一种嗜热菌及其发酵生产1,3-丙二醇的方法与流程

1.本发明涉及生物工程和发酵工程领域，尤其涉及一种嗜热菌及其发酵生产1,3-丙二醇的方法。


背景技术：

2.1,3-丙二醇(pdo)作为一种广泛应用于食品、润滑剂、药物、可生物降解塑料、个人护理产品的中间体，尤其是作为生产高性能聚酯聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt)的关键单体，具有巨大的市场需求，受到广泛关注。目前生物法生产1,3-pdo的方法主要分为两类：第一类是利用基因工程改造菌株，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等，以葡萄糖等糖类为底物，生产1,3-pdo；第二类是利用天然合成1,3-pdo能力的菌株，如肺炎克雷伯杆菌、短乳杆菌和丁酸梭菌等，以甘油为底物，生产1,3-pdo。最近，由于生物柴油产业的发展，甘油作为其副产物，价格逐渐下降，是1,3-pdo生产的理想底物，然而目前报道的1,3-丙二醇生产宿主均来自发酵温度在40℃以下的嗜温菌，由于该温度同时也适合其他微生物的生长，容易导致反应过程被其他微生物污染。同时，发酵过程中产生大量的热量，需要及时冷却发酵罐，由此会产生高能耗，增加成本。此外，目前的生物生产中所采用的嗜温菌受制于温度条件，无法有效利用低营养需求的聚合或短寡聚碳水化合物实现糖酵解。
3.因此，本领域的技术人员致力于开发一种能高温发酵，高效合成1,3-丙二醇的方法以及能高温发酵的菌株，同时减少微生物污染、降低能耗。


技术实现要素：

4.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种能高温发酵，高效合成1,3-丙二醇的方法以及能高温发酵的菌株，同时减少微生物污染、降低能耗。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种嗜热菌，由菌株进行基因改造得到的，菌株包括热葡萄糖苷地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌嗜热脱硫菌、铁乙酸盐栖热泉菌、嗜热盐杆菌、热厌氧杆菌、地下热厌氧杆形菌腾冲亚种、黄芽孢杆菌、醋微菌属、麦角菌、利尼热菌、梭状热厌氧杆或嗜热脂肪地芽孢杆菌；基因改造包括：一方面，通过对甘油氧化代谢途径中的相关酶的基因进行全部或部分敲除，另一方面，加速1，3-丙二醇的合成，具体为对1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白合成相关基因进行全部或部分敲除，或/和过表达二醇脱水酶及其再激活因子基因，嗜热菌的发酵温度范围为：45-70℃。
6.进一步，上述菌株的基因包括脱水酶编码基因和氧化还原酶编码基因。
7.进一步，脱水酶编码基因包括甘油脱水酶编码基因或/和二醇脱水酶编码基因。
8.进一步，氧化还原酶编码基因包括含铁醇脱氢酶、l-苏氨酸脱氢酶、1,3-丙二醇脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶或/和乳醛还原酶。
9.本发明还提供了一种利用嗜热菌发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：
10.步骤1、对菌株进行基因改造，得到嗜热菌；
11.步骤2、分别配制种子和发酵培养基；
12.步骤3、将步骤1得到的嗜热菌在步骤2配制得到的种子培养，转接至步骤2配制得到的发酵培养基中进行摇瓶发酵。
13.进一步地，步骤1中菌株包括热葡萄糖苷地芽孢杆菌及其衍生菌株、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌嗜热脱硫菌、铁乙酸盐栖热泉菌、嗜热盐杆菌、热厌氧杆菌、地下热厌氧杆形菌腾冲亚种、黄芽孢杆菌、醋微菌属、麦角菌、利尼热菌、梭状热厌氧杆或嗜热脂肪地芽孢杆菌。
14.进一步地，步骤1中嗜热菌包括热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6；其中，热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1为adhe基因缺陷的菌株，热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2为ldh基因缺陷的菌株，热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3为pflb基因缺陷的菌株，热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4为alss基因缺陷的菌株，热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5为pdub基因缺陷的菌株，热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6为热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3中过表达二醇脱水酶及其再激活因子的菌株。
15.进一步地，步骤1还包括敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乙醇合成途径的基因得到热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乳酸合成途径的基因得到热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的甲酸合成途径的基因得到热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的2，3-丁二醇合成途径的基因得到热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白关键基因得到热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5，在热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3中过表达二醇脱水酶及其再激活因子得到热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6。
