酶的活力，具体培养基和培养条件如下：胰蛋白胨8g/l、酵母粉20g/l、甘油2ml/l，kh2po
4 2.31g、k2hpo4·
3h2o 12.54g，初始ph值7.0，培养基装液量为70/250ml，接种量为3％时，重组菌诱导6h后，发酵罐的β-葡聚糖酶活力为232.70u/ml。
16.本发明具有以下有益效果：
17.本发明利用宏基因组测序数据筛选出了一种新的水解纤维素及多糖复合物的酶基因，为挖掘微生物中酶基因资源提供了一种新思路。本发明筛选出的新的双功能酶记为glu7酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示，编码该双功能酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。该双功能酶可高效降解葡聚糖和壳聚糖，具体为：该双功能酶在摇瓶水平上β-葡聚糖酶活为112.76u/ml，最适作用条件为50℃，ph6.0，且在50℃具有很好的稳定性；在摇瓶水平上壳聚糖酶活为63.32u/ml，最适作用条件为50℃，ph7.0。此外，金属离子如co
2+
、cu
2+
、fe
2+
、zn
2+
均可激活β-葡聚糖酶活和壳聚糖酶活。此外，本发明还通过发酵罐扩大培养提高glu7的酶活力。
18.现有酶水解葡聚糖或壳聚糖时均在酸性条件下进行，而本发明提供的双功能酶可在中性条件下水解葡聚糖和壳聚糖，拓宽了水解葡聚糖和壳聚糖的条件，使其在动物饲料、畜禽养殖等领域有更广泛的应用前景。
附图说明
19.图1为重组表达载体构建过程中的双酶切电泳结果；其中，m：marker；1：pet-30a(+)质粒双酶切结果；2：pet-30a(+)质粒。
20.图2为重组菌诱导表达后sds-page电泳结果；其中，m：marker；1：空载对照菌；2：上清；3：破碎后上清。
21.图3为重组酶诱导表达条件优化sds-page电泳结果。
22.图4为纯化后重组酶的sds-page电泳结果；其中，m：marker；1：粗酶液；2：流穿液；3：洗杂液；4～7：纯化管1、管2、管3、管4。
23.图5为glu7β-葡聚糖酶活性和壳聚糖酶活性的最适温度测定结果。
24.图6为glu7β-葡聚糖酶活性和壳聚糖酶活性的最适ph测定结果。
25.图7为glu7β-葡聚糖酶活性和壳聚糖酶活性的热稳定性测定结果。
26.图8为重组菌4种基础培养基生长曲线测定结果。
27.图9为重组菌4种基础培养基β-葡聚糖酶活测定结果。
28.图10为重组菌在摇瓶条件下，接种量优化测定结果。
29.图11为重组菌在摇瓶条件下，培养基初始ph优化测定结果。
30.图12为重组菌在摇瓶条件下，装液量优化测定结果。
31.图13为发酵罐中β-葡聚糖酶活和od
600
测定结果。
具体实施方式
32.本发明利用宏基因组测序数据筛选出可降解天然纤维素的菌群中的gh家族相关完整基因序列(glu7)，其全长1164bp，经blast比对确定其为新基因，然后进行基因克隆，并
在大肠杆菌bl21菌株中表达，为了提高双功能酶的诱导表达量，对诱导表达条件进行优化，该双功能酶的最佳诱导表达条件为iptg终浓度0.25mmol/l，37℃下诱导6h。此外，还对该双功能酶的酶学性质进行研究，具体表现为：该双功能酶的β-葡聚糖酶活最适作用温度为50℃，最适作用ph为6.0；在50℃下处理60min仍能保持80％以上的酶活力，具有较好的热稳定性；glu7的壳聚糖酶活性最适温度和ph分别是50℃、ph7.0。在摇瓶水平上重组菌的β-葡聚糖酶活力达到112.76u/ml，壳聚糖酶活力达到63.32u/ml；na
+
、k
+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、mn
2+
、fe
2+
、cu
2+
、co
2+
、ni
2+
、edta对壳聚糖酶活力均有激活作用，其中cu
2+
、ca
2+
、ni
2+
、mn
2+
对壳聚糖酶活力的激活作用最强；co
2+
、cu
2+
、fe
2+
、zn
2+
则均对β-葡聚糖酶活力有激活作用。
33.以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
34.实施例1：
35.一、重组酶基因glu7的克隆
36.1、降解纤维素相关基因的筛选
