瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法与系统

1.本发明涉及光谱检测和光学成像技术领域，尤其涉及一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法与系统。


背景技术：

2.拉曼光谱是分析分子结构的强有力工具，可以包含丰富的样本分子结构信息，并且可以用于解析样本分子的动力学以及与溶剂环境的相互作用，广泛应用于生物、化学等分子反应过程的研究。但是，拉曼光谱的散射截面非常小，检测灵敏度低。而且，受到荧光背景的干扰。
3.基于此，受激拉曼激发荧光(stimulated raman excited fluorescence，sref)光谱技术应运而生。但是sref光谱技术得到的拉曼光谱存在较强的、固有的荧光背景，当前已有的激发技术无法有效抑制荧光背景。
4.基于此，现急需提供一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法。


技术实现要素：

5.本发明提供一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法与系统，用以解决现有技术中当前已有的激发技术无法有效抑制荧光背景的缺陷。
6.本发明提供一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，包括：
7.基于受激拉曼激发脉冲对，产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个所述受激拉曼激发脉冲对；所述受激拉曼激发脉冲对包括基于飞秒脉冲激光产生的时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲和斯托克斯脉冲；
8.基于两个所述受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，并基于探测脉冲，激发所述待测样本产生荧光信号；
9.采集所述荧光信号，将所述荧光信号进行傅里叶变换，得到所述待测样本对应的拉曼光谱。
10.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，所述飞秒脉冲激光基于飞秒激光器产生；
11.所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间存在简并信息，所述简并信息基于所述飞秒激光器的带宽、所述待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构确定。
12.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，所述将所述荧光信号进行傅里叶变换，得到所述待测样本对应的拉曼光谱，包括：
13.滤除所述荧光信号以外波长的光背景，并选出所述荧光信号中处于焦点位置的荧光光子；
14.记录所述荧光光子对应的时域荧光信号，并对所述时域荧光信号进行傅里叶变换，得到所述拉曼光谱。
15.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，所述基于两个所述受激
拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，之前包括：
16.对所述斯托克斯脉冲的带宽进行调节，以使所述斯托克斯脉冲与所述泵浦脉冲的带宽差异在预设范围内。
17.本发明提供一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，包括：飞秒级激光光源、延时扫描装置以及信号采集装置；
18.所述飞秒级激光光源用于产生受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲，所述受激拉曼激发脉冲对包括基于飞秒脉冲激光产生的时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲和斯托克斯脉冲；
19.所述延时扫描装置用于基于所述受激拉曼激发脉冲对产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个所述受激拉曼激发脉冲对，两个所述受激拉曼激发脉冲对用于激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，以使所述待测样本受所述探测脉冲激发产生荧光信号；
20.所述信号采集装置用于采集所述荧光信号，并将所述荧光信号进行傅里叶变换，得到所述待测样本对应的拉曼光谱。
21.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述飞秒级激光光源包括飞秒激光器，所述飞秒激光器用于产生所述飞秒脉冲激光；
22.所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间的简并信息，基于所述飞秒激光器的带宽、所述待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构确定。
23.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间不存在简并，或所述泵浦脉冲与所述探测脉冲简并；相应地，
24.所述飞秒级激光光源包括飞秒激光器、偏振分光器、第一二向色镜、第一光源支路以及第二光源支路；所述飞秒激光器用于产生所述飞秒脉冲激光；所述偏振分光器用于将所述飞秒脉冲激光分为第一部分光束和第二部分光束；
25.所述第一光源支路包括第一色散补偿器件，所述第一色散补偿器件用于对所述第一部分光束进行色散补偿，得到所述斯托克斯脉冲；
26.所述第二光源支路包括倍频器、光参量振荡器、第二色散补偿器件以及可调的第一光学延迟线；所述倍频器用于将所述第二部分光束进行倍频，得到倍频激光；所述光参量振荡器由所述倍频激光驱动，输出所述泵浦脉冲；所述第一光学延迟线用于使所述泵浦脉冲与所述斯托克斯脉冲在时间维度对齐；所述第二色散补偿器件用于对所述泵浦脉冲进行色散补偿；
27.所述第一二向色镜用于使所述泵浦脉冲与所述斯托克斯脉冲在空间维度对齐。
28.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述第一光源支路还包括光谱滤波装置；
29.所述光谱滤波装置用于对所述斯托克斯脉冲的带宽进行调节，以使所述斯托克斯脉冲与所述泵浦脉冲的带宽差异在预设范围内。
30.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间不存在简并；相应地，
31.所述飞秒级激光光源还包括探测激光器以及沿光路设置的第二光学延迟线和第二二向色镜；
32.所述探测激光器用于产生所述探测脉冲；
33.所述第二光学延迟线用于控制所述探测脉冲与目标脉冲对之间存在的延迟，所述目标脉冲对为两个所述受激拉曼激发脉冲对中时间靠后的受激拉曼激发脉冲对；
34.所述第二二向色镜用于将两个所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲在空间维度对齐。
35.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述延时扫描装置包括干涉仪，所述干涉仪的一臂包括可调的第三光学延迟线。