16.进一步地，热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乙醇合成途径的基因为adhe基因，热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乳酸合成途径的基因为ldh基因，热葡萄糖苷地芽孢杆菌的甲酸合成途径的基因为pflb基因，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的2，3-丁二醇合成途径的基因为alss基因，热葡萄糖苷地芽孢杆菌1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白关键基因为pdub基因。
17.进一步地，步骤1中基因改造的步骤包括：
18.步骤1.1、消除乳酸、乙醇或甲酸的合成途径；
19.步骤1.2、加速1，3-丙二醇的合成，具体为：消除1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白的合成途径，过表达二醇脱水酶及其再激活因子基因；消除乳酸、乙醇或甲酸的合成途径包括：对甘油氧化代谢途径中的相关酶的基因进行全部或部分敲除；消除1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白的合成途径包括对1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白合成相关基因进行全部或部分敲除，。
20.进一步地，步骤2中种子培养基为tsb培养基，成分为蛋白胨5-20g/l、大豆蛋白胨5-20g/l和氯化钠1-5g/l，
21.优选地，步骤2中种子培养基为tsb培养基，成分为蛋白胨15g/l，大豆蛋白胨5g/l，氯化钠5g/l。
22.进一步地，步骤2中发酵培养基成分为甘油5-40g/l、酵母粉5-10g/l、氯化铵0.5-1g/l、磷酸氢二钠3-10g/l、磷酸二氢钾1-3g/l、氯化钠0.5-1g/l、柠檬酸0.4-1g/l、硫酸镁0.5-1g/l、硫酸亚铁0.01-0.03g/l、氯化钙0.01-0.025g/l、盐酸硫胺0.005-0.01g/l和生物
素0.001-0.003g/l。
23.优选地，步骤2中发酵培养基成分为甘油20g/l、酵母粉5g/l、氯化铵1g/l、磷酸氢二钠3g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.5g/l、柠檬酸0.42g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸亚铁0.028g/l、氯化钙0.022g/l、盐酸硫胺0.01g/l和生物素0.003g/l。
24.进一步地，步骤3中还包括按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量25-50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，发酵温度为45-70℃。
25.在本发明的较佳实施方式1中，详细说明一种嗜热菌利用甘油合成1，3-丙二醇的路径；
26.在本发明的较佳实施方式2中，详细说明敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乙醇合成途径的过程；
27.在本发明的较佳实施方式3中，详细说明敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乳酸合成途径的过程；
28.在本发明的较佳实施方式4中，详细说明敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的甲酸合成途径的过程；
29.在本发明的较佳实施方式5中，详细说明敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的2，3-丁二醇合成途径的过程；
30.在本发明的较佳实施方式6中，详细说明敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白关键基因的过程；
31.在本发明的较佳实施方式7中，详细说明过表达二醇脱水酶及其再激活因子的过程；
32.在本发明的较佳实施方式8中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955的摇瓶发酵过程；
33.在本发明的较佳实施方式9中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1的摇瓶发酵过程；
34.在本发明的较佳实施方式10中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2的摇瓶发酵过程；
35.在本发明的较佳实施方式11中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3的摇瓶发酵过程；
36.在本发明的较佳实施方式12中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4的摇瓶发酵过程；
37.在本发明的较佳实施方式13中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5的摇瓶发酵过程；