37.对降解纤维素的菌进行宏基因组测序数据分析，从测序数据中筛选出一个gh8家族的完整β-葡聚糖基因序列(glu7)，该基因全长1164bp，编码387个氨基酸，与ncbi数据库比对确定该基因与来自paenibacillus ihbetae ihbb 9852(cp016809.1)的gh8家族的葡聚糖酶基因同源性100％，但缺少n端22个氨基酸(wp_099477748)。
38.筛选出的基因序列如下所示：
39.atgctgccggcgggactgtccatggcggagaatcagaggccgtttccg
40.cagcatacgacatatacgagcggttcgatcaagcccaaccatgtgacg
41.cagacggcgatggacgaagccgtcaagagtaagtggaacagctggaa
42.ggcttcgtttctcaagcctgccggcacggggcaatattacgtaaaatac
43.aactcggccggggaaaccgtatcggaggcccacggctacgggatgatc
44.ctgacggtcatgatggccggagccgatgccaacgctcagacatacttc
45.gatggactgtaccgatattataaggctcatccgagcaaccagaatccat
46.acttaatggcctggaaacagaacagcagcttccagaacattgagggg
47.gccaactcggcgacggacggcgatatggatatcgcatacgccctcctgt
48.tggcagatagacagtggggcagcagcggaagcattaactatctgcaag
49.cggccaagaacatcataggcgcaatcatgagccatgacgtgaatcaat
50.cgcaatggactcttcgtctgggagattgggcgacgagcggcagcttca
51.atacagccacgcgcccgtccgatttcatgctgaaccatctgaaggcgtt
52.ccggaaggctaccggggatgccagatgggatcaggtaatcgacaaaac
53.atacagcatcatcaactccgttcacggcagctatagcccgaatacgggg
54.ctgcttccggatttcgtcgtgctgcagggggggagctatcagcctgcg
55.gcggccggcttccttgaaggtgcgaacgacgggaactattattacaat
56.tcggcacggacgccttggcgaatcgccaccgactatttgatgaccggc
57.gatacgagggccttgggacagctcgatttgatgaacgcgttcatcaaa
58.tcgaatacgagccagaagccggcaaatatcaaggcaggctatacgctc
59.ggcggaagcccgcttgtgtcgtataacagcggcgcattctacgccccg
60.ttcggcatcagcgcgatggtctcccagagccaccaaagctggctgaac
61.gtcgtgtggacctatacggcgaatgcatcggccgagggatattacgaa
62.gaaagcatcaagctgttctcgatgctggtcatgtccgggaattggtggagctattaa(seq id no.5)
63.根据筛选出的基因序列，设计聚合酶链式反应引物，进行pcr扩增，反应引物、pcr扩增体系和pcr反应程序如下：
64.上游引物序列：5'-gcggccgcatgctgccggcgggactg-3'(seq id no.3)；
65.下游引物序列：5'-ttagtaggtccaccaattcccgg ggtacc-3'(seq id no.4)。
66.pcr反应体系：2
×
san taq pcr mix 10μl，上游引物(36μl/100μm)1μl，下游引物(47μl/100μm)1μl，模板dna1μl，超纯水7μl，总体积20μl。
67.pcr反应条件：94℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃90s，30个循环，72℃5min。
68.pcr产物使用axyprep dna凝胶回收试剂盒进行目的基因片段胶回收。
69.2、glu7密码子的优化
70.外源基因在大肠杆菌中进行异源蛋白质表达时，由于密码子偏性的原因，导致重组蛋白的表达量很低。经过密码子优化，将低频密码子替换为高频密码子，能够提高重组蛋白的合成效率，进而提高重组蛋白的表达量。
