一种双染免疫组化试剂盒及应用

1.本发明涉及免疫组化领域，且特别涉及一种双染免疫组化试剂盒及应用。


背景技术：

2.慢性淋巴细胞性白血病(cll)/小淋巴细胞瘤(sll)是成人患者群体中常见的淋巴细胞增生性疾病之一，表现为外周血或骨髓中单克隆b淋巴细胞增多。cll的诊断主要依赖于免疫分型及免疫组化，大多数cll患者细胞表达cd5和b细胞抗原cd19、cd20和cd23。典型的cll免疫表型为cd5+、cd23+、cd43+/－、cd10－、cd19+、cd20 dim(cd20弱表达)、sig dim(sig弱表达)。部分cll患者可能表现为sig bright(sig强表达)、cd23－/dim、fmc7弱阳性。
3.目前，主要通过对骨髓活检标本切片进行染色，确认b细胞的克隆性。但是，研究发现，套细胞淋巴瘤(mcl)免疫表达型为cd5+、cd20表达，mcl患者有时也会出现与cll类似的免疫表型，因此，需要引入新的诊断标记实现对cll/sll与mcl的鉴别诊断。
4.此外，cll/sll的诊断过程中，需要对骨髓活检标本切片进行染色，由于骨髓活检标本中存在大量骨质，无法直接切片。需使用弱酸或强酸进行脱钙处理，这些溶剂对于抗原会造成一定的损伤，容易出现假阳性与假阴性，导致结果不准确。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种双染免疫组化试剂盒及应用。
6.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
7.本发明的第一方面提供一种双染免疫组化试剂盒，包括：固定液、破膜剂、一抗试剂、二抗试剂和染色剂，其中，所述一抗试剂包括lef1抗体和cd20抗体；所述二抗试剂包括碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物和辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物。
8.在本发明的示例性实施例中，所述lef1抗体和所述cd20抗体来源于两种不同种属的动物。
9.在本发明的示例性实施例中，所述碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物用于与来源于第一种属动物的一抗结合，所述辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物用于与来源于第二种属动物的一抗结合，所述第一种属动物与所述第二种属动物不同。
10.在本发明的示例性实施例中，所述第一种属动物与所述第二种属动物分别与所述lef1抗体和所述cd20抗体的动物种属一致。
11.在本发明的示例性实施例中，所述染色剂包括过氧化酶底物染色液、碱性磷酸酶底物染色液和复染染色液，所述复染染色液的显色不掩盖所述过氧化酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液的显色。
12.在本发明的示例性实施例中，所述固定液为甲醇和甲醛的混合液。
13.在本发明的示例性实施例中，所述双染免疫组化试剂盒还包括蛋白阻断剂，所述蛋白阻断剂选自牛血清蛋白缓冲溶液、山羊血清缓冲溶液、马血清缓冲溶液和酪蛋白缓冲溶液中的一种或多种。
14.在本发明的示例性实施例中，所述破膜剂选自皂角苷、triton-x、tween-20、醛类、醇类、酮类、氯化钠、氯化钙、苯甲酸钠、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚、曲拉通x-100、triton-x和tween-20中的一种或多种混合的pbs溶液。
15.在本发明的示例性实施例中，所述的双染免疫组化试剂盒用于对外周血涂片、骨髓涂片、细胞涂片进行染色。
16.本发明的第二方面提供一种基于lef1/cd20双染的染色方法，采用如上任意一项所述的双染免疫组化试剂盒。
17.在本发明的示例性实施例中，染色方法包括：
18.步骤s1，将固定液滴加在涂片上进行固定，得到样本；
19.步骤s2，在所述样本上滴加所述蛋白阻断剂，孵育后得到阻断样本；
20.步骤s3，在所述阻断样本上滴加破膜剂，孵育一段时间；
21.步骤s4，加入所述一抗试剂，孵育后进行清洗；
22.步骤s5，加入所述二抗试剂，孵育后进行清洗；
23.步骤s6，滴加过氧化酶底物染色液、碱性磷酸酶底物染色液和苏木素染色液进行染色处理，得到染色样本。
