一种药物组合物及其应用

1.本发明涉及一种药物组合物及其应用，属于癌症治疗医药领域


背景技术：

2.结肠癌症的发病率和死亡率都很高，是全球第三大常见癌症，也是癌症死亡的第二大原因。虽然手术切除和化疗大大提高了患者的生存率，但40％-50％的患者会复发并死于转移性结肠癌，与此同时，大多数患者会产生耐药性。探索新的耐药机制和靶向治疗对癌症的最佳治疗至关重要。
3.5-氟尿嘧啶(5-fu)一种抗代谢嘧啶类似物，进入细胞后转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5f-dump)，并且抑制脱氧核酸合成酶，阻止脱氧甘氨酸(dump)甲基化转变为脱氧胸苷酸(dtmp)，从而影响dna的合成，是治疗结肠癌的一线药物。然而，患者容易产生耐药性和严重的副作用。5-fu单药治疗晚期结肠癌的疗效仅限于10％-15％。因此，克服5-fu诱导的耐药性，并提高其临床疗效具有重要意义。
4.酪蛋白激酶2(ck2)以四聚体复合物的形式出现，由两个催化亚基(α和α’)和两个调节的β亚基组成。研究表明，ck2在许多癌症中高度表达，包括结肠癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等。此外，ck2活性的增强可以促进癌症细胞增殖。作为细胞关键调节因子，ck2可以影响多种细胞和分子途径来调节化疗药物的化学耐药，并引发dna损伤修复(ddr)。因此，ck2可能是克服化疗耐药性的潜在治疗靶点。尽管近年来许多ck2抑制剂已经被发现，但仅有cx-4945进入了ii期临床试验。因此，需要开发出一种可以针对5-氟尿嘧啶治疗结肠癌的耐药性的药物。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明旨的第一目的是提供一种药物组合物，本发明的第二目的是提供该药物组合物在克服结肠癌化疗耐药性中的应用。
6.技术方案：本发明的一种药物组合物，所述药物组合物包括5-氟尿嘧啶(5-fu)和5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物(dn701)。
[0007]
进一步地，所述5-氟尿嘧啶结构式如式1所示：
[0008][0009]
进一步地，所述5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物的结构式如式2所示：
[0010][0011]
进一步地，所述5-氟尿嘧啶和5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物的摩尔比为1：1-2。
[0012]
更进一步地，所述5-氟尿嘧啶和5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物的摩尔比为1：1。
[0013]
进一步地，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或口服液体制剂。
[0014]
进一步地，所述药物组合物还包括非毒性药学上可接受的盐。
[0015]
进一步地，所述药物组合物还包括医学上可接受的载体。
[0016]
进一步地，所述药物组合物可按照制剂学的常规方法制成。
[0017]
本发明所述药物组合物在克服结肠癌化疗耐药性中的应用。
[0018]
进一步地，所述药物组合物的给药剂量为成人每日口服50～100mg/kg。
[0019]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
[0020]
本发明药物组合物可有效促进结肠癌耐药细胞的凋亡和集落形成抑制，使耐药细胞株进一步阻滞在g0/g1期。在小鼠体内同样表现出较好的抗肿瘤活性，药物组合物可显著抑制结肠癌肿瘤生长，并具有低毒性的优势。在斑马鱼体内实验中，药物组合物可显著抑制结肠癌耐药肿瘤的生长，这说明药物组合物具有克服结肠癌耐药的潜力。
附图说明
[0021]
图1为结肠癌细胞集落形成实验结果图；
[0022]
图2为结肠癌细胞凋亡检测结果图；
[0023]
图3为结肠癌细胞周期阻滞检测结果图；
[0024]
图4为药物在体内结肠癌生长情况图；
[0025]
图5为药物体内克服结肠癌耐药情况图。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0027]
实施例1
[0028]
(1)细胞培养
[0029]
hct116(敏感人结肠癌细胞株，购于上海细胞研究所细胞库)和hct116/5-fu(耐药人结肠癌细胞株，购于上海细胞研究所细胞库)分别在含有10％胎牛血清和1％青链霉素的dmem培养基中培养。并保持培养箱的温度为37℃，co2的含量为5％。细胞贴壁生长，待细胞密度达到90％时，用0.25％胰蛋白酶消化，分瓶传代，并取对数生长期的细胞用于实验。
[0030]
(2)mtt实验法检测结肠癌细胞增殖
[0031]
用0.25％胰蛋白酶分别消化对数生长期的hct116和hct116/5-fu，并进行离心收集细胞。并以5
×