71.氨基酸序列如下所示：
72.mlpaglsmaenqrpfpqhttytsgsikpnhvtqtamdeavkskwnswkasflkpagtgqyyvkynsagetvseahgygmiltvmmagadanaqtyfdglyryykahpsnqnpylmawkqnssfqniegansatdgdmdiayallladrqwgssgsinylqaakniigaimshdvnqsqwtlrlgdwatsgsfntatrpsdfmlnhlkafrkatgdarwdqvidktysiinsvhgsyspntgllpdfvvlqggsyqpaaagflegandgnyyynsartpwriatdylmtgdtralgqldlmnafiksntsqkpanikagytlggsplvsynsgafyapfgisamvsqshqswlnvvwtytanasaegyyeesiklfsmlvmsgnwwsy(seq id no.1)
73.基因密码子优化后完整序列信息如下所示：
74.atgctgccggcgggtctgagcatggctgaaaaccagcgtccgttcccgcagcacaccacctacacctctggtagcatcaaaccgaaccacgtgacccagaccgcgatggatgaagcagttaaatctaaatggaactcctggaaagctagcttcctgaaaccggcgggcaccggtcagtactatgttaaatataattccgctggtgaaaccgtgagtgaagcccacggttatggtatgattctgaccgtgatgatggcgggtgctgatgctaatgcgcagacttattttgatggcctgtaccgttactataaagctcatccatctaaccagaacccgtatctgatggcttggaaacagaactcttctttccagaacatcgaaggcgcgaactctgcgaccgatggcgacatggacatcgcgtacgcgctgctgctggcggaccgtcagtggggtagcagcggcagcatcaactacctgcaggctgcaaaaaacatcatcggcgcgatcatgagccacgatgttaaccagagccagtggaccctgcgtctgggtgattgggcgacctctggcagcttcaacaccgcgacccgtccgtctgacttcatgctgaaccacctgaaagcgttccgtaaagcgaccggcgatgcacgttgggatcaggttattgataaaacctacagcatcatcaacagcgttcacggctcttacagcccgaacaccggtctgctgccggatttcgttgttctgcagggcggcagctaccagccggcggcggcgggtttcctggaaggtgcgaacgatggcaactactactacaactctgcgcgtaccccgtggcgtatcgcgaccgattatctgatgaccggcgatacccgtgcgctgggccagctggatctgatgaacgctttcatcaaatctaacaccagccagaaaccggcgaacatcaaagcgggctacaccctgggcggcagcccgctggttagctacaacagcggcgcgttctacgcgccgttcggtatctccgcgatggttagccagagccaccagagctggctg
aacgttgtttggacctacaccgcgaacgctagcgcggaaggttactacgaagaatctatcaaactgttctctatgctggttatgagcggtaactggtggtcctactaa(seq id no.2)。
75.二、原核表达载体的构建与转化
76.将目的基因与pet-30a(+)质粒用kpni和xhoi双酶切，用t4 dna连接酶16℃连接16h，连接产物用热激法转化入感受态细胞大肠杆菌dh5α中，通过含50μg/ml卡那霉素的lb平板筛选阳性克隆，经pcr及测序鉴定。从pet-30a(+)-dh5α克隆菌株中提取重组质粒，纯化后通过热激法转化入表达菌株大肠杆菌bl21(de3)中，通过含50μg/ml卡那霉素的lb平板筛选阳性克隆，经pcr、双酶切及测序验证后进行诱导表达，其结果见图1。
