防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物与应用的制作方法

1.本发明涉及湘华鲮肠炎防治技术领域，更具体地说是涉及一种防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物与应用。


背景技术：

2.湘华鲮(sinilabeodecorustungting(nichols))属于鲃亚科(barbinae)华鲮属(sinilabeo)，是沅水流域重要的名贵鱼类之一，为湖南省特有品种，具有肉质细美、营养价值高等优良特性。它适应能力差，对环境和饵料要求高，自然资源在逐年减少，已成为我国濒危品种。目前，学者们一直致力于研究湘华鲮的人工繁养技术，已突破人工繁殖和驯食技术难关，获得大批量鱼苗，且已经开展规模人工养殖试验。
3.但是，在人工养殖条件下，由于养殖密度、生态环境、生活节律及饵料组分等各方面的变化，极大地改变了其自然生活习性，使得各种病害极易发生，细菌性肠炎尤为严重。患病初期，湘华鲮虽然摄食，但粪便出现白便，漂浮水面，解剖发现肠道胀气，肠壁弹性差、易断，出现轻度肠炎症状。并随着病程的延长，肠道粘液增多，肠道肿胀充血，鱼类拒食，出现死亡现象。目前有研究证实湘华鲮细菌性肠炎的致病菌主要是气单胞菌和弧菌；目前，治疗湘华鲮细菌性肠炎的方法主要为使用抗生素或中药组合物，但是这些方法极易使得致病菌发生变异，进而产生抗药性，治愈率低，污染环境；所以，有必要基于湘华鲮肠道菌群结构筛选一种生防微生物制剂，以拮抗致病菌，这样既可以避免致病菌抗药性的产生，又可以达到治疗和预防细菌性肠炎的效果。
4.因此，如何提供可以拮抗湘华鲮细菌性肠炎致病菌的生防菌是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物，并制备成微生物菌剂，选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和乳酸杆菌为拮抗菌来限制湘华鲮肠道致病菌的生长与繁殖，使得肠道有害微生物浓度低于致病浓度，从而达到预防疾病的目的。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物，包括：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物乳酸杆菌，且质量比为2：(1.5-2.0)：1。
8.优选地，所述复合微生物的活菌数≥1.0
×
108cfu/g。
9.鱼类肠道微生态系统是肠道表面密集的大量的不同菌群微生物与其寄居环境共同构成的生态系统。肠道微生态系统参与机体的新陈代谢、粘膜免疫与屏障等多种生理机能，而肠道微生物菌群对肠道功能的发挥起到至关重要的作用，本发明采取湖南洪江野生湘华鲮样本，进行前肠、中肠和后肠微生物菌群多样性测序分析，根据湘华鲮肠道微生物菌群特性和相对丰度，进而通过投喂添加好氧、革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，迅速消耗肠道中的游离氧，形成厌氧状态，促进肠道里有益的、厌氧性(兼性好氧)的植物乳
酸杆菌的生长，间接抑制好氧致病菌的生长；发现，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物性乳酸杆菌，能产生活性物质，起到抗菌、抑菌的作用，达到抑制致病菌的目的，进而控制水生动物疾病的发生，为有益微生物，同时这些微生物定植肠道后，调控消化道微生物群，保持消化道微生物稳定，平衡鱼类肠道微生态环境，达到促进营养吸收，改善肠道黏膜免疫功能，以提高鱼类的抗病力和生产能力。因此本发明针对性地选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物乳酸杆菌复配作为拮抗菌种，发挥微生物的协同作用和增效工作，达到防治湘华鲮肠道疾病，帮助消化和提高免疫力的目的。
10.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物在制备预防和治疗湘华鲮细菌性肠炎的微生物制剂中的应用。
11.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物在制备促进湘华鲮生长、提高湘华鲮免疫力的微生物制剂中的应用。
12.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种微生物制剂，包括所述的复合微生物、海藻酸钠、葡萄糖和酵母浸出粉，比例为1：1：0.1：0.25。
13.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的微生物制剂的制备方法，具体包括下述过程：
14.1)制备复合微生物：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳酸杆菌按照2：(1.5-2.0)：1的质量比混合，制备得到复合微生物；
15.2)制备初级混合液：将海藻酸钠溶于无菌水中，向其中添加将葡萄糖、酵母浸出粉，形成初级混合液；
16.3)菌液混合制备微生物菌剂：按照复合微生物菌种：初级混合液为1g：50ml的质量体积比将两者混合，形成复合微生物制剂。
17.优选地步骤2)中，海藻酸钠、葡萄糖、酵母浸出粉的添加量以无菌水为基准分别为2％、0.2％和0.5％。
18.葡萄糖和酵母浸出粉促使微生物活化，同时海藻酸钠增加了后续微生物制剂与常规饲料的粘合度，因此与常规微生态制剂使用方法比较，海藻酸钠增加了活菌数量及鱼类对菌的摄入量。
19.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的微生物制剂或所述的方法制备到的微生物制剂在制备湘华鲮养殖饲料中的应用，所述养殖饲料用于预防和治疗湘华鲮细菌性肠炎、促进湘华鲮生长、提高湘华鲮免疫力。