36.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述第三光学延迟线固定于位移台上；
37.所述信号采集装置基于所述位移台的位置信息触发。
38.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述干涉仪还包括第一分束镜、第二分束镜以及参考信号检测装置；
39.所述第一分束镜用于将所述飞秒级激光光源产生的所述受激拉曼激发脉冲对的目标光束分为第三部分光束和第四部分光束，所述第三部分光束沿所述干涉仪的第一臂传输，所述第四部分光束沿所述干涉仪的第二臂传输；
40.所述第二分束镜用于将所述第一臂输出的光束与所述第二臂输出的光束进行合束，并分别得到第五部分光束和第六部分光束，所述第五部分光束用于激发所述待测样本产生瞬态受激拉曼散射以及所述荧光信号；
41.所述参考信号检测装置用于接收所述第六部分光束，并将所述第六部分光束转换为相干时间大于预设阈值的参考信号，所述参考信号用于对所述位移台的位置信息进行校准。
42.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述参考信号检测装置包括光栅、透镜以及狭缝；
43.所述第六部分光束依次经过所述光栅、所述透镜以及所述狭缝，得到所述参考信号。
44.根据本发明提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述信号采集装置包括沿光路设置的滤光片、筛选元件、光电探测器以及数据采集卡；
45.所述滤光片用于滤除所述荧光信号以外波长的光背景；
46.所述筛选元件用于选出所述荧光信号中处于焦点位置的荧光光子；
47.所述光电探测器用于记录所述荧光光子对应的时域荧光信号；
48.所述数据采集卡用于对所述时域荧光信号进行傅里叶变换，得到所述拉曼光谱。
49.本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法与系统，该方法包括：基于受激拉曼激发脉冲对产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个受激拉曼激发脉冲对；基于两个受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，并基于探测脉冲，激发待测样本产生荧光信号；采集荧光信号，并将荧光信号进行傅里叶变换，得到待测样本对应的拉曼光谱。由于引入具有可调相对延迟的两个受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，可以使待测样本在受探测脉冲激发时产生时域上包含拉曼共振频率的荧光信号，进而经过傅立叶变换后可以在频域上看到清晰的无荧光背景的拉曼光谱，可以保证拉曼光谱的质量，避免拉曼光谱受荧光背景的影响。
附图说明
50.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
51.图1是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法的流程示意图；
52.图2是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统中受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲不存在简并的情况下待测样本的激发能级图；
53.图3是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统中泵浦脉冲与探测脉冲简并的情况下待测样本的激发能级图；
54.图4是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统中受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲简并的情况下待测样本的激发能级图；
55.图5是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的结构示意图之一；
56.图6是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的结构示意图之二；
57.图7是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的结构示意图之三；
58.图8是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的结构示意图之四；
59.图9是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的结构示意图之五；
60.图10是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统采用的t-sref光谱技术的完整技术路线图；
61.图11是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统中atto740染料分子受到两个受激拉曼激发脉冲对激发产生瞬态受激拉曼散射，并受探测脉冲激发产生c＝c骨架模式的时域荧光信号示意图；
62.图12是本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统中信号采集装置对时域荧光信号进行傅里叶变换得到的光谱图。
具体实施方式
63.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
64.由于现有的sref光谱技术得到的拉曼光谱存在较强的、固有的荧光背景，当前已有的激发技术无法有效抑制荧光背景。基于此，本发明实施例中提供了一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，以产生无荧光背景的拉曼光谱。
65.图1为本发明实施例中提供的一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法的流程示意图，如图1所示，该方法包括：
66.s1，基于受激拉曼激发脉冲对，产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个所述受激拉曼激发脉冲对；所述受激拉曼激发脉冲对包括基于飞秒脉冲激光产生的时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲和斯托克斯脉冲；
67.s2，基于两个所述受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，并基于探测脉冲，激发所述待测样本产生荧光信号；
68.s3，采集所述荧光信号，将所述荧光信号进行傅里叶变换，得到所述待测样本对应的拉曼光谱。
69.具体地，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，可以通过瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统实现。