38.在本发明的较佳实施方式14中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6在50毫升发酵培养基中摇瓶发酵过程；
39.在本发明的较佳实施方式15中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6在25毫升发酵培养基中摇瓶发酵过程；
40.在本发明的较佳实施方式16中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6培养温度为50℃摇瓶发酵过程；
41.在本发明的较佳实施方式17中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6培养
温度为55℃摇瓶发酵过程；
42.在本发明的较佳实施方式18中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6培养温度为45℃摇瓶发酵过程；
43.在本发明的较佳实施方式19中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6培养温度为52℃摇瓶发酵过程；
44.在本发明的较佳实施方式20中，详细说明重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6培养温度为70℃摇瓶发酵过程。
45.本技术有益的技术效果如下：
46.嗜热菌发酵可以有效抑制微生物污染，同时嗜热菌可以高效利用低营养需求的聚合或短寡聚碳水化合物实现糖酵解。通过菌株改造，消除乳酸、乙醇、甲酸的合成途径，增强1,3-丙二醇合成途径的通量，同时消除1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白的合成途径，实现1,3-丙二醇在高温条件下的高效生产。具体为：
47.1、实现高温发酵；
48.2、有效减少发酵过程的微生物污染；
49.3、高效合成1,3-丙二醇；
50.4、发酵过程有效减少发酵罐的冷却过程，降低能耗，较少成本。
51.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
52.图1是本发明的一个较佳实施例1中1，3-丙二醇合成路径示意图。
具体实施方式
53.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
54.实施例1：一种嗜热菌利用甘油合成1，3-丙二醇的路径
55.一种嗜热菌利用甘油合成1，3-丙二醇的路径示意图如图1所示，甘油通过二醇脱水酶生产3-羟基丙醛，3-羟基丙醛在醇脱氢酶的作用下合成1，3-丙二醇，1，3-丙二醇保存在壳蛋白细菌微区室，合成过程中甘油氧化途径为1，3-丙二醇合成提供能量和辅因子。
56.通过改造嗜热菌基因，步骤(1)消除或降低甘油氧化过程中的副产物，提升甘油合成3-羟基丙醛的强度，从而提升1,3-丙二醇的合成效率；步骤(2)加速1，3-丙二醇的合成，具体为对1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白合成相关基因进行全部或部分敲除，或/和过表达二醇脱水酶及其再激活因子基因，导致壳蛋白合成功能丢失，无法成功合成完整细菌微1，3-丙二醇区室，从而加速1，3-丙二醇的释放。
57.甘油氧化途径为：生成二羟基丙酮或甘油-3-磷酸，进一步氧化生成磷酸二羟基丙酮，磷酸二羟基丙酮经过多步反应生成丙酮酸。部分丙酮酸经过乙酰辅酶a和乙酰磷酸转化为乙酸，部分丙酮酸在乳酸脱氢酶(ldh基因编码)的作用下生成乳酸，部分丙酮酸在双功能乙醛/乙醇脱氢酶(adhe基因编码)的作用下生成乙醇，部分丙酮酸在丙酮酸-甲酸裂解酶
(pflb基因编码)的作用下生成甲酸。部分丙酮酸在乙酰乳酸合酶(alss基因编码)作用下先生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在乙酰乳酸脱羧酶作用下生成乙偶姻，在丁二醇脱氢酶以及其他酶作用下生成2，3-丁二醇。
58.通过改造嗜热菌，破坏adhe基因，导致双功能乙醛/乙醇脱氢酶活性丢失，消除乙醇合成途径；破坏ldh基因，导致乳酸脱氢酶活性丢失，消除乳酸的合成途径；破坏pflb基因，导致丙酮酸-甲酸裂解酶活性丢失，消除甲酸的合成途径；破坏alss基因，导致乙酰乳酸合酶活性丢失，消除2，3-丁二醇的合成途径；破坏pdub基因，导致壳蛋白合成功能丢失，无法成功合成完整细菌微区室。
59.实施例2：敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乙醇合成途径
60.1.根据热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955的基因组信息(genbank no.gca_001700985.1)设计引物：上游引物adhe-up-f:agcccttagtgactccaagctatatgctcaagacatcg和下游引物adhe-up-r:gagtggtttttatttacgcattctccctcctgattgt。地衣芽孢杆菌ncimb 11955的基因组为模板经pcr扩增得到adhe基因上游692bp片段。
61.根据热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955的基因组信息(genbank no.gca_001700985.1)设计引物：上游引物adhe-down-f:ggagggagaatgcgtaaataaaaaccactcccccaaagaa和下游引物adhe-down-r:gattacgccaagcttcgtttatcaacgcttccaatggc。地衣芽孢杆菌ncimb 11955的基因组为模板经pcr扩增得到adhe基因下游673bp片段。