24.在本发明的示例性实施例中，步骤s6中，所述染色处理的步骤包括：先滴加辣根酶底物染色液，孵育、清洗，然后滴加碱性磷酸酶底物染色液，孵育、清洗，最后滴加复染染色液，孵育、清洗后，得到染色样本；或者，
25.先滴加碱性磷酸酶底物染色液，孵育、清洗，然后滴加辣根酶底物染色液，孵育、清洗，最后滴加复染染色液，孵育、清洗后，得到染色样本。
26.本发明的第三方面提供如上任意一项所述的双染免疫组化试剂盒在慢性淋巴细胞性白血病诊断中的应用。
27.与现有技术相比，本发明的双染免疫组化试剂盒、染色方法及应用的有益效果是：
28.本发明所提供的双染免疫组化试剂盒能够应用于慢性淋巴细胞性白血病的辅助诊断中，有效提高诊断准确率。对于cll，lfe1(淋巴细胞增强因子1)和cd20均表达在单克隆b淋巴细胞上。对于mcl，由于lef1主要表达在cd3阳性的t淋巴细胞上，在cd20阳性的单克隆b淋巴细胞上极少出现阳性。本发明通过对lef1/cd20进行双染色处理，lef1的表达通过细胞核着色，cd20的表达通过细胞浆着色，使用两种不同的颜色进行阳性双染，分别出两种细胞的位置，能更加明确为b淋巴细胞异常表达，排除t细胞的干扰，实现cll和mcl的鉴别诊断。双染免疫组化试剂盒使用lef1抗体和cd20抗体双染，特异性强，染色方法简单易于实现，能够通过自动化染色设备实现染色全过程。本发明获得染色结果清晰，细胞形态易于辨别。
29.此外，本实施例的染色方法能够应用于外周血涂片中，标本适用范围广。无需进行脱钙处理等前处理工序，有效避免抗原损伤，减少假阳性和假阴性的情况发生。通过固定液固定样本，细胞形态完整度高。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附
perm buffer ii破膜剂(货号：558052)或者bd phosflow
tm perm buffer ii破膜剂(货号：558050)等。
43.在本发明实施例中，所述一抗试剂包括lef1抗体、cd20抗体。具体地，lef1抗体和cd20抗体来源于两种不同种属的动物。例如，在一个实施例中，lef1抗体为兔抗人lef1单克隆抗体(克隆号为bp6113，图凌(杭州)生物医药有限公司)。在一个实施例中，cd20抗体为鼠单克隆抗体(cd20 mouse monoclonal antibody，克隆号l26)(碧云天生物技术)。
44.需要说明的是，在其他实施例中，也可以是，lfe1为鼠单克隆抗体，cd20为兔单克隆抗体。本实施例中的lef1抗体和cd20抗体也可以选用其他商业化产品，只要保证lef1抗体和cd20抗体的其中之一为兔抗，另一为鼠抗即可，本发明不进行具体限制。
45.在本发明实施例中，所述二抗试剂包括碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物和辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物。具体地，所述碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物用于与来源于第一种属动物的一抗结合，所述辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物用于与来源于第二种属动物的一抗结合，所述第一种属动物与所述第二种属动物不同。
46.例如，在一个实施例中，可以选用艾美捷科技生产的碱性磷酸酶ap标记亲和纯化山羊抗兔igg(h+l)二抗、hrp标记的山羊抗小鼠igg f(ab')2二抗等商业化产品。
47.需要说明的是，碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物和辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物也可以选用其他商业化产品，例如其中之一为抗兔聚合物，另一为抗鼠聚合物。
48.在本发明的实施例中，碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物和辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物分别与lef1抗体和cd20抗体的动物种属一致。例如lef1为鼠抗，cd20抗体为兔抗，碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物为抗鼠聚合物，辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物为抗兔聚合物。