70.首先，执行步骤s1，利用受激拉曼激发脉冲对，产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个受激拉曼激发脉冲对。受激拉曼激发脉冲对可以通过飞秒级激光光源产生，受激拉曼激发脉冲对可以包括基于飞秒脉冲激光产生的时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲和斯托克斯脉冲。飞秒级激光光源可以包括飞秒激光器，该飞秒激光器可以用于产生飞秒脉冲激光。
71.此处，两个受激拉曼激发脉冲对可以通过延时扫描装置产生，延时扫描装置可以是干涉仪等设备，此处不作具体限定。对齐即为重叠，时间维度对齐是指泵浦脉冲和斯托克斯脉冲在某一时刻处于同一位置，即二者可以相遇，空间维度对齐是指泵浦脉冲和斯托克斯脉冲合并为同一光束。
72.然后，执行步骤s2，利用产生的两个受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，此后利用探测脉冲，激发待测样本产生荧光信号。即待测样本会进一步被探测脉冲激发到电子能级激发态产生荧光信号(fluorescence)。该荧光信号在时域上包含有拉曼共振频率。
73.若两个受激拉曼激发脉冲对之间的相对延迟为τ，则待测样本经过两次时间上相隔τ的受激拉曼激发，前后两次激发产生的振动量子态波包分别为χ(t)和χ(t)与在传播时间上相差τ。对于振动量子态波包内的每一个拉曼模式|νi》，最终的激发概率pi为每次激发的相干叠加，出现正比于cos(ωiτ)的量子干涉拍频项。其中，ωiτ为相对延迟τ积累的相位差，ωi为拉曼模式的共振频率。量子干涉拍频项可以被探测脉冲映射到电子能级激发态，最终表现在读出荧光信号的强度上。
74.此处，受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲可以由一个激光器产生，也可以由两个不同的激光器产生，根据激光器产生的激光带宽而定，此处不作具体限定。
75.最后，执行步骤s3，采集荧光信号，将荧光信号进行傅里叶变换，得到待测样本对应的拉曼光谱。该过程可以通过信号采集装置实现，该信号采集装置可以包括连接的单光子计数器以及数据采集卡，通过单光子计数器可以实现对荧光信号的强度在时域上进行探测，并记录时域荧光信号；通过数据采集卡可以实现对时域荧光信号进行傅里叶变换，进而得到拉曼光谱。该数据采集卡可以与显示器连接，通过该显示器对拉曼光谱进行显示。
76.此处，由于待测样本被探测脉冲激发产生的荧光信号在时域上包含有拉曼共振频率，因此经过傅里叶变换后可以在频域上看到清晰的无荧光背景的振动光谱，即拉曼光谱，也称为瞬态受激拉曼激发荧光光谱。除此之外，本发明实施例中还可以通过对时域荧光信号加窗的方式完全消除荧光背景。
77.由于其中采用的是飞秒脉冲激光，因此该瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法应用的是超快时域光谱技术，即瞬态受激拉曼激发荧光(transient stimulated raman excited fluorescence，t-sref)光谱技术，t-sref光谱技术通过两个包含有泵浦脉冲以及斯托克斯脉冲的受激拉曼激发脉冲对之间的相对延时，激发待测样本产生时域上包含拉曼共振频率的荧光信号，进而经过傅立叶变换后可以在频域上看到清晰的无荧光背景的拉曼光谱。
78.本发明提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，包括：基于受激拉曼激发脉冲对产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个受激拉曼激发脉冲对；基于两个受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，并基于探测脉冲，激发待测样本产生荧光信号；采集荧光信号，并将荧光信号进行傅里叶变换，得到待测样本对应的拉曼光谱。由于引入具有可调相对延迟的两个受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，可以使待测样本在受探测脉冲激发时产生时域上包含拉曼共振频率的荧光信号，进而经过傅立叶变换后可以在频域上看到清晰的无荧光背景的拉曼光谱，可以保证拉曼光谱的质量，避免拉曼光谱受荧光背景的影响。
79.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，所述飞秒脉冲激光基于飞秒激光器产生；
80.所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间存在简并信息，所述简并信息基于所述飞秒激光器的带宽、所述待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构确定。
81.具体地，受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲之间的简并信息可以包括受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲不存在简并、泵浦脉冲与探测脉冲简并以及受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲简并这三种情况，具体是哪种情况取决于飞秒激光器的带宽、待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构。
82.其中，受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲不存在简并，可以避免因简并带来的噪声。这种情况下待测样本的激发能级图如图2所示。其中，τ2＝τ，τ1为探测脉冲与两个受激拉曼激发脉冲对中时间靠后的受激拉曼激发脉冲对之间存在的延迟。|e0》为电子能级基态，|g》为振动基态。
83.泵浦脉冲与探测脉冲简并，是指泵浦脉冲与探测脉冲是同一脉冲，该脉冲覆盖了泵浦脉冲的频率成分以及探测脉冲的频率成分，可以实现泵浦脉冲的功能以及探测脉冲的功能。这种情况下待测样本的激发能级图如图3所示。其中，τ2＝τ，τ1＝0。
84.受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲简并，是指泵浦脉冲、斯托克斯脉冲以及探测脉冲是同一脉冲，该脉冲覆盖了泵浦脉冲的频率成分、斯托克斯脉冲的频率成分以及探测脉冲的频率成分，可以实现泵浦脉冲的功能、斯托克斯脉冲的功能以及探测脉冲的功能。这种情况下待测样本的激发能级图如图4所示。
85.本发明实施例中，受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲之间的简并信息可以根据飞秒激光器的带宽、待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构确定，如此有助于对飞秒激光光源的结构进行简化。
86.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，所述基于受激拉曼激发脉冲对，产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个所述受激拉曼激发脉冲对，之前包括：
87.将所述飞秒脉冲激光分为第一部分光束和第二部分光束，对所述第一部分光束进行色散补偿，得到所述斯托克斯脉冲；
88.将所述第二部分光束进行倍频，得到倍频激光，并基于所述倍频激光驱动光参量振荡器，输出所述泵浦脉冲；
89.将所述泵浦脉冲与所述斯托克斯脉冲在时间维度以及空间维度对齐。