62.将上述两种pcr产物纯化后各取1微升为模板，以无缝克隆技术将其插入到载体pub-sfgfp，得到敲除载体pub-δadhe。质粒pub-sfgfp的序列见文献报道(engineering thermophilic geobacillus thermoglucosidasius for riboflavin production[j].microbial biotechnology(2021)14(2),363
–
373)。
[0063]
将敲除载体pub-δadhe转化到热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955中，并通过同源重组敲除原理进行adhe基因的敲除，引物选择adhe-up-f:agcccttagtgactccaagctatatgctcaagacatcg，以及adhe-down-r:gattacgccaagcttcgtttatcaacgcttccaatggc，能扩增到1365bp的片段证明已经筛选到了正确的双交换阳性菌落，基因敲除成功，获得的adhe基因缺陷的菌株，命名为热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1。
[0064]
实施例3：敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乳酸合成途径
[0065]
根据热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955的基因组信息(genbank no.gca_001700985.1)设计引物，上游引物为ldh-up-f:agcccttagtgactcgcttgcatctttcgctgcattggta和下游引物ldh-up-r:cgcaactaatttcatcgctgtctgtcatcctttccaa。地衣芽孢杆菌ncimb 11955的基因组为模板经pcr扩增得到ldh基因上游688bp片段。
[0066]
根据热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955的基因组信息(genbank no.gca_001700985.1)设计引物：上游引物ldh-down-f：ggatgacagacagcgtactgactttgaatacaacaaggtg和下游引物ldh-down-r:gattacgccaagcttttaatacccttccacttatccaaga。地衣芽孢杆菌ncimb 11955的基因组为模板经pcr扩增得到ldh基因下游687bp片段。
[0067]
将上述两种pcr产物纯化后各取1微升为模板，以无缝克隆技术将其插入到载体pub-sfgfp，得到敲除载体pub-δldh。
[0068]
将敲除载体pub-δldh转化到热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955中，并通过同源重组敲除原理进行ldh基因的敲除，引物选择ldh-up-f:agcccttagtgactcgcttgcatctttcg
11955的基因组为模板经pcr扩增得到pdub基因上游594bp片段。
[0081]
根据热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955的基因组信息(genbank no.gca_001700985.1)设计引物：上游引物pdub-down-f：attccctcccaaagagcctaacacctccattgcttcat和下游引物pdub-down-r:gattacgccaagcttgcgggaaagattcatatggac。地衣芽孢杆菌ncimb 11955的基因组为模板经pcr扩增得到pdub基因下游579bp片段。
[0082]
将上述两种pcr产物纯化后各取1微升为模板，以无缝克隆技术将其插入到载体pub-sfgfp，得到敲除载体pub-δpdub。
[0083]
将敲除载体pub-δpdub转化到热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955中，并通过同源重组敲除原理进行pdub基因的敲除，引物选择pdub-up-f:tagtgactcggatcctgtttgtgagccaactaaaagg，以及pdub-down-r:gattacgccaagcttgcgggaaagattcatatggac，能扩增到1173bp的片段证明已经筛选到了正确的双交换阳性菌落，基因敲除成功，获得的pdub基因缺陷的菌株，命名为热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5。
[0084]
实施例7：过表达二醇脱水酶及其再激活因子
[0085]
根据热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955的基因组信息(genbank no.gca_001700985.1)设计上游引物pduc-f:gaagggagaatagtgatgagatccaagcgatttcaagtat和下游引物pduh-r：tatttgatgcctggcttacgtaatttcttcaagacgctg为上下游引物pcr扩增得到pducdegh基因片段；根据载体pub-sfgfp序列信息，设计引物对pub-dbt-f：gccaggcatcaaataaaacgaaagg和pub-pldh-r：cactattctcccttcttattattgt，以载体pub-sfgfp为模板进行pcr扩增，得到线性化载体pub31-pldh。
[0086]
将上述pcr产物纯化后通过无缝克隆连接，得到载体pub31-pldh-pducdegh，所得质粒转化到热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3中，得到过表达pducdegh的菌株pdo-6.
