一种血管化肠类器官的制备方法及应用

1.本发明涉及功能化组织工程的制备及应用领域，特别涉及一种血管化肠类器官的制备方法及应用。


背景技术：

2.炎症性肠病是一种慢性复发性肠上皮损伤的肠道疾病，主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。以往用于治疗炎性肠病的药物主要是α-水杨酸类，但该类药物表现出停药即反，需要长期持续性药物治疗。
3.组织器官的修复与重建一直是生物、医学等相关领域的焦点。肠类器官也称“迷你肠”，是位于肠底部隐窝的一种复杂小肠上皮细胞集合，具有组织或器官的多种生理特征。有研究表明肠类器官可以移植于结肠损伤部位，利于重构小肠绒毛隐窝结构，修复肠上皮损伤。然而，将肠类器官广泛应用于临床移植修复肠上皮损伤面临两大挑战：其一，肠道类器官缺乏血管系统，无法保证在移植的过程中肠道类器官不会因为缺乏营养而坏死；其二，培养肠类器官的支架是matrigel胶，因matrigel胶来源于小鼠肉瘤的基底膜基质，在移植的过程中有激活组织十几种癌症信号通路，易导致组织癌变。


技术实现要素：

4.本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种血管化肠类器官的制备方法及应用。
5.本发明的技术解决方案是：一种血管化肠类器官的制备方法，是将h9 人胚胎干细胞经过拟胚体分化、中胚层分化及血管祖细胞分化阶段后的血管类器官细胞与肠类器官细胞混合种入猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶中，形成细胞-胶混合液，然后在细胞-胶混合液添加培养基培养，生成血管化肠类器官。
6.具体按照如下步骤进行：步骤1.获得猪小肠粘膜下层；步骤2.配置质量/体积1%sds，对猪小肠粘膜下层4℃摇床脱细胞48h，然后用去离子水清洗猪小肠粘膜下层，再配置1%triton x-100溶液，对猪小肠粘膜下层4℃摇床脱细胞1h，得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料；步骤3.用1%pbs水溶液漂洗猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料，洗至无泡沫产生；步骤4.将猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料冷冻干燥48h，研磨成粉末，过50目筛网，称量分装在试管中；步骤5.封口膜密封试管后进行co60辐照灭菌，得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质粉末；步骤6.称量胃蛋白酶溶于0.05mol/l的冰醋酸中，用滤膜过滤除菌后倒入无菌的血清瓶中，加入猪小肠粘膜下层脱细胞基质粉末，搅拌均匀，得到10mg/ml的猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶母液；
步骤7.配置10
×
dmem和1mol/l的naoh溶液，分别用滤膜过滤除菌；取猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶母液用0.05mol/l冰醋酸稀释，按总体积9：1加入10
×
dmem，使用naoh溶液调ph=7.2-7.4，37℃下静置成胶，得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶；步骤8.将新鲜的小鼠肠用含1％三抗的pbs洗涤数次，充分剪碎后重悬于25ml的温和解离液中，孵育15min后使用70μm滤网过滤，200
×
g离心5分钟，获得肠类器官细胞；步骤9.将h9 人胚胎干细胞接种于孔板中经拟胚体分化、中胚层分化及血管祖细胞分化阶段，形成血管类器官细胞；步骤10.将肠类器官细胞和血管类器官细胞混合种入猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶中，得到细胞-胶混合液，然后将细胞-胶混合液置于培养箱内静置待其充分凝固，加入培养基培养，直至生成血管化肠类器官；所述培养基是肠类器官培养基和血管类器官培养基按照体积比1：1混合而成。
7.所述步骤6中的胃蛋白酶由胰蛋白酶或木瓜蛋白酶替代。
8.所述步骤6中的冰醋酸由盐酸或甲酸替代。
9.一种上述的血管化肠类器官在制备移植修复肠上皮损伤药物中的应用。
10.本发明是将h9 人胚胎干细胞经过拟胚体分化、中胚层分化及血管祖细胞分化阶段后的血管类器官细胞与肠类器官细胞混合种入猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶中，形成细胞-胶混合液，然后将细胞-胶混合液置于培养基中培养，生成血管化肠类器官。猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶有利于血管类器官的血管生成，其血管类器官细胞血管网分化后形成一个包含周细胞、基底膜、血管内皮细胞等复杂的集合，血管类器官管状结构明显，使肠道类器官具有更贴近人的血管体系，避免移植修复过程中肠道类器官因缺乏营养而坏死，同时还可避免采用matrigel胶培养易导致组织癌变的问题。本发明制备的血管化肠类器官在移植修复肠损伤过程中引起的宿主介导的免疫排斥反应极低，可应用于制备移植修复肠上皮损伤药物。