90.具体地，在产生两个受激拉曼激发脉冲对时，先将飞秒脉冲激光分为第一部分光
束和第二部分光束，对第一部分光束进行色散补偿，得到斯托克斯脉冲。飞秒脉冲激光可以通过飞秒级激光光源中的偏振分光器等分光设备分为第一部分光束和第二部分光束。
91.然后，可以利用色散补偿器件对第一部分光束进行色散补偿，得到斯托克斯脉冲。可以利用倍频器(shg)将第二部分光束进行倍频，得到倍频激光。
92.此后，可以倍频激光驱动光参量振荡器(optical parametric oscillator，opo)，使opo输出泵浦脉冲。
93.最后，可以利用光学延迟线，将泵浦脉冲与斯托克斯脉冲在时间维度以及空间维度对齐。
94.本发明实施例中，通过对飞秒脉冲激光进行分束，分别产生泵浦脉冲以及斯托克斯脉冲，可以为后续激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射提供光源，避免不同光源分别产生泵浦脉冲以及斯托克斯脉冲带来的干扰。
95.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，所述将所述荧光信号进行傅里叶变换，得到所述待测样本对应的拉曼光谱，包括：
96.滤除所述荧光信号以外波长的光背景，并选出所述荧光信号中处于焦点位置的荧光光子；
97.记录所述荧光光子对应的时域荧光信号，并对所述时域荧光信号进行傅里叶变换，得到所述拉曼光谱。
98.具体地，在得到待测样本对应的拉曼光谱的过程中，首先可以滤除荧光信号以外波长的光背景，并选出荧光信号中处于焦点位置的荧光光子，如此可以提高拉曼光谱的信噪比。
99.此后，记录荧光光子对应的时域荧光信号，并对时域荧光信号进行傅里叶变换，得到频域上清晰的无荧光背景的拉曼光谱。
100.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，所述基于两个所述受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，之前包括：
101.对所述斯托克斯脉冲的带宽进行调节，以使所述斯托克斯脉冲与所述泵浦脉冲的带宽差异在预设范围内。
102.具体地，在产生斯托克斯脉冲之后，可以采用光谱滤波装置对斯托克斯脉冲的带宽进行调节，以使斯托克斯脉冲与泵浦脉冲的带宽差异在预设范围内，即使斯托克斯脉冲与泵浦脉冲的带宽一致或接近，提高荧光信号信噪比。
103.图5为本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的结构示意图，如图5所示，该瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统包括飞秒级激光光源1、延时扫描装置2以及信号采集装置3；
104.所述飞秒级激光光源1用于产生受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲，所述受激拉曼激发脉冲对包括时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲和斯托克斯脉冲；
105.所述延时扫描装置2用于基于所述受激拉曼激发脉冲对产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个所述受激拉曼激发脉冲对，两个所述受激拉曼激发脉冲对用于激发待测样本4产生瞬态受激拉曼散射，以使所述待测样本4受所述探测脉冲激发产生荧光信号；
106.所述信号采集装置3用于采集所述荧光信号，并将所述荧光信号进行傅里叶变换，
得到所述待测样本4对应的拉曼光谱。
107.具体地，本发明实施例提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其中的飞秒级激光光源用于产生受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲(probe)，受激拉曼激发脉冲对可以包括时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲(pump)和斯托克斯脉冲(stokes)。
108.受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲可以由一个激光器产生，也可以由两个不同的激光器产生，根据激光器产生的激光带宽而定，此处不作具体限定。
109.泵浦脉冲和斯托克斯脉冲组成的受激拉曼激发脉冲对用于使待测样本的分子泵浦到位于电子能级基态的振动激发态，泵浦脉冲可以是波长在800nm-900nm范围内可调谐的飞秒脉冲。斯托克斯脉冲的波长范围可以是1020nm-1050nm。探测脉冲用于使待测样本的分子从振动激发态激发到电子能级激发态。其光子能量可以是分子第一个电子激发态的能量减去所述电子能级基态的振动激发态能量。
110.延时扫描装置2可以利用受激拉曼激发脉冲对产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个受激拉曼激发脉冲对，该延时扫描装置2可以是干涉仪，干涉仪可以包括两臂，分别为第一臂和第二臂，每个臂可以得到一个受激拉曼激发脉冲对。通过在第一臂或第二臂中引入光学延迟线，可以使两个受激拉曼激发脉冲对之间具有相对延迟，且该相对延迟可以通过控制光学延迟线进行调节。
111.待测样本4可以固定于载物台上，或放置于比色皿内。待测样本4可以设置于两个受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲的传输光路上，两个受激拉曼激发脉冲对激发待测样本4产生瞬态受激拉曼散射，待测样本进一步被探测脉冲激发到电子能级激发态产生荧光信号。该荧光信号在时域上包含有拉曼共振频率。
112.本发明实施例中，两个受激拉曼激发脉冲对之间的相对延迟τ即延时扫描装置2的延时扫描范围，可以设置为大于5ps，如此可以确保后续确定的拉曼光谱的分辨率高于8cm-1
，该分辨率在矩形窗切趾(box-car apodization)函数下为1.2/5ps，高于一般拉曼模式的线宽。延时扫描的步长扫描可以设置为小于1fs，如此可以捕捉到激光波长的二次谐波的瞬态吸收引起的荧光强度震荡，即单光子和多光子的瞬态吸收光谱。
113.瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统还包括信号采集装置，该信号采集装置可以包括连接的单光子计数器以及数据采集卡，通过单光子计数器可以实现对荧光信号的强度在时域上进行探测，并记录时域荧光信号；通过数据采集卡可以实现对时域荧光信号进行傅里叶变换，进而得到拉曼光谱。该数据采集卡可以与显示器连接，通过该显示器对拉曼光谱进行显示。
114.此处，由于待测样本被探测脉冲激发产生的荧光信号在时域上包含有拉曼共振频率，因此经过傅里叶变换后可以在频域上看到清晰的无荧光背景的振动光谱，即拉曼光谱，也称为瞬态受激拉曼激发荧光光谱。除此之外，本发明实施例中还可以通过对时域荧光信号加窗的方式完全消除荧光背景。