49.在免疫组化检测过程中，一抗试剂特异性结合目标蛋白(抗原)，通过二抗试剂识别一抗，为检测提供信号放大的作用。
50.在本发明较佳的实施例中，所述染色剂包括过氧化酶底物染色液、碱性磷酸酶底物染色液和复染染色液。优选地，在要给实施例中，过氧化酶底物染色液可以选用dab染色液、碱性磷酸酶底物染色液可以选用快红染色液。复染染色液的显色不掩盖所述过氧化酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液的显色
51.在一实施例中，dab染色液可以通过商业化产品获得，其成分包括dab(3,3-四盐酸二氨基联苯胺)溶液和h2o2。辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物能将dab染色液中的过氧化氢催化分解成高活性的氢氧游离基分子，氧化二氨基联苯胺，形成棕黄色沉淀，从而实现定位。
52.在一实施例中，快红染色液可以通过商业化产品获得，其成分包括碱性磷酸酶底物溶液和固红溶液。具体地，碱性磷酸酶底物溶液为快红(fast red)，固红溶液包括萘酚磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷。在染色过程中，碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物能催化碱性磷酸酶底物磷酸基水解形成磷酸不萘酚，与固红溶液产生化学反应，在碱性磷酸酶所处的位置生成不溶性红色产物沉淀，从而实现定位。
53.在一实施例中，复染染色液为苏木素染色液或甲基绿染色液。苏木素染色液和甲基绿染色液可以通过商业化产品获得。通过苏木素染色液进行复染，细胞核被苏木素染成蓝紫色，或者通过甲基绿染色液将细胞核染成绿色。细胞浆、纤维等不被染色，起到对整体
细胞分布和组织形态衬托的效果，更易于观察辨认。
54.在本发明的实施例中，上述双染免疫组化试剂盒可以用于对外周血涂片、骨髓涂片、细胞涂片进行染色，染色结果清晰，适用范围广泛。更为优选地，该双染色免疫组化试剂盒应用于骨髓外周血涂片，骨髓外周血涂片无需进行复杂前期处理过程，大大节约了前处理时间，且避免了脱钙等处理对细胞造成的损伤。
55.如图1所示，本发明的实施例还提供一种基于lef1/cd20双染的染色方法，采用如上所述的双染免疫组化试剂盒。具体地，在本发明实施例中，染色方法包括：
56.步骤s1，将固定液滴加在涂片上进行固定，得到样本；
57.步骤s2，在所述样本上滴加所述蛋白阻断剂，孵育后得到阻断样本；
58.步骤s3，在所述阻断样本上滴加破膜剂，孵育一段时间；
59.步骤s4，加入所述一抗试剂，孵育后进行清洗；
60.步骤s5，加入所述二抗试剂，孵育后进行清洗；
61.步骤s6，滴加过氧化酶底物染色液、碱性磷酸酶底物染色液和苏木素染色液进行染色处理，得到染色样本。
62.具体地，在步骤s1中，固定液优选为为质量比为1:1的甲醇和甲醛。固定时间为1～30min。优选地，在一个实施例中，固定时间为1min。该固定步骤能够在保证抗原活性的前提下，有效提高细胞形态的完整度。
63.步骤s2，在所述样本上滴加所述蛋白阻断剂，孵育后得到阻断样本。
64.具体地，该步骤中，蛋白阻断为一抗稀释液、二抗稀释液、牛血清蛋白溶液、山羊血清溶液、马血清溶液和酪蛋白溶液中的一种或多种。特别地，在应用于骨髓外周血涂片时，样本中含有较多的干染，通过加入蛋白阻断剂，能够有效提高检测的准确性。
65.进一步地，该步骤中，滴加蛋白阻断剂可以是50-200微升，孵育时间可以为1～60min。进一步地，孵育时间优选为10min，孵育温度为15～35℃。孵育完成后甩干，无需清洗。
66.步骤s3，在所述阻断样本上滴加所述破膜剂溶液50-200微升，所述破膜剂溶液的浓度为5％-35％，孵育一段时间。具体地，在一个实施例中，破膜剂溶液含有氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、壬基酚聚氧乙烯醚、曲拉通x-100、多聚甲醛。
67.进一步优选地，破膜剂为bd公司生产的流式破膜剂。加入破膜剂后，孵育时间为1～60min，进一步优选地，孵育时间为10min，孵育温度为15～35℃。经过该步骤，能够在细胞上进行打孔，便于一抗试剂的结合。