附图说明
11.图1为本发明实施例的猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶he染色图。
12.图2为本发明实施例构建的血管化肠类器官光镜图。
13.图3为本发明实验1培养的小鼠肠类器官光镜图。
14.图4为本发明实验2培养的血管类器官光镜图。
15.图5为本发明实验3中假手术组、肠道类器官移植组、血管化肠类器官移植组肠道he染色图及通过image j对肠绒毛长度进行半定量结果示意图。
实施方式
16.本发明的实施例中，如无特别定义，其百分比均为体积百分比。
17.本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
18.本发明的一种血管化肠类器官的制备方法，是将h9人胚胎干细胞经过拟胚体分
化、中胚层分化及血管祖细胞分化阶段后的血管类器官细胞与肠类器官细胞混合种入猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶中，形成细胞-胶混合液，然后将细胞-胶混合液置于培养基中培养，生成血管化肠类器官。具体依次按照如下步骤进行：步骤1.挑选管腔粗细均匀长约10cm，直径3-4cm的新鲜猪小肠，纱布刮去小肠黏膜层暴露黏膜下层，撕去浆膜和肌层组织，获得猪小肠粘膜下层；步骤2.配置质量/体积1%sds，对猪小肠粘膜下层4℃摇床脱细胞48h，然后用去离子水清洗猪小肠粘膜下层，再配置1%triton x-100溶液，对猪小肠粘膜下层4℃摇床脱细胞1h，更彻底的洗去细胞成分，得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料；步骤3.用1%pbs水溶液漂洗猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料，每隔6小时洗涤一次，持续36h，即洗至无泡沫产生；步骤4.将猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料冷冻干燥48h，组织研磨机下研磨成粉末，过50目筛网，称量分装100mg每只ep管中；步骤5.封口膜密封ep管后进行co60辐照灭菌，辐照剂量控制在3-4kgy，得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质粉末，放4℃备用；步骤6.称量10mg胃蛋白酶溶于10ml 0.05mol/l的冰醋酸中，用0.22μm滤膜过滤除菌后倒入无菌的血清瓶中，加入100mg猪小肠粘膜下层脱细胞基质粉末，磁力搅拌器低速搅拌48h，得到10mg/ml的猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶母液；步骤7.配置10
×
dmem和1mol/l的naoh溶液，分别用0.22μm滤膜过滤除菌，取部分猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶母液用0.05mol/l冰醋酸稀释，按总体积9：1加入10
×
dmem，使用naoh溶液调ph，当胶体变粉红色（ph=7.2-7.4）时停止调节，37℃下静置30min成胶，得到4mg/ml猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶。
19.按照组织基因组 dna 提取试剂盒说明书使用，对得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶进行dna浓度检测，检测结果为0.2ng/ul，基本无残留的dna，说明脱细胞处理能够有效减少细胞残留；按照苏木素伊红染色试剂盒说明书使用，对得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶进行h&e染色，得到的h&e染色如图1所示，h&e染色无蓝色的细胞核，说明脱细胞处理能够有效减少细胞残留。
20.步骤8.将新鲜的小鼠肠用含1％三抗的pbs洗涤数次，充分剪碎后重悬于25ml的温和解离液中，孵育15min后使用70μm滤网过滤，200
×
g离心5分钟，获得肠类器官细胞；步骤9.将h9 人胚胎干细胞接种于低粘附的六孔板中，经拟胚体分化、中胚层分化及血管祖细胞分化阶段，形成血管类器官细胞；拟胚体分化阶段：将细胞融合度达70%的h9 人胚胎干细胞接种于低粘附的6孔板中，加入3ml添加了y-27632的mtesr
™