115.本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，包括：飞秒级激光光源、延时扫描装置以及信号采集装置；飞秒级激光光源用于产生受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲，受激拉曼激发脉冲对包括时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲和斯托克斯脉冲；延时扫描装置用于基于受激拉曼激发脉冲对产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个受激拉曼激发脉冲对，两个受激拉曼激发脉冲对用于激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，以
使待测样本受探测脉冲激发产生荧光信号；信号采集装置用于采集荧光信号，并将荧光信号进行傅里叶变换，得到待测样本对应的拉曼光谱。由于引入具有可调相对延迟的两个受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，可以使待测样本在受探测脉冲激发时产生时域上包含拉曼共振频率的荧光信号，进而经过傅立叶变换后可以在频域上看到清晰的无荧光背景的拉曼光谱，可以保证拉曼光谱的质量，避免拉曼光谱受荧光背景的影响。
116.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述飞秒级激光光源包括飞秒激光器，所述飞秒激光器用于产生所述受激拉曼激发脉冲对；所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间的简并信息，基于所述飞秒激光器的带宽、所述待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构确定。
117.具体地，本发明实施例中，飞秒级激光光源包括飞秒激光器，例如可以是飞秒光纤激光器，飞秒光纤激光器可以是高功率的掺镱飞秒光纤激光器。该飞秒激光器用于产生受激拉曼激发脉冲对，在产生受激拉曼激发脉冲对时，该飞秒激光器可以结合辅助结构共同实现。此处，辅助结构可以根据需要进行选取，此处不作具体限定。
118.取决于飞秒激光器的带宽、待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构，受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲之间可以存在简并，也可以不存在简并。即受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲之间的简并信息可以包括受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲不存在简并、泵浦脉冲与探测脉冲简并以及受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲简并这三种情况。
119.其中，受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲不存在简并，可以避免因简并带来的噪声。此时飞秒级激光光源还包括用于产生探测脉冲的探测激光器。这种情况下待测样本的激发能级图如图2所示。
120.泵浦脉冲与探测脉冲简并，此时不需要引入用于产生探测脉冲的激光器，可以简化飞秒级激光光源的结构，但是会引入因简并而带来的噪声。这种情况下待测样本的激发能级图如图3所示。
121.受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲简并，这种情况下待测样本的激发能级图如图4所示。此时，只需要飞秒激光器即可，不需要辅助结构，可以进一步简化飞秒级激光光源的结构，但是也会增加因简并而带来的噪声。
122.此外，受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲简并的情况下，飞秒激光器的带宽最大。即只有飞秒激光器是超大带宽的超快飞秒激光器时，才能完全覆盖泵浦脉冲的频率成分、斯托克斯脉冲的频率成分以及探测脉冲的频率成分，才能够实现受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲简并。
123.由于现有的sref光谱技术使用窄带皮秒激光脉冲进行单频率点激发，无法同时激发多个拉曼标记物，导致通量受限。
124.基于此，在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间不存在简并，或所述泵浦脉冲与所述探测脉冲简并；相应地，
125.所述飞秒级激光光源包括飞秒激光器、偏振分光器、第一二向色镜、第一光源支路以及第二光源支路；所述飞秒激光器用于产生飞秒脉冲激光；所述偏振分光器用于将所述飞秒脉冲激光分为第一部分光束和第二部分光束；
126.所述第一光源支路包括第一色散补偿器件，所述第一色散补偿器件用于对所述第一部分光束进行色散补偿，得到所述斯托克斯脉冲；
127.所述第二光源支路包括倍频器、光参量振荡器、第二色散补偿器件以及可调的第一光学延迟线；所述倍频器用于将所述第二部分光束进行倍频，得到倍频激光；所述光参量振荡器由所述倍频激光驱动，输出所述泵浦脉冲；所述第一光学延迟线用于使所述泵浦脉冲与所述斯托克斯脉冲在时间维度对齐；所述第二色散补偿器件用于对所述泵浦脉冲进行色散补偿；
128.所述第一二向色镜用于使所述泵浦脉冲与所述斯托克斯脉冲在空间维度对齐。
129.具体地，在受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲之间不存在简并，或泵浦脉冲与探测脉冲简并的情况下，如图6所示，飞秒级激光光源均包括飞秒激光器11、偏振分光器12、第一二向色镜13、第一光源支路以及第二光源支路。
130.该飞秒激光器11的参数可以包括：中心波长1030nm、100mhz重频、80fs脉冲宽度。飞秒激光器11用于产生飞秒脉冲激光。
131.偏振分光器12可以将飞秒脉冲激光分为具有第一偏振态的第一部分光束和具有第二偏振态的第二部分光束。
132.第一光源支路包括第一色散补偿器件141，第一色散补偿器件141可以对第一部分光束进行色散补偿，以使第一部分光束的脉冲宽度接近傅里叶变换极限，进而得到斯托克斯脉冲。
133.为缩短光路长度，降低瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的尺寸，可以在第一光源支路中引入第一反射镜142，该第一反射镜142的高度可以低于第一部分光束的传输光路，使第一部分光束可以在第一反射镜的上方传输至第一色散补偿器件141。
134.第一色散补偿器件141可以包括两个三棱镜以及一个反射镜，第一部分光束依次经三棱镜后经反射镜反射，反射光束依次经两个三棱镜后由第一反射镜142反射得到斯托克斯脉冲的光束。该斯托克斯脉冲的波长范围可以是1020nm-1050nm。
135.第二光源支路包括倍频器151、光参量振荡器152、第二色散补偿器件153以及可调的第一光学延迟线(optical delay line，odl)154。
136.倍频器151将第二部分光束进行倍频，即将第二部分光束的频率提高至原来的二倍，得到倍频激光。光参量振荡器152由倍频激光驱动，输出泵浦脉冲。该泵浦脉冲的波长范围可以在800nm-900nm范围内调节。
137.第一光学延迟线154可以控制泵浦脉冲的传输产生延迟，进而使泵浦脉冲与斯托克斯脉冲在时间维度对齐。
138.为缩短光路长度，降低瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的尺寸，可以在第二光源支路中引入第二反射镜155，该第二反射镜155的高度可以低于泵浦脉冲的传输光路，使泵浦脉冲可以在第二反射镜155的上方传输至第二色散补偿器件153。
