一种快速鉴定紫花和黄花苜蓿杂交的方法与流程

本发明涉及农业科学领域，特别涉及基因技术，用于快速鉴定紫花和黄花苜蓿杂交是否成功的方法。


背景技术：

分子标记是可用于识别和追踪植物特定性状的遗传变异。这些标记已成为植物育种者必不可少的工具，因为它们可以精确识别和选择植物中的理想性状。近年来，分子标记在植物杂交鉴定中的应用越来越重要。dna分子标记是dna水平遗传变异的直接反映，它具有能对各个发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作出“中性”以及操作简便等特点。正是这些特点，奠定了它极其广泛的应用基础。dna分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异特dna片段。dna分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间dna差异，通常也称为dna的指纹图谱。在过去10多年中，分子标记技术得到了突飞猛进的发展，至今已有几十种分子标记技术相继出现，并在基因库构建、基因克隆、基因组作图、基因定位、作物遗传育种、植物亲缘关系鉴别等各个研究领域得到了广泛的应用。已知，采用dna分子标记鉴定植物或农作物杂交的有关文献报道如下：
1.吴宗怀.紫花苜蓿、杂花苜蓿和黄花苜蓿ssr分子标记分析[d].内蒙古农业大学,2007.
[0002]
崔乐乐.紫花苜蓿与黄花苜蓿杂种分析及snp标记遗传图谱构建[d].中国农业科学院,2020.
[0003]
王传堂,杨新道,于翔等.dna分子标记技术在花生品种鉴定上的应用研究[j].华北农学报,2006(s2):110-113.
[0004]
司浩杰.分子标记辅助水稻光温敏花培不育系的鉴定与研究[d].浙江大学,2017.
[0005]
巩高瑞,张晋,丹成等.应用dna分子标记鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的研究[j].水生生物学报,2017,41(02):321-325.
[0006]
刘磊,王宗礼,李志勇等.利用issr标记解析紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴属植物的亲缘关系[j].agricultural science&technology,2012,13(10):2076-2079.
[0007]
张宇,于林清,慈忠玲.利用srap标记研究紫花苜蓿和黄花苜蓿种质资源遗传多样性[j].中国草地学报,2012,34(01):72-76.
[0008]
衣洁菡,李燕青,孙珂等.山豆根及其混伪品的dna分子标记鉴定方法[j/ol].中药材,2022(05):1088-1092[2023-03-15].
[0009]
林春晶,张春宝,董英山.dna分子标记在作物杂交种纯度鉴定中的应用[j].分子植物育种,2015,13(03):702-710.
[0010]
徐彪,李玉发,牛海龙等.利用ahmite分子标记对花生杂交f1代的真伪鉴定[j].安徽农业科学,2022,50(11):94-97.
[0011]
汪阳,易莉美,班晚婷等.基于ssr分子标记的多年生黑麦草杂交f1代杂种鉴定[j].中国草地学报,2021,43(11):10-17.
[0012]
石广丽,王振兴,孙丹等.基于ssr分子标记技术的葡萄种间杂交f1代鉴定[j].分子植物育种,2021,19(01):187-192.
[0013]
孙宇明,冯丽媛,李琬玥等.srap分子标记鉴定百合杂交后代[j].上海交通大学学报(农业科学版),2015,33(01):53-58.
[0014]
宋波,杨晓,刘高峰等.利用ssr分子标记鉴定“中丝2号”丝瓜杂交种纯度[j].蔬菜,2023,no.387(03):10-14.