20.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种湘华鲮养殖饲料，包括常规饲料和复合微生物制剂，且质量体积比为1000g：50ml。
21.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种湘华鲮养殖饲料的制备方法，具体过程包括：先按照质量体积比称取常规饲料和复合微生物制剂，然后将复合微生物制剂均匀地喷洒在常规饲料上，放置15-30min，得湘华鲮养殖饲料。
22.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种防治湘华鲮细菌性肠炎的微生物菌剂，选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和乳酸杆菌为拮抗菌来限制湘华鲮肠道致病菌的生长与繁殖，使得肠道有害微生物浓度低于致病浓度，从而达到预防疾病的目的。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
24.图1为湘华鲮肠道菌群在门水平的分布图；
25.图2为湘华鲮肠道菌群在属水平的分布图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例中的微生物均通过市售购买获得。
28.实施例1
29.采取湖南洪江野生湘华鲮样本，进行前肠(qc)、中肠(zc)和后肠(hc)微生物菌群多样性测序分析，从物种相对丰度柱形图1可看出，湘华鲮肠道菌群在门水平上，除了没有分类的，共检测到29门的细菌，主要优势菌门为变形菌门(proteobacteria)，梭杆菌门(fusobacteria)、浮霉菌门(plan ctomycetota)和厚壁菌门(firmicutes)，而在属水平上(图2)，除了没有分类的，共检测到18属的细菌，主要优势菌属是鲸根杆菌(cetabacterium)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia-caballeronia-paraburkholderia)、弧菌属(vibrio)，其相对丰度比例分别是15.70％＞10.80％＞8.18％，同时还有气单胞菌属(aeromonas)(1.61％)和低比例的有益菌乳酸杆菌属(lactobacillus)(0.56％)。
30.进而通过投喂添加好氧、革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，迅速消耗肠道中的游离氧，形成厌氧状态，促进肠道里有益的、厌氧性(兼性好氧)的植物乳酸杆菌的生长，间接抑制好氧致病菌的生长；发现，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物性乳酸杆菌，能产生活性物质，起到抗菌、抑菌的作用，达到抑制致病菌的目的，进而控制水生动物疾病的发生，为有益微生物，同时这些微生物定植肠道后，调控消化道微生物群，保持消化道微生物稳定，平衡鱼类肠道微生态环境，达到促进营养吸收，改善肠道黏膜免疫功能，以提高鱼类的抗病力和生产能力。因此本发明针对性地选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物乳酸杆菌复配作为拮抗菌种，发挥微生物的协同作用和增效工作，达到防治湘华鲮肠道疾病，帮助消化和提高免疫力的目的。
31.实施例2制备微生物制剂并制备湘华鲮养殖饲料，并验证效果
32.将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳酸杆菌，总活菌数量≥1.0
×
108，分别按照1:1:1、1.5:1:1、2:1.5:1、2:2:1比例混合，制成混合菌种组合物a1、a2、a3、a4，备用。
33.初级混合液
34.先将海藻酸钠溶于无菌水中，配成2％浓度，然后将葡萄糖、酵母浸出粉分别按照常规微生物菌种培养基配方比例0.2％和0.5％添加。
35.菌液混合
36.将1g混合菌种与50ml初级混合液混合，形成活菌混合液体。
37.活菌混合液体的使用
38.按照50ml活菌混合液/1000g常规饲料添加使用，将活菌混合液体均匀地喷洒在饲料上，放置15-30min，然后分别将饲料投喂湘华鲮试验组，常规饲料主要原料由鱼粉、豆粕、面粉、鱼油、大豆磷脂油、矿物元素、维生素等组成；营养水平：粗蛋白≥41.0％，粗脂肪≥4.0％，粗纤维≤5.0％，粗灰分≤16.0％，钙≤5.0％，总磷≥1.0％，赖氨酸≥2.1％，福建天马科技集团股份有限公司生产。
39.湘华鲮：池塘养殖湘华鲮，1
+
龄鱼种，规格20-30g/尾，肠道胀气，白粪且漂浮水面，能摄食，不死亡。
40.从患病池塘捞取湘华鲮，选取规格一致的随机分为组，每组30尾，分别设置为对照组a0，试验组a1组、a2组、a3组和a4组。对照组不投喂微生态制剂饲料；4个试验组分别投喂相应拌有a1、a2、a3、a4配方的微生态制剂饲料。所有试验鱼均在同等条件下饲养于实验桶中，连续投喂7d，观察并统计鱼类摄食、粪便及死亡情况，解剖查看肠道气体情况。
41.疗效判断：
42.有效：粪便白色变淡且逐步消失，粪便浮于水面，肠道有少许气体，摄食尚可；
43.治愈：白色粪便消失，所有粪便沉于水底，摄食正常，肠道不胀气；
44.无效：粪便漂浮水面，白色，摄食量少，肠道气体多，甚至出现死亡现象。
45.表1治疗结果
[0046][0047]
从试验治疗率结果来看，a3、a4组别为最佳，即枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳酸杆菌按照2：(1.5-2.0)：1比例搭配的微生物制剂治疗效果最好。
[0048]
预防效果试验