68.步骤s4，在步骤s3获得样本中加入所述一抗试剂，孵育后用pbs缓冲液进行清洗。具体地，该步骤中，滴加一抗试剂，一抗试剂的具体用量可以根据具体购买的一抗试剂的说明书进行选择，本公开不进行具体限制。加入一抗试剂后可以在4～60℃孵育3～800min后，用pbs缓冲液清洗涂片。pbs缓冲溶液清洗的步骤可以是每次清洗3min，反复清洗3次。可以理解的是，可以根据不同的孵育温度调整加入一抗试剂后的孵育时间，例如在一个优选的实施例中，在30～40℃孵育20～40min。进一步地，该步骤中，孵育温度为35℃，孵育时间为30min。该条件下孵育时间较短，孵育效果较好。
69.需要说明的是，本公开采用cd20抗体和lef1抗体作为一抗试剂，在一个实施例中，可以同时加入cd20抗体和lef1抗体进行孵育。在其他实施例中，也可以是先加入cd20抗体
进行孵育，再加入lef1抗体进行孵育；或者先加入lef1抗体进行孵育，再加入cd20抗体进行孵育。
70.步骤s5，加入二抗试剂，在4～60℃条件下孵育5～800min，采用pbs缓冲液进行多次清洗。。二抗试剂的用量可以根据具体购买的厂商确定，例如可以是加入135u购买自厦门通灵生物医药科技有限公司的二抗试剂。可以理解的是，可以根据不同的孵育温度调整加入一抗试剂后的孵育时间，例如在一个优选的实施例中，加入二抗试剂后在20～45℃条件下孵育10～40min。该条件下孵育时间较短，孵育效果较好。
71.需要说明的是，在该步骤中，在一个实施例中，可以同时加入碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物和辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物进行孵育。在其他实施例中，也可以是分开加入碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物和辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物进行孵育，可以是先加入碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物进行孵育，也可以是先加入辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物进行孵育。
72.步骤s6，滴加过氧化酶底物染色液、碱性磷酸酶底物染色液和苏木素染色液进行染色处理，得到染色样本。
73.在一个实施例中，步骤s6具体包括：先滴加辣根酶底物染色液，孵育、清洗，然后滴加碱性磷酸酶底物染色液，孵育、清洗，最后滴加苏木素染色液，孵育、清洗后，得到染色样本。具体地，在一个实施例中，先滴加dab染色液，在5～50℃孵育3～120min后，用纯水清洗2次，每次清洗2min。然后滴加快红染色液，在5～50℃孵育3～120min后，用纯水清洗2次，每次2min。然后涂片滴加135ul苏木素染色液，在5～50℃孵育3～120min后，用纯水清洗2次，每次清洗2min。
74.在另外一个实施例中，步骤s6具体包括：先滴加碱性磷酸酶底物染色液，孵育、清洗，然后滴加辣根酶底物染色液，孵育、清洗，最后滴加苏木素染色液，孵育、清洗后，得到染色样本。具体地，在一个实施例中，先滴加快红染色液，在5～50℃孵育3～120min后，用纯水清洗2次，每次清洗2min。然后滴加dab染色液，在5～50℃孵育3～120min后，用纯水清洗2次，每次2min。然后涂片滴加135ul苏木素染色液，在5～50℃孵育3～120min后，用纯水清洗2次，每次清洗2min。
75.本发明实施例还提供如上所述的双染免疫组化试剂盒在慢性淋巴细胞性白血病诊断中的应用。
76.以下结合实施例对本公开的特征和性能作进一步的详细描述。
77.实施例1
78.试剂：
79.[0080][0081]
对以下样本a、b、c进行染色处理：
[0082]
样本a：某医院诊断为cll患者的外周血涂片；
[0083]
样本b：阴性对照：正常t淋巴细胞涂片；
[0084]
样本c：某医院诊断为mcl患者的外周血涂片。
[0085]
染色过程如下：
[0086]
(1)固定：将固定液滴加到样本上进行固定1min；
[0087]
(2)阻断：滴加蛋白阻断剂40μl，室温孵育10min，甩干(不用清洗)；
[0088]
(3)破膜：滴加破膜剂溶剂150μl，室温孵育10min，覆盖血膜；
[0089]
(4)一抗孵育：滴加135μl一抗试剂，35℃孵育30min后，用pbs缓冲液清洗切片，清洗3次，每次清洗3min。