103个细胞/孔的浓度接种到96孔板中并培养24h。第二天将5-fu和dn701用dmem培养基进行稀释，稀释成两者浓度梯度均为40、10、2.5、0.625、0.1562μmol/l，并将含有不同浓度药物(5-fu和dn701)的培养基加入96孔板中并培养72h。72h后向每个孔中避光加入10μl的mtt，并在培养箱中孵育4h。孵育结束后，吸出培养基，向每孔中加入130μl二甲基亚砜(dmso)，并在摇床上摇晃5min。最后用酶标仪在490nm波长处检测每孔的吸光度(od值)，最后进行抑制率的计算。抑制率的计算公式如下所示：抑制率(％)＝1-[(od给药组-od空白组)/(od对照组-od空白组)]
×
100％其中，od给药组为加入不同浓度5-fu和dn701的吸光度，od空白组为不加入5-fu和dn701的吸光度，od对照组为加入相同剂量dmso时的吸光度。
[0032]
每组药物浓度设置三个复孔，实验重复三次。用spss软件进行计算ic
50
值。5-fu、dn701和联合用组(5-fu和dn701)的ic
50
值如表1所示：
[0033]
表1 5-fu、dn701及其联合给药组对待测细胞系处理72小时的ic
50
[0034][0035][0036]1rf＝ic
50
(hct116/5-fu)/ic
50
(hct116)
[0037]2fi＝ic
50
(5-fu)/ic
50
(5-fu+dn701)
[0038]
由表1可见，在hct116敏感株细胞中，5-fu和dn701单独治疗时的ic
50
值分别为15.59μm和12.37μm，说明5-fu和dn701单独治疗时对hct116敏感株有一定的治疗疗效，但在两者联合治疗时，其ic
50
值下降到3.78μm，说明dn701和5-fu联合显著提高了hct116的治疗疗效。在hct116/5-fu耐药株细胞中，当5-fu单独治疗时，其ic
50
值大于50，说明5-fu治疗基本失效，但当dn701和5-fu联合治疗hct116/5-fu细胞时，其治疗疗效明显提高，主要表现为较低的ic
50
值6.42。并且抗性指数(rf)为1.69，远低于5-fu单独治疗时的rf，说明当5-fu联合dn701时，具有克服结肠癌耐药的潜力。
[0039]
(3)结肠癌细胞集落形成实验
[0040]
将对数生长期的hct116和hct116/5-fu细胞消化收集，并以800个细胞/孔的浓度接种到6孔板中，待细胞贴壁后，加入含20μm 5-fu、20μm dn701，20μm(5-fu、dn701各20μm)等摩尔混合组(5-fu+dn701)的培养基，培养一周。除去培养基，并用标准pbs洗涤3次，用4％的多聚甲醛固定20 min，5％的结晶紫染色30 min。最后，用纯水进行洗涤除去多余的染料，并在空气中干燥一夜。第二天，进行拍照和集落计数。同时设置空白组(control：即不加入5-fu、dn701)，结果如如1所示。图1为集落形成实验结果图。其中，a为集落形成图，b为集落
形成抑制比率图。结果显示，在hct116细胞中，用20μm5-fu和20μm dn701单独治疗时，结肠癌敏感株的集落形成有明显的抑制效果，但当dn701联合5-fu时，其集落抑制能力显著提高，集落数目显著减少。在hct116/5-fu耐药株中发现，5-fu单独给药时，5-fu对集落形成的抑制能力显著降低，但随着dn701的加入，5-fu对hct116/5-fu细胞集落形成的抑制显著增加，说明dn701联合5-fu使得hct116/5-fu对5-fu敏感。再次证明dn701联合5-fu是克服结肠癌耐药的有效策略。
[0041]
(4)凋亡实验
[0042]
将对数期生长的细胞接种到六孔板中，培养24 h，并按照上述(3)的给药方式加药，给药24 h后，进行细胞收集。并使用annexin v/pi双染色检测凋亡情况。使用5μl annexin v-fitc和pi重悬细胞并染色20 min，并通过流式细胞仪检测细胞凋亡程度。结果如图2所示。图2为结肠癌细胞凋亡检测结果图，其中，a为凋亡图，b为凋亡比率图。图4显示，当20μm 5-fu联合20μm dn701治疗结肠癌敏感和耐药细胞株时，均可引发大量细胞凋亡，凋亡率分别可达65％和66.9％。相比于5-fu单药给药，凋亡率分别增加了2.76和4.14倍。说明联合给药可以引发结肠癌耐药细胞大量凋亡，具有克服结肠癌耐药的潜力。
[0043]
(5)周期实验
[0044]
将hct116和hct116/5-fu细胞接种于六孔板中，并按照上述(3)的给药方式加药处理24h。第二天收集细胞，并用70％冰乙醇重悬，在4℃下，固定24h。24h后，用标准pbs洗涤，并用50μg/ml pi和rnase染色30min。最后使用流式细胞仪检测细胞阻滞。结果如图3所示。图3为结肠癌细胞周期阻滞检测结果图，其中，a为周期阻滞图，b为hct116细胞周期阻滞比例图，c为hct116/5-fu细胞周期阻滞比例图。结果显示，在hct116细胞中，5-fu治疗时可以使细胞阻滞在s期，但在hct116/5-fu细胞中并未观察到该现象。但随着dn701的加入，细胞在g0/g1期阻滞，阻滞比例可达76.99％。说明联合给药可以使hct116/5-fu细胞进一步阻滞在g0/g1期。
[0045]
实施例2
[0046]
(1)体内抗肿瘤实验
[0047]