77.由图1可知，pet-30a(+)质粒大小为5422bp，基因glu7片段大小为1164bp，均与1号泳道的两个条带片段大小相吻合，说明全基因合成及原核表达载体构建成功。
78.三、重组酶glu7的诱导表达及诱导条件优化
79.挑取转化后的重组菌单菌落到含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，以5％的接种量转接至100ml的上述培养基中，振荡培养2～3h左右，至a600达0.5～0.8，取1ml诱导前样品，-20℃保存，其余样品中加入iptg至终浓度为0.5mmol/l，37℃振荡培养。培养6h后，取1ml诱导后样品，-20℃保存。将诱导前及诱导后样品12000r/min离心1min，分别收集菌体沉淀，分别加入75μl pbs(ph7.4)缓冲液和25μl4
×
sds上样缓冲液，剧烈振荡1min，使菌体完全溶菌。经sds-page分析确认诱导表达的重组蛋白，结果见图2。由图2可知，glu7基因表达的蛋白为胞内蛋白，且蛋白分子量大小与根据基因片段长度计算的蛋白分子量大小42.57kd相吻合。
80.此外，分别从iptg浓度，诱导温度及诱导时间等方面进行重组蛋白的诱导表达条件的优化。使加入iptg的终浓度分别为0.25mmol/l、0.5mmol/l以及0.75mmol/l、1mmol/l进行诱导表达，通过sds-page电泳确定最适的iptg诱导浓度；在最适的iptg诱导浓度条件下，分别在28℃、30℃、37℃三个温度梯度下进行诱导表达，通过sds-page电泳确定最佳培养温度；在最适的iptg诱导浓度和诱导温度下分别设置2h、4h、6h、8h、10h的时间梯度，确定出最佳诱导时间。
81.重组酶诱导表达条件优化结果见图3；其中，图3a为iptg浓度对重组蛋白表达量影响结果；图3b为温度诱导表达条件优化结果；图3c为时间诱导表达条件优化结果。
82.图3a中，m为蛋白标准分子量；1～7分别为诱导前、0mm、0.25mm、0.50mm、0.75mm、1mm、空载对照菌。
83.图3b中，m为蛋白标准分子量；1：28℃；2：30℃；3：37℃；4：诱导前。
84.图3c中，m为蛋白标准分子量；1～6分别为诱导2h、4h、6h、8h、10h、诱导前。
85.由图3可知，优化后的最佳诱导表达条件为：最佳iptg诱导浓度为0.25mmol/l，经过0.25mmol/l的iptg诱导后，重组蛋白在37℃，诱导6h后表达量达到最高。
86.四、重组酶glu7的纯化
87.重组酶glu7经0.25mmol/l iptg在37℃下诱导6h后，4℃下，4000r/min离心10min后收集菌体细胞，用pbs(ph7.4)缓冲液洗涤菌体2次，超声波破碎，在4℃，12000r/min离心30min，得到粗酶液。
88.使用ni-nta柱纯化重组蛋白，用超纯水洗涤，洗去20％的乙醇，除尽基质中的空气，用binding buffer平衡柱子，将粗酶液上样，4℃结合1h，用washing buffer洗杂蛋白，
用分别含20mmol/l、50mmol/l、100mmol/l、150mmol/l、200mmol/l、250mmol/l、500mmol/l、1000mmol/l咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液，确定洗脱液中咪唑的最佳浓度，用超纯水洗涤柱子，再用20％的乙醇冲洗柱子，置于4℃保存。得到纯化的酶液后，用sds-page电泳验证条带大小及纯度，结果见图4。纯化过程中目标蛋白的回收率及纯化倍数见表1。
89.由图4可知，在43kd处有单一条带，与预测的蛋白分子量42.57kd相吻合。
90.由表1可知，纯化后重组酶glu7的β-葡聚糖酶的比活力由49.03u/mg提高到155.53u/mg，纯化倍数为3.17，回收率为51.86％，壳聚糖酶的比活力由27.53u/mg提高到76.89u/mg，纯化倍数为2.79。酶活力回收率为47.44％。
91.表1重组β-葡聚糖酶纯化表
[0092][0093][0094]
上述酶活力及蛋白浓度测定采用以下方法进行：
[0095]
1、采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid，dns)法测定β-葡聚糖酶活力：以1％的大麦葡聚糖为底物，0.1mol/l的磷酸缓冲液为溶剂，取200μl的底物置于离心管中预热10min，加入100μl适当稀释的酶液，混匀，50℃水浴反应10min，加入700μl dns混匀，沸水浴5min后定容至5ml，待冷却后在540nm处测其吸光度，根据葡萄糖标准曲线可得到产生还原糖的量，计算酶活力，空白管加入的酶液经灭活处理。