[0049]
对照组：3排1号池塘，不投喂微生态制剂的湘华鲮；
[0050]
实验组：1排5号池塘，投喂微生态制剂的湘华鲮。
[0051]
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳酸杆菌按照2：2：1比例搭配的微生物制剂，按照上述方法制备湘华鲮养殖饲料，投喂3-5天/月。
[0052]
试验时间为7月-9月，共90天。
[0053]
试验池塘：湖南省水产科学研究所内。
[0054]
不同条件下湘华鲮血清指标存在一定的差异性(表2)。实验组湘华鲮白蛋白和球蛋白含量高，总蛋白值也就高，但白球比两组无差异；实验组鱼体内清除体内过量自由基，有效地提升机体免疫力的总超氧化物歧化酶极显著地高于对照组，与体重呈正比的参与脂肪代谢的碱性磷酸酶值高于对照组，与体重呈负相关的谷草转氨酶和谷丙转氨酶值低于对照组，易造成机体血管硬化低密度脂蛋白极显著地低于对照组。血清指标反映机体生化机能，在一定程度上也能反映出机体的生长性能，从检测结果来看，实验组池塘湘华鲮机体免疫能力强于对照组。
[0055]
表2血清指标
[0056][0057]
两个池塘湘华鲮体重、体长、全长生长指标的检测，实验组湘华鲮丰满度和绝对生长率显著地高于对照组，具体结果如下表3。
[0058]
表3湘华鲮生长特征
[0059][0060][0061]
取湘华鲮实验鱼进行室内非o1/o139群霍乱弧菌(为烈性肠炎病原菌，本单位实验室从患病湘华鲮体内分离所得)攻毒实验，菌浓度6.0
×
107cfu/ml，注射适量菌液，使得湘华鲮体内菌达1.25
×
105cfu/g，观察7d时间。
[0062]
空白：不投喂微生态制剂的湘华鲮，注射等量生理盐水；对照：不投喂微生态制剂
的湘华鲮，用弧菌攻毒，实验：投喂微生态制剂的湘华鲮，用弧菌攻毒，统计分析7d内湘华鲮死亡率。从结果来看定期投喂微生态制剂，可有效地保护湘华鲮，大大地降低肠道感染率，其存活率可达60％(见表4)。
[0063]
表4实验湘华鲮攻毒实验
[0064]
分组数量(尾)死亡(尾)死亡率(％)保护率(％)空白2000/对照20201000实验2084060
[0065]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0066]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物，其特征在于，包括：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物乳酸杆菌，且质量比为2：(1.5-2.0)：1。2.根据权利要求1所述的一种防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物，其特征在于，活菌总数≥1.0
×
108cfu/g。3.权利要求1或2所述的防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物在制备预防和治疗湘华鲮细菌性肠炎的微生物制剂中的应用。4.权利要求1或2所述的防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物在制备促进湘华鲮生长、提高湘华鲮免疫力的微生物制剂中的应用。5.一种微生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的复合微生物、海藻酸钠、葡萄糖和酵母浸出粉，比例为1：1：0.1：0.25。6.权利要求5所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，具体包括下述过程：1)制备复合微生物：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳酸杆菌按照2：(1.5-2.0)：1的质量比混合，制备得到复合微生物；2)制备初级混合液：将海藻酸钠溶于无菌水中，向其中添加将葡萄糖、酵母浸出粉，形成初级混合液；3)菌液混合制备微生物菌剂：按照复合微生物菌种：初级混合液为1g：50ml的质量体积比将两者混合，形成复合微生物制剂。7.根据权利要求6所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤2)中，海藻酸钠、葡萄糖、酵母浸出粉的添加量以无菌水为基准分别为2％、0.2％和0.5％。8.权利要求5所述的微生物制剂或权利要求7所述的方法制备到的微生物制剂在制备湘华鲮养殖饲料中的应用，所述养殖饲料用于预防和治疗湘华鲮细菌性肠炎、促进湘华鲮生长、提高湘华鲮免疫力。9.一种湘华鲮养殖饲料，其特征在于，包括常规饲料和复合微生物制剂，且质量体积比为1000g：50ml。10.权利要求9所述的一种湘华鲮养殖饲料的制备方法，其特征在于，具体过程包括：先按照质量体积比称取常规饲料和复合微生物制剂，然后将复合微生物制剂均匀地喷洒在常规饲料上，放置15-30min，得湘华鲮养殖饲料。

技术总结
本发明公开了一种防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物，属于湘华鲮细菌性肠炎防治技术领域，包括：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物乳酸杆菌，且质量比为2：(1.5-2.0)：1，将其复配为拮抗菌来限制湘华鲮肠道致病菌的生长与繁殖，使得肠道有害微生物浓度低于致病浓度，从而达到预防疾病的目的。而达到预防疾病的目的。而达到预防疾病的目的。


技术研发人员：邓时铭 蒋国民 李传武 田璐 梁志强 邹利 刘明求 曾春芳
受保护的技术使用者：湖南省水产科学研究所
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/7