139.第二色散补偿器件153也可以包括两个三棱镜以及一个反射镜，泵浦脉冲的光束依次经三棱镜后经反射镜反射，反射光束依次经三棱镜后由第二反射镜155反射得到色散补偿后的泵浦脉冲的光束，该泵浦脉冲的脉冲宽度接近傅里叶变换极限。
140.第一二向色镜13的一面接收斯托克斯脉冲的光束，并对该光束进行反射，另一面接收泵浦脉冲的光束，并对该光束进行透射，以使泵浦脉冲与斯托克斯脉冲通过波长差异
进行合束，进而使二者在空间维度对齐。
141.本发明实施例中，在飞秒级激光光源中引入第一光源支路和第二光源支路，可以分别产生泵浦脉冲以及斯托克斯脉冲，并通过第一光学延迟线以及第一二向色镜，使泵浦脉冲和斯托克斯脉冲在时间维度和空间维度对齐，为后续激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射提供光源。
142.由于飞秒激光器的工作原理，可能会导致第一光源支路产生的泵浦脉冲与第二光源支路产生的斯托克斯脉冲的带宽不一致较大，这将导致后续产生的荧光信号信噪比不高。
143.基于此，在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述第一光源支路还包括光谱滤波装置；
144.所述光谱滤波装置用于对所述斯托克斯脉冲的带宽进行调节，以使所述斯托克斯脉冲与所述泵浦脉冲的带宽差异在预设范围内。
145.具体地，如图7所示，第一光源支路还包括光谱滤波装置143，该光谱滤波装置143可以对斯托克斯脉冲的带宽进行调节，以使斯托克斯脉冲与泵浦脉冲的带宽差异在预设范围内，即使斯托克斯脉冲与泵浦脉冲的带宽一致或接近。
146.此处，光谱滤波装置143可以是4f光学系统，可以包括第一光栅1431、第一透镜1432、第一狭缝1433以及一个反射镜。
147.为缩短光路长度，降低瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的尺寸，可以在第一光源支路中引入第三反射镜144以及第四反射镜145，该第三反射镜144的高度可以低于斯托克斯脉冲的传输光路，使斯托克斯脉冲可以在第三反射镜144的上方传输至光谱滤波装置143。
148.斯托克斯脉冲的光束依次经过第一光栅1431、第一透镜1432以及第一狭缝1433后，经过反射镜反射后再顺次经过第一狭缝1433、第一透镜1432以及第一光栅1431输出光谱滤波装置143。
149.光谱滤波装置143输出的斯托克斯脉冲的光束经第三反射镜144反射后继续经第四反射镜145在第一二向色镜13的一面反射。
150.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间不存在简并；相应地，
151.所述飞秒级激光光源还包括探测激光器以及沿光路设置的第二光学延迟线和第二二向色镜；
152.所述探测激光器用于产生所述探测脉冲；
153.所述第二光学延迟线用于控制所述探测脉冲与目标脉冲对之间存在的延迟，所述目标脉冲对为两个所述受激拉曼激发脉冲对中时间靠后的受激拉曼激发脉冲对；
154.所述第二二向色镜用于将两个所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲在空间维度对齐。
155.具体地，如图8所示，在受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲之间不存在简并的情况下，飞秒级激光光源还包括探测激光器16以及沿光路设置的第二光学延迟线17和第二二向色镜18。
156.探测激光器用于产生探测脉冲，探测激光器的类型可以根据需要进行选取，此处
不作具体限定，只要能够产生探测脉冲即可。
157.第二光学延迟线17可以控制探测脉冲与目标脉冲对之间存在的延迟τ1，即控制探测脉冲与两个受激拉曼激发脉冲对中时间靠后的受激拉曼激发脉冲对之间存在的延迟。该延迟τ1的取值范围可以是0-5ps，用以探测待测样本的电子能级的寿命。延迟τ1的取值越大，荧光信号的强度越弱，延迟τ1的取值为0时，荧光信号的强度最强。
158.第二二向色镜18用于将两个受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲在空间维度对齐，即利用波长差异进行合束。
159.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述延时扫描装置包括干涉仪，所述干涉仪的一臂包括可调的第三光学延迟线。
160.具体地，延时扫描装置可以通过干涉仪实现，干涉仪可以是马赫-曾德尔干涉仪，也可以是迈克尔逊干涉仪等，此处不作具体限定。干涉仪可以包括两臂，分别用于输出一个受激拉曼激发脉冲对。干涉仪的两臂中一臂包括可调的第三光学延迟线，用以控制干涉仪输出的两个受激拉曼激发脉冲对之间的相对延迟的大小。
161.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述第三光学延迟线固定于位移台上；
162.所述信号采集装置基于所述位移台的位置信息触发。
163.具体地，第三光学延迟线可以固定在位移台上，通过位移台的移动带动第三光学延迟线的移动，进而实现对两个受激拉曼激发脉冲对之间的相对延迟的控制。
164.信号采集装置可以与延时扫描装置连接，具体可以与延时扫描装置中的位移台连接，以在位移台的位置信息发生变化时触发信号采集装置采集荧光信号并对其进行傅里叶变换，如此可以实现两个受激拉曼激发脉冲对的相对延迟与荧光信号强度的同步采集，提高应该信号以及拉曼光谱的准确性和精度。
165.由于平移台的移动并非是完全匀速的，这将会导致相对延迟的控制出现偏差，进而影响荧光信号的精确采集以及拉曼光谱的准确性。基于此，在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述干涉仪还包括第一分束镜、第二分束镜以及参考信号检测装置；
166.所述第一分束镜用于将所述飞秒级激光光源产生的所述受激拉曼激发脉冲对的目标光束分为第三部分光束和第四部分光束，所述第三部分光束沿所述干涉仪的第一臂传输，所述第四部分光束沿所述干涉仪的第二臂传输；
167.所述第二分束镜用于将所述第一臂输出的光束与所述第二臂输出的光束进行合束，并分别得到第五部分光束和第六部分光束，所述第五部分光束用于激发所述待测样本产生瞬态受激拉曼散射以及所述荧光信号；
168.所述参考信号检测装置用于接收所述第六部分光束，并将所述第六部分光束转换为相干时间大于预设阈值的参考信号，所述参考信号用于对所述位移台的位置信息进行校准。
169.具体地，如图9所示，干涉仪还包括第一分束镜21、第二分束镜22以及参考信号检测装置。第一分束镜21以及第二分束镜22均可以是半透半反分束镜，透射率可以在50％左右。
170.第一分束镜21用于将飞秒级激光光源产生的受激拉曼激发脉冲对的目标光束分
为第三部分光束和第四部分光束，第三部分光束沿干涉仪的第一臂传输，第四部分光束沿干涉仪的第二臂传输。图8中，干涉仪的第一臂具有可调的第三光学延迟线23，干涉仪的第二臂具有固定的第四光学延迟线24。
171.第二分束镜22用于将第一臂输出的光束与第二臂输出的光束进行合束，并分别得到第五部分光束和第六部分光束。第五光束可以经反射镜入射至待测样本4上。