培养基，37℃，5%co2培养箱培养1天后形成多能干细胞集落；中胚层分化阶段：将n2添加剂、b27添加剂加入dmem/f12和神经基础培养基1:1混合培养基中配置成n2、b27培养基，将多能干细胞集落转移至15ml 离心管后重力沉降，用添加了chir 99021和bmp-4的n2、b27培养基重悬沉淀于12孔板中，37℃，5%co2培养箱培养3天，每天重悬1次；血管祖细胞分化阶段：将12孔板中的细胞转移至15ml离心管内，重力自然沉淀，弃去上清，用添加了vegf-a和forskolin的n2、b27培养基重悬沉淀，将重悬后的细胞转移至原
孔板中，37℃，5%co2培养箱培养2天。
21.步骤10.将肠类器官细胞和血管类器官细胞混合种入猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶中，得到细胞-胶混合液，然后用移液器将细胞胶混合液按照150μl/孔滴到48孔板中，将48孔板放入37℃、co2培养箱内静置60min待其充分凝固，加入培养基培养。所述培养基是肠类器官培养基和血管类器官培养基按照体积比1：1混合而成，其中肠类器官培养采用小鼠肠道类器官培养基，血管类器官培养基为添加了vegf-a、fgf-2和15% fbs的stempro-34 sfm培养基。每隔2天更换一次培养基，培养6天后可得到血管化肠类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图2所示。从图2可以看出：小肠粘膜下层脱细胞基质胶可以用于培养血管化的肠类器官。
22.实验：1. 肠类器官培养1.1分别取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml实施例1的猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶母液，分别加入0.8ml、0.7ml、0.6ml、0.5ml的0.05mol/l冰醋酸，各加0.1ml 10
×
dmem后1mol/l naoh溶液调ph至胶体为粉红色，配置成1 mg/ml、2 mg/ml、3mg/ml、4 mg/ml的猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶；1.2分别取适量不同浓度的猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶与实施例1所述肠类器官细胞混合，制备成细胞-胶混合液，用移液器将细胞-胶混合液按照150μl /孔滴到48孔板中；1.3 将48孔板放入37℃、co2培养箱内静置60min待其充分凝固，加入适量小鼠肠类器官培养基；1.4每隔2天更换一次培养基，培养6天后可得到小鼠肠类器官，肠类器官平均直径在80～100μm，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图3所示。从图3可以看出：小肠粘膜下层脱细胞基质胶可以用于培养肠类器官。
23.2. 血管类器官培养2.1配置胶的工作浓度：分别取0.2ml、0.4ml实施例1的猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶母液，分别加入0.7ml、0.5ml的0.05mol/l冰醋酸，各加0.1ml 10
×
dmem后1mol/l naoh溶液调ph至粉红色，配置成2 mg/ml、4 mg/ml的猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶；以现有技术的胶原基质胶（matrigel）为对比例；2.2将实施例1步骤9所得到的血管类器官细胞，分别与不同浓度猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶及胶原基质胶混匀后种入48孔板内，加入添加了vegf-a、fgf-2和15% fbs的stempro-34 sfm培养基；2.3每隔2天更换一次培养基，在普通光学显微镜下观察前4天血管类器官形态结构，结果如图4所示。从图4可以看出：小肠粘膜下层脱细胞基质胶可以用于培养血管类器官，而4mg/ml 小肠粘膜下层脱细胞基质胶养血管类器官于第二天的血管成管情况比传统胶原基质胶养血管类器官第四天的血管成管显著。
24.3. 血管化肠类器官用于肠上皮损伤移植修复3.1 用2%dss持续喂养小鼠5天诱导结肠粘膜炎症，以构建炎性肠病小鼠模型；小鼠分组为假手术组、移植肠道类器官组和移植血管化肠道类器官组；3.2假手术组注射1ml生理盐水，移植肠道类器官组注射1ml实验1制备的肠道类器
官，移植血管化肠道类器官组注射1ml本发明实施例制备的血管化肠道类器官；3.3术后两周取小鼠结肠进行组织切片观察，结果如图5a所示，通过image j对肠绒毛长度进行半定量结果参见图5b。结果表明移植血管化肠道类器官组具有良好的肠上皮修复效果，结肠绒毛长且粗。