[0015]
张艳,孙妍妍,张春宝.分子标记辅助选择在作物杂交种亲本选育中的研究进展[j/ol].分子植物育种:1-11[2023-03-15].本发明通过分子标记技术，利用pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳等实验快速鉴定紫花和黄花苜蓿杂交是否成功，筛选优良性状的苜蓿，有利于创制新型优良的牧草种质资源，缩短杂交品种培育的时间以及提高子代杂交的准确率与成功率，缩短研发时间，以更快的投入生产实践中进行大量培育具有优良性状的牧草。


技术实现要素：

本发明的方法，步骤如下：1)首先对紫花苜蓿与黄花苜蓿进行杂交，然后将紫花苜蓿seq id no.2与黄花苜蓿的qhs1基因seq id no.3进行比对，筛选一段具有核苷酸序列变异的非保守区域作为dna分子标记，其为seq id no.1，使用primer 5.0设计相关引物；2)提取紫花苜蓿与黄花苜蓿杂交后代的gdna，以紫花苜蓿与黄花苜蓿杂交后代的gdna作为模板，使用引物进行pcr扩增；3)对扩增的dna用琼脂糖凝胶电泳进行产物鉴定；4)结果判定，电泳谱带若同时包含紫花苜蓿与黄花苜蓿的qhs1基因变异片段则说明杂交成功，反之说明杂交失败；5)根据需要，可以进行dna测序结果比对，将pcr产物进行测序，扩增片段序列分别与紫花苜蓿和黄花苜蓿的qhs1基因进行比对，以确定扩增产物是否包含qhs1片段。优选的，本发明所述的方法，步骤如下：1)首先对紫花苜蓿与黄花苜蓿进行杂交，以紫花苜蓿作为母本，黄花苜蓿为父本进行人工授粉杂交，选取长势优良的典型父本植株，在小花翼瓣微开时进行杂交，杂交时去雄，授父本花粉，通过蒺藜苜蓿的qhs1基因在新疆大叶和黄花苜蓿的基因组数据库中blast筛选紫花苜蓿和黄花苜蓿中的qhs1同源基因，挑选得分最高的基因进行序列比对，筛选一段具有核苷酸序列变异的非保守区域作为dna分子标记，其为seq id no.1，使用primer 5.0设计相关引物；2)使用ctab法提取杂花苜蓿叶片的gdna进行pcr扩增，pcr扩增使用taq酶；3)配置浓度为1.2％的琼脂糖tae溶液，加入核酸染料进行制胶，凝固30min后取pcr产物3-5ul点样；4)电泳谱带中若同时含有紫花与黄花qhs1基因的变异片段，则说明杂交成功。再通过测序确认扩增片段是否与目标序列匹配；5)根据需要，可以进行dna测序结果比对，将pcr产物进行测序，扩增片段序列分别与紫花黄花苜蓿的qhs1基因进行比对，以确定扩增产物为qhs1片段。最优选的，本发明所述
的方法，步骤如下：1)首先对紫花苜蓿与黄花苜蓿进行杂交，以紫花苜蓿作为母本，黄花苜蓿为父本进行人工授粉杂交，选取长势优良的典型父本植株，在小花翼瓣微开时进行杂交，杂交时去雄，授父本花粉；通过蒺藜苜蓿的qhs1基因在新疆大叶和黄花苜蓿的基因组数据库中blast筛选紫花苜蓿和黄花苜蓿中的qhs1同源基因，挑选得分最高的基因，通过对比紫花与黄花苜蓿的qhs1序列筛选一段具有核苷酸序列变异的非保守区域作为dna分子标记，其为seq id no.1，根据该序列，使用primer 5.0设计相关引物；引物序列如下：2)使用ctab法提取杂花苜蓿叶片的gdna进行pcr扩增。pcr扩增使用taq酶，退火温度根据引物tm调整；3)配置浓度为1.2％的琼脂糖tae溶液，加入核酸染料进行制胶，凝固30min后取pcr产物3-5ul点样；4)电泳谱带中若两对引物均有条带，长度为紫花与黄花qhs1基因的变异片段，则说明杂交成功；5)根据需要，可以进行dna测序结果比对，将pcr产物进行测序，扩增片段序列分别与紫花黄花苜蓿的qhs1基因进行比对，以确定扩增产物为qhs1片段。以下是对本发明名词术语的解释：dna分子标记技术：广义的分子标记是指可遗传的并可检测的dna序列或蛋白质分子，通常所说的分子标记是以dna多态性为基础的遗传标记。pcr扩增：聚合酶链式反应(pcr)是体外酶促合成特异dna片段的一种方法,由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的dna得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，又称无细胞分子克隆或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增技术。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是基因操作的核技术之一，它能够用于分离、鉴定和纯化dna片段。该技术操作简单而迅速，已经成为许多通用的分子生物学研究方法，如dna重组、dna核苷酸序列分析、dna限制性内切酶分析及限制性酶切作图等的技术基础。紫花苜蓿：学名：medicago sativa l.，别称为紫苜蓿、牧蓿等，豆科苜蓿属多年生草本植物，原产于小亚细亚、伊朗、外高加索一带，在中国为栽培植物，现在世界各国都有栽种，为优良饲料植物，可作绿肥，亦可入药。