172.图9中，为缩短光路长度，降低瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统的尺寸，在瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统中引入第三二向色镜5以及第五反射镜6，第五部分光束经第三二向色镜5反射后经第五反射镜6反射，此后经两个透镜扩束后经一个反射镜反射至物镜7，通过物镜7使两个受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲入射至载物台上的待测样本4并对待测样本4进行激发。
173.此后，待测样本4受探测脉冲激发产生的荧光信号也通过物镜7接收，并透过第三二向色镜5被信号采集装置3采集到。
174.参考信号检测装置可以接收第六部分光束，并可以将第六部分光束转换为相干时间大于预设阈值的参考信号。此处预设阈值可以根据需要进行设置，例如可以设置为10ps。该参考信号为窄带高相干光。通过参考信号的干涉条纹可以实现对平移台的位置信息的校准。
175.本发明实施例中，引入参考信号检测装置，可以避免因平移台的非匀速移动导致的对相对延迟的控制出现偏差的情况出现，可以实现对荧光信号的精确采集，进而可以提高拉曼光谱的准确性。
176.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述参考信号检测装置可以包括光栅、透镜、狭缝以及光电二极管；
177.所述第六部分光束依次经过所述光栅、所述透镜以及所述狭缝，得到所述参考信号；
178.所述光电二极管用于对所述参考信号进行探测。
179.具体地，如图9所示，为将参考信号检测装置中的光栅、透镜以及狭缝与光谱滤波装置143进行区分，将参考信号检测装置中的光栅记为第二光栅231，透镜记为第二透镜232，狭缝记为第二狭缝233。
180.第六部分光束依次经过第二光束231、第二透镜232以及第二狭缝233实现光谱滤波，进而得到参考信号。该参考信号可以被光电二极管(photo-diode，pd)234探测到。
181.在上述实施例的基础上，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，所述信号采集装置包括沿光路设置的滤光片、筛选元件、光电探测器以及数据采集卡；
182.所述滤光片用于滤除所述荧光信号以外波长的光背景；
183.所述筛选元件用于选出所述荧光信号中处于焦点位置的荧光光子；
184.所述光电探测器用于记录所述荧光光子对应的时域荧光信号；
185.所述数据采集卡用于对所述时域荧光信号进行傅里叶变换，得到所述拉曼光谱。
186.具体地，筛选元件可以包括共焦小孔和/或多模光纤，光电探测器可以包括单光子计数器或其他光电探测器。如图9所示，信号采集装置3可以包括沿光路设置的滤光片31、筛选元件32、光电探测器33以及数据采集卡34。滤光片31可以用于滤除荧光信号中的噪声信号，筛选元件32可以用于选出荧光信号中处于焦点位置的荧光光子。本发明实施例中，由于
滤光片和筛选元件的引入，可以提高拉曼光谱的信噪比。
187.光电探测器33可以具有高量子效率，用于记录荧光光子对应的时域荧光信号，数据采集卡34则可以用于对时域荧光信号进行傅里叶变换，进而得到拉曼光谱。
188.综上所述，本发明实施例中提供的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，t-sref光谱技术可实现对待测样本的拉曼模式不低于40nm的检测灵敏度。t-sref光谱技术除了可获取拉曼光谱，还可以观测到大量多光子吸收的瞬态光谱。相比于传统sref光谱技术，该瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统在拥有同等灵敏度的前提下，既可以消除固有的荧光背景，又可以实现单次激发覆盖几百个波数的高光谱数据采集，一次性解决传统sref光谱技术所面临的主要技术瓶颈。
189.t-sref光谱技术可用于超多色复用荧光显微成像、空间转录组成像、空间蛋白质组成像、瞬态拉曼光谱成像以及电场传感成像等诸多领域。使用该t-sref光谱技术同时获取拉曼光谱以及单光子、多光子的瞬态吸收光谱。
190.图10为t-sref光谱技术的完整技术路线图，如图10所示，在受激拉曼激发脉冲对与探测脉冲之间不存在简并的情况下，泵浦脉冲和斯托克斯脉冲通过时间维度和空间维度对齐后，经过延时扫描装置产生具有可调相对延迟的两个受激拉曼激发脉冲对。一方面，延时扫描装置产生的相对延迟与信号采集装置的采集动作同步触发；另一方面，探测脉冲相对于延时扫描装置产生的两个受激拉曼激发脉冲对中时间靠后的受激拉曼激发脉冲对在时间维度具有延时，但在空间维度对齐。最后，利用包含有泵浦脉冲、斯托克斯脉冲以及探测脉冲的光束对待测样本进行激发，利用信号采集装置采集待测样本产生的荧光信号，并对荧光信号进行傅里叶变换，最终得到拉曼光谱。
191.以待测样本是atto740染料为例，atto740染料分子受到两个受激拉曼激发脉冲对激发产生瞬态受激拉曼散射，并受探测脉冲激发产生c＝c骨架模式的时域荧光信号如图11所示。图11中以矩形窗宽度是4.5ps为例，该矩形窗宽度即为两个受激拉曼激发脉冲对之间的相对延时τ。
192.图12为信号采集装置对图11中的时域荧光信号进行傅里叶变换得到的光谱图。图12中，1642cm-1
处的谱线即为atto740染料分子的c＝c骨架模式的拉曼光谱，除1642cm-1
外的其他谱线为捕捉到的单光子、多光子的电子能级瞬态吸收光谱。
193.以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性的劳动的情况下，即可以理解并实施。
194.通过以上的实施方式的描述，本领域的技术人员可以清楚地了解到各实施方式可借助软件加必需的通用硬件平台的方式来实现，当然也可以通过硬件。基于这样的理解，上述技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品可以存储在计算机可读存储介质中，如rom/ram、磁碟、光盘等，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行各个实施例或者实施例的某些部分所述的方法。
195.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管
参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，其特征在于，包括：基于受激拉曼激发脉冲对，产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个所述受激拉曼激发脉冲对；所述受激拉曼激发脉冲对包括基于飞秒脉冲激光产生的时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲和斯托克斯脉冲；基于两个所述受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，并基于探测脉冲，激发所述待测样本产生荧光信号；采集所述荧光信号，将所述荧光信号进行傅里叶变换，得到所述待测样本对应的拉曼光谱。2.根据权利要求1所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，其特征在于，所述飞秒脉冲激光基于飞秒激光器产生；所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间存在简并信息，所述简并信息基于所述飞秒激光器的带宽、所述待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构确定。