技术特征：
1.一种血管化肠类器官的制备方法，其特征在于：是将h9 人胚胎干细胞经过拟胚体分化、中胚层分化及血管祖细胞分化阶段后的血管类器官细胞与肠类器官细胞混合种入猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶中，形成细胞-胶混合液，然后将细胞-胶混合液置于培养基中培养，生成血管化肠类器官。2.根据权利要求1所述的血管化肠类器官的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：步骤1.获得猪小肠粘膜下层；步骤2.配置质量/体积1%sds，对猪小肠粘膜下层4℃摇床脱细胞48h，然后用去离子水清洗猪小肠粘膜下层，再配置1%triton x-100溶液，对猪小肠粘膜下层4℃摇床脱细胞1h，得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料；步骤3.用1%pbs水溶液漂洗猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料，洗至无泡沫产生；步骤4.将猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料冷冻干燥48h，研磨成粉末，过50目筛网，称量分装在试管中；步骤5.封口膜密封试管后进行co60辐照灭菌，得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质粉末；步骤6.称量胃蛋白酶溶于0.05mol/l的冰醋酸中，用滤膜过滤除菌后倒入无菌的血清瓶中，加入猪小肠粘膜下层脱细胞基质粉末，搅拌均匀，得到10mg/ml的猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶母液；步骤7.配置10
×
dmem和1mol/l的naoh溶液，分别用滤膜过滤除菌；取猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶母液用0.05mol/l冰醋酸稀释，按总体积9：1加入10
×
dmem，使用naoh溶液调ph=7.2-7.4，37℃下静置成胶，得到猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶；步骤8.将新鲜的小鼠肠用含1％三抗的pbs洗涤数次，充分剪碎后重悬于25ml的温和解离液中，孵育15min后使用70μm滤网过滤，200
×
g离心5分钟，获得肠类器官细胞；步骤9.将h9 人胚胎干细胞接种于孔板中经拟胚体分化、中胚层分化及血管祖细胞分化阶段，形成血管类器官细胞；步骤10.将肠类器官细胞和血管类器官细胞混合种入猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶中，得到细胞-胶混合液，然后将细胞-胶混合液置于培养箱内静置待其充分凝固，加入培养基培养，直至生成血管化肠类器官；所述培养基是肠类器官培养基和血管类器官培养基按照体积比1：1混合而成。3.根据权利要求2所述的血管化肠类器官的制备方法，其特征在于所述步骤6中的胃蛋白酶由胰蛋白酶或木瓜蛋白酶替代。4.根据权利要求2或3所述的血管化肠类器官的制备方法，其特征在于所述步骤6中的冰醋酸由盐酸或甲酸替代。5.一种如权利要求1所述的血管化肠类器官在制备移植修复肠上皮损伤药物中的应用。

技术总结
本发明公开一种血管化肠类器官的制备方法，是将血管类器官细胞与肠类器官细胞混合种入猪小肠粘膜下层脱细胞基质胶中，再置于培养基中培养，生成血管化肠类器官。其猪小肠粘膜下层脱细胞基质水凝胶有利于血管类器官的血管生成，血管网分化后形成一个包含周细胞、基底膜、血管内皮细胞等复杂的集合，血管类器官管状结构明显，使肠道类器官具有更贴近人的血管体系，避免移植修复过程中肠道类器官因缺乏营养而坏死，同时还可避免采用Matrigel胶培养易导致组织癌变的问题。本发明制备的血管化肠类器官在移植修复肠损伤过程中引起的宿主介导的免疫排斥反应极低，可应用于制备移植修复肠上皮损伤药物。肠上皮损伤药物。肠上皮损伤药物。


技术研发人员：王秀丽 曹振 王前 伍远航 姚扬 王明琦
受保护的技术使用者：大连医科大学
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/7/7