[0090]
(5)二抗孵育：滴加135μl二抗试剂，35℃孵育18min后，用pbs缓冲液清洗切片，清洗3次，每次清洗3min。
[0091]
(6)显色：涂片滴加180μl dab染色液，35℃孵育6min后，用纯水清洗2次，每次清洗2min。滴加快红染色液150μl，孵育20min。
[0092]
(7)复染：涂片滴加135μl苏木素染色液，35℃孵育4min后，用纯水清洗2次，每次清洗2min。
[0093]
(8)镜检：酸化，反蓝后，在显微镜下检查。
[0094]
如图2所示为样本a的染色结果图，图3为样本b的染色结果图，图4是样本c的染色结果图。
[0095]
从染色结果可以看出，图2中，胞膜褐色表示cd20阳性，胞核红色表示lef1阳性，cd20和lef1共阳性，鉴定为cll细胞。图3中，未检测到胞膜褐色表示cd20阴性，胞核红色表示lef1阳性，鉴定为正常t淋巴细胞。图4中，胞膜褐色表示cd20阳性，未检测到胞核红色表示lef1阴性，鉴定为mcl细胞。可见，本公开的染色方法能够对cll和mcl进行有效区分。从染色图中可以看出，染色后的细胞形态清晰，细胞核、细胞膜和胞浆的颜色分明，阳性定位准确，信号表达清晰，能够应用于在性淋巴细胞性白血病的辅助诊断中。
[0096]
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

技术特征：
1.一种双染免疫组化试剂盒，其特征在于，包括：固定液、破膜剂、一抗试剂、二抗试剂和染色剂，其中，所述一抗试剂包括lef1抗体和cd20抗体；所述二抗试剂包括碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物和辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物。2.根据权利要求1所述的双染免疫组化试剂盒，其特征在于，所述lef1抗体和所述cd20抗体来源于两种不同种属的动物。3.根据权利要求1所述的双染免疫组化试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶ap标记的二抗聚合物用于与来源于第一种属动物的一抗结合，所述辣根过氧化物酶hrp标记的二抗聚合物用于与来源于第二种属动物的一抗结合，所述第一种属动物和所述第二种属动物不同。4.根据权利要求1所述的双染免疫组化试剂盒，其特征在于，所述第一种属动物与所述第二种属动物分别与所述lef1抗体和所述cd20抗体的动物种属一致。5.根据权利要求1所述的双染免疫组化试剂盒，其特征在于，所述染色剂包括过氧化酶底物染色液、碱性磷酸酶底物染色液和复染染色液，所述复染染色液的显色不掩盖所述过氧化酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液的显色。6.根据权利要求1所述的双染免疫组化试剂盒，其特征在于，所述固定液为甲醇和甲醛的混合液。7.权利要求1所述的双染免疫组化试剂盒，其特征在于，所述双染免疫组化试剂盒还包括蛋白阻断剂，所述蛋白阻断剂选自牛血清蛋白缓冲溶液、山羊血清缓冲溶液、马血清缓冲溶液和酪蛋白磷酸盐缓冲溶液中的一种或多种。8.权利要求1所述的双染免疫组化试剂盒，其特征在于，所述破膜剂选自皂角苷、醛类、醇类、酮类、氯化钠、氯化钙、苯甲酸钠、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚、曲拉通x-100、triton-x和tween-20中一种或多种。9.权利要求1所述的双染免疫组化试剂盒，其特征在于，所述的双染免疫组化试剂盒用于对外周血涂片、骨髓涂片、细胞涂片进行染色。10.根据权利要求1～9任意一项所述的双染免疫组化试剂盒在慢性淋巴细胞性白血病诊断中的应用。

技术总结
本发明提供一种双染免疫组化试剂盒及应用，涉及免疫组化领域。其中，双染免疫组化试剂盒包括：固定液、破膜剂、一抗试剂、二抗试剂和染色剂，其中，一抗试剂包括LEF1抗体和CD20抗体。二抗试剂包括碱性磷酸酶AP标记的二抗聚合物和辣根过氧化物酶HRP标记的二抗聚合物。该试剂盒获得染色样本细胞形态完整，流程简单，能够有效提高细胞形态的辨识度，提高诊断准确率。率。率。


技术研发人员：王蓉 王琰 王慧 陈炜钢 史晓娇 丁晓燕 张建富 陈祉睿
受保护的技术使用者：江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/7