3.根据权利要求1所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，其特征在于，所述将所述荧光信号进行傅里叶变换，得到所述待测样本对应的拉曼光谱，包括：滤除所述荧光信号以外波长的光背景，并选出所述荧光信号中处于焦点位置的荧光光子；记录所述荧光光子对应的时域荧光信号，并对所述时域荧光信号进行傅里叶变换，得到所述拉曼光谱。4.根据权利要求1-3中任一项所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法，其特征在于，所述基于两个所述受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，之前包括：对所述斯托克斯脉冲的带宽进行调节，以使所述斯托克斯脉冲与所述泵浦脉冲的带宽差异在预设范围内。5.一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，包括：飞秒级激光光源、延时扫描装置以及信号采集装置；所述飞秒级激光光源用于产生受激拉曼激发脉冲对以及探测脉冲，所述受激拉曼激发脉冲对包括基于飞秒脉冲激光产生的时间维度和空间维度对齐的泵浦脉冲和斯托克斯脉冲；所述延时扫描装置用于基于所述受激拉曼激发脉冲对产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个所述受激拉曼激发脉冲对，两个所述受激拉曼激发脉冲对用于激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，以使所述待测样本受所述探测脉冲激发产生荧光信号；所述信号采集装置用于采集所述荧光信号，并将所述荧光信号进行傅里叶变换，得到所述待测样本对应的拉曼光谱。6.根据权利要求5所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述飞秒级激光光源包括飞秒激光器，所述飞秒激光器用于产生所述飞秒脉冲激光；所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间的简并信息，基于所述飞秒激光器的带宽、所述待测样本被激发的拉曼模式的拉曼位移以及能级结构确定。7.根据权利要求5所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间不存在简并，或所述泵浦脉冲与所述探测脉冲简并；相应地，
所述飞秒级激光光源包括飞秒激光器、偏振分光器、第一二向色镜、第一光源支路以及第二光源支路；所述飞秒激光器用于产生所述飞秒脉冲激光；所述偏振分光器用于将所述飞秒脉冲激光分为第一部分光束和第二部分光束；所述第一光源支路包括第一色散补偿器件，所述第一色散补偿器件用于对所述第一部分光束进行色散补偿，得到所述斯托克斯脉冲；所述第二光源支路包括倍频器、光参量振荡器、第二色散补偿器件以及可调的第一光学延迟线；所述倍频器用于将所述第二部分光束进行倍频，得到倍频激光；所述光参量振荡器由所述倍频激光驱动，输出所述泵浦脉冲；所述第一光学延迟线用于使所述泵浦脉冲与所述斯托克斯脉冲在时间维度对齐；所述第二色散补偿器件用于对所述泵浦脉冲进行色散补偿；所述第一二向色镜用于使所述泵浦脉冲与所述斯托克斯脉冲在空间维度对齐。8.根据权利要求7所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述第一光源支路还包括光谱滤波装置；所述光谱滤波装置用于对所述斯托克斯脉冲的带宽进行调节，以使所述斯托克斯脉冲与所述泵浦脉冲的带宽差异在预设范围内。9.根据权利要求7所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲之间不存在简并；相应地，所述飞秒级激光光源还包括探测激光器以及沿光路设置的第二光学延迟线和第二二向色镜；所述探测激光器用于产生所述探测脉冲；所述第二光学延迟线用于控制所述探测脉冲与目标脉冲对之间存在的延迟，所述目标脉冲对为两个所述受激拉曼激发脉冲对中时间靠后的受激拉曼激发脉冲对；所述第二二向色镜用于将两个所述受激拉曼激发脉冲对与所述探测脉冲在空间维度对齐。10.根据权利要求5-9中任一项所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述延时扫描装置包括干涉仪，所述干涉仪的一臂包括可调的第三光学延迟线。11.根据权利要求10所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述第三光学延迟线固定于位移台上；所述信号采集装置基于所述位移台的位置信息触发。12.根据权利要求11所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述干涉仪还包括第一分束镜、第二分束镜以及参考信号检测装置；所述第一分束镜用于将所述飞秒级激光光源产生的所述受激拉曼激发脉冲对的目标光束分为第三部分光束和第四部分光束，所述第三部分光束沿所述干涉仪的第一臂传输，所述第四部分光束沿所述干涉仪的第二臂传输；所述第二分束镜用于将所述第一臂输出的光束与所述第二臂输出的光束进行合束，并分别得到第五部分光束和第六部分光束，所述第五部分光束用于激发所述待测样本产生瞬态受激拉曼散射以及所述荧光信号；所述参考信号检测装置用于接收所述第六部分光束，并将所述第六部分光束转换为相干时间大于预设阈值的参考信号，所述参考信号用于对所述位移台的位置信息进行校准。
13.根据权利要求12所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述参考信号检测装置包括光栅、透镜、狭缝以及光电二极管；所述第六部分光束依次经过所述光栅、所述透镜以及所述狭缝，得到所述参考信号；所述光电二极管用于对所述参考信号进行探测。14.根据权利要求5-9中任一项所述的瞬态受激拉曼激发荧光光谱系统，其特征在于，所述信号采集装置包括沿光路设置的滤光片、筛选元件、光电探测器以及数据采集卡；所述滤光片用于滤除所述荧光信号以外波长的光背景；所述筛选元件用于选出所述荧光信号中处于焦点位置的荧光光子；所述光电探测器用于记录所述荧光光子对应的时域荧光信号；所述数据采集卡用于对所述时域荧光信号进行傅里叶变换，得到所述拉曼光谱。

技术总结
本发明涉及光谱检测和光学成像技术领域，提供一种瞬态受激拉曼激发荧光光谱方法与系统，该方法包括基于受激拉曼激发脉冲对产生具有相对延迟且相对延迟可调的两个受激拉曼激发脉冲对；基于两个受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，并基于探测脉冲，激发待测样本产生荧光信号；采集待测样本产生的荧光信号，并将荧光信号进行傅里叶变换，得到待测样本对应的拉曼光谱。由于引入具有可调相对延迟的两个受激拉曼激发脉冲对，激发待测样本产生瞬态受激拉曼散射，使待测样本在受探测脉冲激发时产生时域上包含拉曼共振频率的荧光信号，进而经过傅立叶变换后在频域上看到清晰的无荧光背景的拉曼光谱，保证拉曼光谱的质量。光谱的质量。光谱的质量。


技术研发人员：熊汗青 姚政见 余乔智
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/7