[0096]
2、采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid，dns)法测定壳聚糖酶活力：以1％的胶体壳聚糖为底物，0.1mol/l的磷酸缓冲液为溶剂，取350μl的底物置于离心管中预热10min，加入50μl适当稀释的酶液，混匀，50℃水浴反应10min，加入600μl dns混匀，沸水浴10min，待冷却后在540nm处测其吸光度，根据氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线得到产生还原糖的量，计算酶活力，空白管加入的酶液经灭活处理。
[0097]
3、β-葡聚糖酶活力定义：在上述反应条件下，每毫升酶液每分钟水解底物释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(u)。
[0098]
4、壳聚糖酶活力定义：在上述反应条件下，每毫升酶液每分钟水解底物释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(u)。
[0099]
5、酶的比活力定义为：每毫克蛋白所含酶活性的单位数，以u/mg表示。
[0100]
6、利用bradford法测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白(bsa)为标准品配制浓度梯度标准液，在595nm波长下测定吸光度，绘制bsa标准曲线，从标准曲线中确定酶液的蛋白质浓度。
[0101]
五、重组酶glu7的酶学性质测定
[0102]
1、最适温度测定
[0103]
用ph5的缓冲液配制1％的大麦葡聚糖及1％的胶体壳聚糖，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下测定酶活力，以最高酶活力为100％，分别计算不同温度下的相对酶活力，以温度为横坐标，以相对酶活性为纵坐标作图，结果见图5。
[0104]
2、最适ph测定
[0105]
在最适反应温度下，用不同ph值的缓冲液配制1％的大麦葡聚糖及1％的胶体壳聚糖，以酶活性最高者计为100％，计算不同反应ph下的相对酶活性。以ph为横坐标，以相对酶活性为纵坐标作图，结果见图6。
[0106]
3、热稳定性测定
[0107]
将glu7酶液分别于50℃、60℃水浴中保温，每10min取一次样，测定残余酶活力，以未经处理的酶活力计为100％，计算相对酶活性，以处理时间为横坐标，以相对酶活性为纵坐标作图，结果见图7。
[0108]
4、金属离子及化合物对酶活力的影响测定
[0109]
用0.1mol/l的磷酸缓冲液(ph7.4)稀释酶液，分别加入5mmol/l的金属离子及化合物，室温放置30min后，测其残余酶活力，以不添加金属离子及化合物处理的酶活力为100％，结果见表2。
[0110]
由图5-7可知，glu7的β-葡聚糖酶活和壳聚糖酶活的最适温度均为50℃，glu7的β-葡聚糖酶活和壳聚糖酶活的最适ph分别是ph6.0、ph7.0。glu7的β-葡聚糖酶活性在50℃处理60min后仍能保持80％以上的酶活力，具有一定的热稳定性。
[0111]
上述酶解过程中，双功能酶glu7的用量为1u/ml。
[0112]
由表2可知，na
+
、k
+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、mn
2+
、fe
2+
、cu
2+
、co
2+
、ni
2+
、edta对壳聚糖酶活力均有激活作用，其中cu
2+
、ca
2+
、ni
2+
、mn
2+
对壳聚糖酶活力的激活作用最强，分别提高了80.7％、66.23％、43.41％、42.26％。na
+
、k
+
、ca
2+
、mg
2+
、edta、ni
2+
、mn
2+
对β-葡聚糖酶活力均有抑制作用，分别降低了25.21％、23.11％、13.04％、25.05％、27.93％、29.40％、46.27％；co
2+
、cu
2+
、fe
2+
、zn
2+
则均对β-葡聚糖酶活力有激活作用，分别提高了134.03％、18.18％、10.92％、9.89％。