黄花苜蓿：多年生草本植物，与紫花苜蓿的区别主要在于株型平卧或斜生，叶片小，花黄色，荚果镰形。2n＝16、32。适应性广，生态变异类型多，原产地不同或在不同地区栽培，生长发育特性也有差异。杂交：通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法。一般情况下，把通过生殖细胞相互融合而达到这一目的过程称为杂交；而把由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交。非保守区域：不具有高度相似性或同一性的分子序列。gdna：基因组dna。引物：是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的，一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条dna模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条dna模板链互补。qhs1基因：在大豆种皮中发现的控制种子硬实的基因。蒺藜苜蓿(medicago truncatula)qhs1基因cdna序列，称为seq id no.1其来源为https://medicago.toulouse.inrae.fr/mtrunr108_hic/紫花苜蓿(medicago sativa l.)qhs1基因(ms.gene016750)的核苷酸变异序列：称为seq id no.2，其来源为紫花苜蓿
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新疆大叶’基因组(https://figshare.com/projects/whole_genome_sequencing_and assembly_of_medicago_sativa/66380)经dnaman与黄花苜蓿qhs1基因比对筛选得到。黄花苜蓿(mcdicago falcata l.)qhs1基因(transcript/3837)的核苷酸变异序列：称为seq id no.3，其来源为黄花苜蓿全长转录组测序，经dnaman与紫花苜蓿qhs1基因比对筛选得到。其中，ms.gene016750-f，称为seq id no.4其来源为紫花苜蓿qhs1基因(ms.gene016750)通过primer5.0设计正向引物获得ms.gene016750-r，称为seq id no.5其来源为紫花苜蓿qhs1基因(ms.gene016750)通过primer5.0设计反向引物获得transcript/3837-f，称为seq id no.6其来源为黄花苜蓿qhs1基因(transcript/3837)通过primer5.0设计正向引物获得transcript/3837-r，称为seq id no.7其来源为黄花苜蓿qhs1基因(transcript/3837)通过primer5.0设计反向引物获得紫花苜蓿qhs1基因：ms.gene016750序列为：称为seq id no.8其来源为紫花苜蓿
‘
新疆大叶’基因组(https://figshare.com/projects/whole_genome_sequencing_and assembly_of_medicago_sativa/66380)。黄花苜蓿qhs1基因：transcript/3837序列为：称为seq id no.9，其来源为黄花苜蓿全长转录组测序。有益效果：本实验采用分子生物学领域广泛运用的dna分子扩增技术，鉴定紫花和黄花苜蓿杂交是否成功，筛选优良性状的苜蓿，以有利于创制新型优良的牧草种质资源。dna分子标记技术利用亲代存在的一段非保守区域的基因片段是否在子代中可以检测出来验证是否杂交成功，其可以有效的反映出植株个体的遗传变异情况，并且相比于其他的技术，具有操作简便的特点。在实际生产上，其可以缩短杂交品种培育的时间以及提高子代杂交的准确率与成功率，缩短研发时间，以更快的投入生产实践中进行大量培育具有优良性状的牧草。
现有的鉴定方法有如下缺点：现有的杂花苜蓿鉴定多采用ssr分子标记技术，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有多等位基因的特性，提供的信息量高，但是数据量大，分析时间长，较为复杂。本发明和现有鉴定方法相比，有如下优点：本实验中使用的dna分子标记技术相比于其他现有技术具有操作简便，耗时少的特点，其只需在亲代中筛选到同一基因非保守区域中具有核苷酸变异的序列，在其子代中检测是否同时存在亲代的这两种序列，存在即为杂交成功，反之即为失败。该技术在研发具有更强杂种优势的品种上具有突出的作用，其可以提高杂交的准确率以及成功率，在一定程度上缩短试验时间，节约成本。
附图说明：
图1使用http://47.92.172.28:12088/alfalfa/blast/blastpage网页blast得到紫花苜蓿中的qhs1基因，选择得分最高的同源基因ms.gene016750。黄花苜蓿中qhs1基因(ranscript/3837)通过本地blast筛选并选择得分最高图2紫花与黄花苜蓿qhs1基因的比对结果，选取990bp左右的不保守序列。图3杂交后代的电泳谱带。wl168
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黄花(两株)、中苜一号
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黄花(两株)、wl440