[0087]
实施例8:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955的摇瓶发酵。
[0088]
8.1.种子和发酵培养基
[0089]
种子培养基为tsb培养基(成分为蛋白胨15g/l，大豆蛋白胨5g/l，氯化钠5g/l)。
[0090]
发酵培养基成分：甘油20g/l、酵母粉5g/l、氯化铵、磷酸氢二钠3g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.5g/l、柠檬酸0.42g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸亚铁0.028g/l、氯化钙0.022g/l、盐酸硫胺0.01g/l和生物素0.0003g/l。
[0091]
8.2.摇瓶发酵过程
[0092]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌ncimb 11955种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为60℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0093]
8.3.hplc检测方法
[0094]
柱子型号：aminex hpx-87h
[0095]
流动相：0.005mol/l硫酸溶液
[0096]
流速：0.5ml/min
[0097]
柱温：55.0℃
[0098]
进样量：10.00μl
[0099]
检测器：示差检测器
[0100]
检测器温度:55℃
[0101]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为2.82g/l。
[0102]
实施例9:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1的摇瓶发酵。
[0103]
9.1.种子和发酵培养基
[0104]
同实施例8。
[0105]
9.2.种子培养
[0106]
同实施例8。
[0107]
9.3.发酵培养
[0108]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为60℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0109]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为3.17g/l。
[0110]
实施例10:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2的摇瓶发酵。
[0111]
10.1.种子和发酵培养基
[0112]
同实施例8。
[0113]
10.2.种子培养
[0114]
同实施例8。
[0115]
10.3.发酵培养
[0116]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为60℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0117]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为4.23g/l。
[0118]
实施例11:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3的摇瓶发酵。
[0119]
11.1.种子和发酵培养基
[0120]
同实施例8。
[0121]
11.2.种子培养
[0122]
同实施例8。
[0123]
11.3.发酵培养
[0124]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为60℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0125]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为4.75g/l。
[0126]
实施例12:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4的摇瓶发酵。
[0127]
12.1.种子和发酵培养基
[0128]
同实施例8。
[0129]
12.2.种子培养
[0130]
同实施例8。
[0131]
12.3.发酵培养
[0132]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升
锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为60℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0133]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为2.44g/l。
[0134]
实施例13:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5的摇瓶发酵。
[0135]
13.1.种子和发酵培养基
[0136]
同实施例8。
[0137]
13.2.种子培养
[0138]
同实施例8。
[0139]
13.3.发酵培养
[0140]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为60℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0141]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为4.81g/l。
[0142]
实施例14:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6的摇瓶发酵。
[0143]
14.1.种子和发酵培养基
[0144]
同实施例8。
[0145]
14.2.种子培养
[0146]
同实施例8。
[0147]
14.3.发酵培养
[0148]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为60℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0149]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为5.54g/l。
[0150]
实施例15:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6的摇瓶发酵。
[0151]
15.1.种子和发酵培养基
[0152]
同实施例8。
[0153]
15.2.种子培养
[0154]
同实施例8。
[0155]
15.3.发酵培养
[0156]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量25毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为60℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0157]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为5.96g/l。
[0158]
实施例16:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6的摇瓶发酵。
[0159]
16.1.种子和发酵培养基
[0160]
同实施例8。
[0161]
16.2.种子培养
[0162]
同实施例8。
[0163]
16.3.发酵培养
[0164]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为50℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0165]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为1.99g/l。
[0166]
实施例17:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6的摇瓶发酵。
[0167]
17.1.种子和发酵培养基
[0168]
同实施例8。
[0169]
17.2.种子培养
[0170]
同实施例8。
[0171]
17.3.发酵培养
[0172]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为55℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0173]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为4.67g/l。
[0174]
实施例18:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6的摇瓶发酵。
[0175]
18.1.种子和发酵培养基
[0176]
同实施例8。
[0177]
18.2.种子培养
[0178]
同实施例8。
[0179]
18.3.发酵培养
[0180]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为45℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0181]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为0.22g/l。
[0182]
实施例19:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6的摇瓶发酵。
[0183]
19.1.种子和发酵培养基