[0113]
表2不同金属离子及化合物对glu7酶活力的影响
[0114][0115]
六、重组菌的培养条件优化及发酵小试
[0116]
1、不同基础培养基中重组菌的生长曲线及酶活力测定
[0117]
测定在不同培养基中基因重组菌的生长曲线：挑重组菌单菌落到含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的100ml lb培养基(250ml三角瓶)中，37℃，200r/min培养12h，获得种子液。分别取5ml的种子液，转接到4种不同培养基lb、tb、sb、sob(100ml/250ml三角瓶，卡那霉素50μg/ml)，在每个培养基中加入5ml的种子液，37℃，200r/min培养，隔2h取样，测od
600
，结果见图8。
[0118]
分别在以上4种培养基中进行重组菌的诱导表达，诱导后将菌液在4℃下，4000r/min离心10min后收集菌体细胞，用pbs(ph7.4)缓冲液洗涤菌体2次，超声波破碎(功率300w，工作4s，停4s，时间10min)后4℃，12000r/min离心30min，收集上清液即粗酶液，分别测定不同培养基中重组菌的β-葡聚糖酶活力，结果见图9。
[0119]
由图8和图9可知，在tb培养基中，重组菌的生长情况最佳，且β-葡聚糖酶活性最高，因此以tb培养基为基础培养基进行培养基成分的优化。
[0120]
2、培养基成分的优化
[0121]
设计正交试验考察tb培养基中的胰蛋白胨、酵母粉、甘油这三个因素对β-葡聚糖酶活力的影响，其中这三个因素各取4个水平，以表3所示进行正交实验，确定最适培养基，结果见表4、表5。
[0122]
表3正交试验设计
[0123][0124]
表4glu7的培养基优化正交实验结果
[0125][0126][0127]
表5正交实验极差分析结果
[0128][0129]
由表5可知，三个因素的r值大小依次排列为a＞b＞c，其中胰蛋白胨因素的极差最大，培养基的最佳组合为a1b2c1，即胰蛋白胨8g/l、酵母粉20g/l、甘油2ml/l，在最适培养基的基础上，glu7的β-葡聚糖酶活力达到171.75u/ml。
[0130]
3、重组菌培养条件的优化
[0131]
以酶活性作为产酶培养条件的指标，考察接种量、初始ph、装液量各因素对酶活性的影响，确定最适的产酶培养条件。
[0132]
(1)接种量
[0133]
培养基装液量为100/250ml，ph 7.0，调节接种量分别为1％、3％、5％、7％、10％(v/v)，每个水平3个重复，37℃、200r/min振荡培养过夜，至od
600
达0.5～0.8，加入iptg至终浓度为0.25mmol/l，37℃振荡培养6h后，取样测酶活，结果见图10。
[0134]
(2)初始ph
[0135]
培养基装液量为100/250ml，接种量为3％，调节培养基初始ph分别为ph6.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5、ph8.0，每个水平3个重复，37℃、200r/min振荡培养过夜，至od
600
达0.5～0.8，加入iptg至终浓度为0.25mmol/l，37℃振荡培养6h后，取样测酶活，结果见图11。
[0136]
(3)装液量
[0137]
培养基初始ph为7.0，接种量为3％，调节装液量分别为30/250ml、50/250ml、70/250ml、100/250ml，每个水平3个重复，37℃、200r/min振荡培养过夜，至od
600
达0.5～0.8，加入iptg至终浓度为0.25mmol/l，37℃振荡培养6h后，取样测酶活，结果见图12。
[0138]
由图10～12可知，在培养基装液量为70/250ml，培养基初始ph值7.0，接种量为3％时，glu7产酶活性最高。通过对重组菌glu7培养基的优化及培养条件的优化，glu7的β-葡聚
糖酶活由112.76u/ml提高到207.99u/ml，提高了84.30％，glu7的壳聚糖酶活由63.32u/ml提高到75.48u/ml，提高了19.20％。
[0139]
4、3l发酵罐小试
[0140]
采用上述实验优化所得的培养基配方，观察发酵罐重组菌的生长情况及产酶情况。初始发酵罐发酵条件为：装液量为1.8l、温度为37℃、搅拌转速为200r/min、ph 7.0，期间通过改变转速和通气量保证溶氧恒定在20％～30％。接种量为5％(w/v)，加入卡那霉素使终浓度为50μg/ml，在接种后od