使用20g的无胸腺裸balb/c裸鼠进行体内试验。我们将25只balb/c裸鼠分为5组，将hct116单细胞悬浮液(1
×
106个细胞/只小鼠)皮下注射到动物腋下部位。2周后，随着肿瘤生长到接近125mm3时，balb/c裸鼠给予5-fu(50mg/kg静脉注射，每两天一次)、dn701(100mg/kg灌胃，每天两次)和两组5-fu与dn701的联合用药(分别为50mg/kg5-fu+100mg/kg dn701和50mg/kg5-fu+50mg/kg dn701)，持续21天。每两天用游标卡尺通过垂直直径测量肿瘤的体积，并根据以下公式计算：
[0048]
肿瘤体积(mm3)＝0.5
×
肿瘤长度
×
肿瘤宽度2[0049]
用不同时间点的平均肿瘤体积绘制曲线，肿瘤重量被评估为相应组的抗肿瘤活性，体重被认为是全身毒性的指标。
[0050]
结果如图4所示，图4为药物在体内结肠癌生长情况图，其中a为结肠癌肿瘤变化图像，b为结肠癌肿瘤体积变化图，c为结肠癌肿瘤重量变化图，d为小鼠体重变化图。由图4可见，与相应的单药组相比，药物组合组的肿瘤体积显著减少。在治疗结束时，测量肿瘤重量以检测给药组的抗肿瘤活性。本发明药物组合物的肿瘤生长抑制率达到86.64％，而单独用药5-fu和dn701的抑制率分别为72.85％和64.79％。众所周知，5-fu具有较强的毒性作用，
并引起治疗动物体重减轻。因此，我们测定了药物组合组对小鼠体重的影响。图4d表明，在药物组合组中观察到裸鼠体重的增加，然而，单独5-fu药物治疗组裸鼠体重持续下降。结果证明，与单一5-fu药物治疗相比，5-fu与dn701联合治疗可以表现出显著的抗肿瘤活性，对治疗的动物几乎没有毒性作用。
[0051]
(2)斑马鱼异种移植物的显微注射实验
[0052]
制备大约1400个荧光标记的hct116/5-fu细胞，将其注射到斑马鱼的卵黄周间隙(pvs)中。注射时，将斑马鱼在tricaine试剂中培养10分钟，在黑暗中转移到34℃的e3培养基中。斑马鱼幼虫保持在黑暗条件下，以避免光线对昼夜节律的影响。在注射当天，根据肿瘤质量对异种移植瘤模型进行筛选，并根据肿瘤大小进行分组。三天后，使用tricaine试剂处死斑马鱼，并用4％甲醛固定，然后将其保存在-20℃的100％甲醇中进行分析。
[0053]
将hct116/5-fu细胞注射到斑马鱼胚胎的卵黄囊中以建立体内模型。注射一周后，将含有20μm 5-fu、20μm dn701或20μm 5-fu+20μm dn701的培养基处理24小时。结果图5所示，图5为药物体内克服结肠癌耐药情况图。其中，a为斑马鱼的图片，b为肿瘤荧光定量图。与未处理组(control)相比，单独用5-fu处理的斑马鱼腹部肿瘤大小没有变化。当dn701与5-fu联合使用时(5-fu+dn701)，斑马鱼的腹部肿瘤显著减少，荧光减弱。这一结果直接证明了dn701与5-fu联用在体内具有克服人结肠癌对5-fu化疗耐药的能力。

技术特征：
1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括5-氟尿嘧啶和5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述5-氟尿嘧啶结构式如式1所示：3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物的结构式如式2所示：4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述5-氟尿嘧啶和5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物的摩尔比为1：1-2。5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或口服液体制剂。6.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括非毒性药学上可接受的盐。7.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括医学上可接受的载体。8.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可按照制剂学的常规方法制成。9.权利要求1-5任一项所述药物组合物在克服结肠癌化疗耐药性中的应用。10.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药剂量为成人每日口服50～100mg/kg。

技术总结
本发明公开了一种药物组合物及其应用，该药物组合物包括5-氟尿嘧啶和5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物，其中，5-氟尿嘧啶和5-(3-氯苯胺)苯并[c][2,6]吡啶衍生物的摩尔比为1：1-2。本发明药物组合物可有效促进结肠癌耐药细胞的凋亡和集落形成抑制，具有克服结肠癌耐药的潜力。癌耐药的潜力。


技术研发人员：陈飞虹 王志玮
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/7