[0184]
同实施例8。
[0185]
19.2.种子培养
[0186]
同实施例8。
[0187]
19.3.发酵培养
[0188]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为52℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0189]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为2.49g/l。
[0190]
实施例20:重组热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6的摇瓶发酵。
[0191]
20.1.种子和发酵培养基
[0192]
同实施例8。
[0193]
20.2.种子培养
[0194]
同实施例8。
[0195]
20.3.发酵培养
[0196]
将热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6种子过夜培养，按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量50毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，培养温度为70℃。取样1ml后12000rpm，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
[0197]
根据检测结果，48小时摇瓶发酵后，发酵液中的1，3-丙二醇的产量为0.28g/l。
[0198]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种嗜热菌，其特征在于，所述嗜热菌是由菌株进行基因改造得到的，所述菌株包括热葡萄糖苷地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌嗜热脱硫菌、铁乙酸盐栖热泉菌、嗜热盐杆菌、热厌氧杆菌、地下热厌氧杆形菌腾冲亚种、黄芽孢杆菌、醋微菌属、麦角菌、利尼热菌、梭状热厌氧杆或嗜热脂肪地芽孢杆菌；所述基因改造包括一方面，通过对甘油氧化代谢途径中的相关酶的基因进行全部或部分敲除；另一方面，加速1，3-丙二醇的合成，具体为对1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白合成相关基因进行全部或部分敲除，或/和过表达二醇脱水酶及其再激活因子基因；所述嗜热菌的发酵温度范围为：45-70℃。2.一种利用嗜热菌发酵生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、对菌株进行基因改造，得到所述嗜热菌；步骤2、分别配制种子和发酵培养基；步骤3、将步骤1得到的嗜热菌在步骤2配制得到的种子培养基，转接至步骤2配制得到的发酵培养基中进行摇瓶发酵。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中所述菌株包括热葡萄糖苷地芽孢杆菌及其衍生菌株、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌嗜热脱硫菌、铁乙酸盐栖热泉菌、嗜热盐杆菌、热厌氧杆菌、地下热厌氧杆形菌腾冲亚种、黄芽孢杆菌、醋微菌属、麦角菌、利尼热菌、梭状热厌氧杆或嗜热脂肪地芽孢杆菌。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中所述嗜热菌包括热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5、热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6；其中，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1为adhe基因缺陷的菌株，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2为ldh基因缺陷的菌株，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3为pflb基因缺陷的菌株，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4为alss基因缺陷的菌株，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5为pdub基因缺陷的菌株，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6为所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3中过表达二醇脱水酶及其再激活因子的菌株。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乙醇合成途径的基因得到所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-1，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乳酸合成途径的基因得到所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-2，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的甲酸合成途径的基因得到所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的2，3-丁二醇合成途径的基因得到所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-4，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白关键基因得到所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-5，在所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-3中过表达二醇脱水酶及其再激活因子得到所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌pdo-6。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乙醇合成途径的基因为所述adhe基因，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌的乳酸合成途径的基因为ldh基因，所述热葡萄糖苷地芽孢杆菌的甲酸合成途径的基因为pflb基因，敲除热葡萄糖苷地芽孢杆菌的2，3-丁二醇合成途径的基因为alss基因，热葡萄糖苷地芽孢杆菌1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白关键基因为pdub基因。7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中所述基因改造的步骤包括：
步骤1.1、消除乳酸、乙醇或甲酸的合成途径；步骤1.2、加速1，3-丙二醇的合成，具体为：消除1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白的合成途径，或/和过表达二醇脱水酶及其再激活因子基因；所述消除乳酸、乙醇或甲酸的合成途径包括：对甘油氧化代谢途径中的相关酶的基因进行全部或部分敲除；所述消除1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白的合成途径包括对所述1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白合成相关基因进行全部或部分敲除。8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中所述种子培养基为tsb培养基，成分为蛋白胨5-20g/l、大豆蛋白胨5-20g/l和氯化钠1-5g/l。9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中所述发酵培养基成分为甘油5-40g/l、酵母粉5-10g/l、氯化铵0.5-1g/l、磷酸氢二钠3-10g/l、磷酸二氢钾1-3g/l、氯化钠0.5-1g/l、柠檬酸0.4-1g/l、硫酸镁0.5-1g/l、硫酸亚铁0.01-0.03g/l、氯化钙0.01-0.025g/l、盐酸硫胺0.005-0.01g/l和生物素0.001-0.003g/l。10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3中还包括按2％(v/v)接种量转接至250毫升锥形瓶，装液量25-50毫升的所述发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵时长48h，发酵温度为45-70℃。

技术总结
本发明公开了一种嗜热菌及其发酵生产1,3-丙二醇的方法，涉及生物工程和发酵工程领域，该嗜热菌由菌株进行基因改造得到的，具体为对甘油氧化代谢途径中的相关酶的基因进行全部或部分敲除，以及对1，2-丙二醇利用基因簇壳蛋白合成相关基因进行全部或部分敲除，过表达二醇脱水酶及其再激活因子基因。发酵生产1,3-丙二醇的方法为：对菌株进行基因改造，得到嗜热菌；分别配制种子和发酵培养基；将嗜热菌进行种子培养，转接至发酵培养基中进行摇瓶发酵。本发明发酵过程中有效抑制微生物污染，嗜热菌可以高效利用低营养需求的聚合或短寡聚碳水化合物进行糖酵解，实现1,3-丙二醇在高温条件下的高效生产。条件下的高效生产。条件下的高效生产。


技术研发人员：陶飞 陈知非 许平
受保护的技术使用者：上海肆芃科技有限公司
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/7/7