600
≈0.6时，加入终浓度为0.25mmol/l的iptg诱导，诱导温度37℃，诱导6h，隔1h取样测其od
600
及β-葡聚糖酶活力，结果见图13。
[0141]
由图13所知，发酵罐的β-葡聚糖酶活力为232.70u/ml，酶活力提高了34.13％。
[0142]
综上所述，通过对纤维素酶产生菌的宏基因组测序数据分析，筛选出了一个gh8家族的完整β-葡聚糖和壳聚糖双功能酶基因序列(glu7)，全长1164bp，重组酶glu7在sds-page中的大小约为42.6kd。重组酶在摇瓶水平上重组菌的β-葡聚糖酶活为112.76u/ml，最适作用条件为50℃，ph6.0，且在50℃具有很好的稳定性；在摇瓶水平上壳聚糖酶活为63.32u/ml，最适作用条件为50℃，ph7.0。此外，na
+
、k
+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、mn
2+
、fe
2+
、cu
2+
、co
2+
、ni
2+
、edta对glu7的壳聚糖酶活力均有激活作用，其中co
2+
、cu
2+
、fe
2+
、zn
2+
对glu7的β-葡聚糖酶活力有激活作用。在优化后的培养基和培养条件即胰蛋白胨8g/l、酵母粉20g/l、甘油2ml/l，kh2po
4 2.31g、k2hpo4·
3h2o 12.54g，初始ph值7.0，培养基装液量为70/250ml，接种量为3％时，重组菌诱导6h后，摇瓶的β-葡聚糖酶活力提高到207.99u/ml，提高了84.30％，glu7的壳聚糖酶活由63.32u/ml提高到75.48u/ml，提高了11.88％。因为glu7的β-葡聚糖和壳聚糖双功能酶活性，使其在动物饲料、畜禽养殖等领域有更广泛的应用前景。
[0143]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种具有降解葡聚糖和壳聚糖的双功能酶，其特征在于，所述双功能酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种编码权利要求1所述的双功能酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2所述的基因。4.一种工程菌，其特征在于，包括权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组载体。5.权利要求1所述的具有降解葡聚糖和壳聚糖的双功能酶在降解葡聚糖和壳聚糖方面的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用过程具体为：以葡聚糖和壳聚糖为底物，加入权利要求1所述的双功能酶，在40-60℃，ph为5-7条件下进行酶解反应。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，葡聚糖和壳聚糖的质量浓度均为1-10％。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所加入的双功能酶的用量为1-5u/ml。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，酶解条件为50-60℃，ph为6-7。10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，酶解过程中向反应体系中加入co
2+
、cu
2+
、fe
2+
、zn
2+
。

技术总结
本发明公开了一种具有降解葡聚糖和壳聚糖的双功能酶、基因及应用，该双功能酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该双功能酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用宏基因组测序数据筛选出了一种新的水解纤维素及多糖复合物的酶基因，为挖掘微生物中酶基因资源提供了一种新思路。因该双功能酶可高效降解葡聚糖和壳聚糖，因此，该双功能酶在动物饲料、畜禽养殖等领域有更广泛的应用前景。景。景。


技术研发人员：柯涛 张婉莹 孙君珂 邓箬竹 王云 牛秋红
受保护的技术使用者：南阳师范学院
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/7/7