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黄花。每个品种的左侧两条带为紫花苜蓿ms.gene016750，右侧两条带为黄花苜蓿transcript/3837。图4杂交后代pcr产物测序结果。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下所有步骤均在青岛农业大学，黄河三角洲草地资源与生态国家林业和草原局重点实验室完成，所用试剂与仪器均为实验室提供。本实验中的实验材料为wl168
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黄花(两株)、中苜一号
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黄花(两株)、wl440
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黄花的杂交f1代植株，均在青岛农业大学温室内种植。实施例1首先进行杂交，方法如下：紫花苜蓿(wl168、wl440、中苜一号)作为母本，黄花苜蓿为父本进行人工授粉杂交，，选取长势优良的典型父本植株，在小花翼瓣微开时进行杂交，杂交时去雄，授父本花粉。获得wl168
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黄花、中苜一号
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黄花、wl440
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黄花的杂交种子，f1代植株生长至4-5周龄进行取样。1.序列比对将紫花苜蓿和黄花苜蓿的qhs1基因使用dnaman进行序列比对。选取一段具有核苷酸序列变异的非保守区域，约990bp，如图1所示。2.pcr扩增提取紫花与黄花杂交的f1代杂花苜蓿的gdna并作为模板，分别使用紫花和黄花的引物以上述dna模板进行pcr扩增。ctab法提取杂花苜蓿叶片的dna：
1)将20ulrnase原液(50mg/ml)加入40ml预热的2
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ctab缓冲液中。冷冻叶片并研磨，加入700ul配置好的2
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ctab溶液。混合均匀后65℃，30min，每10min摇匀一次。2)加入等体积的的氯仿，混匀后13000rpm，室温离心15min。3)取600-650ul上清液至新的离心管中，并加入2/3体积的异丙醇。混匀后在-20℃静置15min。13000rpm，4℃离心15min。弃上清并用70％无水乙醇冲洗。4)离心5min，并用移液枪去除剩余70％无水乙醇。干燥后加100-200ul去离子水溶解。用primer 5.0设计相关引物，如下表用2
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taqplus master mix
ꢀⅱ
(dye plus)(南京诺唯赞生物技术股份有限公司)进行pcr扩增，pcr扩增程序如下：3.产物鉴定配置1.2％的琼脂糖凝胶，加热溶解后加入核酸染料(南京诺唯赞生物技术股份有限公司)，冷凝后取3-5ulpcr产物加入胶孔中，120v，20min。电泳谱带同时包含紫花与黄花苜蓿的qhs1基因变异片段(图3)，说明杂交成功，另可以将pcr产物进行测序，将引物ms.gene016750-f/r的pcr产物测序结果和seq id no.2进行对比；将引物transcript/3837-f/r的pcr产物测序结果和seq id no.3进行对比。测定结果确定扩增片段为紫花和黄花的qhs1基因(图4)。因此，本实验中的苜蓿确为紫花与黄花的杂交后代。dna分子标记技术相比于其他现有技术具有操作简便，耗时少的特点，其只需在亲代中筛选到同一基因非保守区域中序列完全不一样的一段序列，在其子代中检测是否同时存在这两种序列，存在即为杂交成功，反之即为失败。该技术在研发具有更强杂种优势的品
种上具有突出的作用，其可以提高杂交的准确率以及成功率，在一定程度上缩短试验时间，节约成本。杂花苜蓿是由紫花苜蓿和黄花苜蓿相互杂交产生的复合体,其自身携带有大量的遗传变异基因，兼具亲本的许多优良性状，具有较强的抗逆性、抗旱、抗寒、耐盐碱等性状均优于紫花苜蓿,本实验鉴定紫花和黄花苜蓿杂交是否成功，筛选优良性状的苜蓿，有利于提高创制新型优良的牧草种质的效率。

技术特征：
1.一种快速鉴定紫花和黄花苜蓿杂交的方法，所述方法，步骤如下：步骤如下：1)首先对紫花苜蓿与黄花苜蓿进行杂交，然后将紫花苜蓿seq id no.2与黄花苜蓿的qhs1基因seq id no.3进行比对，筛选一段具有核苷酸序列变异的非保守区域作为dna分子标记，其为seq id no.1，使用primer 5.0设计相关引物；2)提取紫花苜蓿与黄花苜蓿杂交后代的gdna，以紫花苜蓿与黄花苜蓿杂交后代的gdna作为模板，使用引物进行pcr扩增；3)对扩增的dna用琼脂糖凝胶电泳进行产物鉴定；4)结果判定，电泳谱带若同时包含紫花苜蓿与黄花苜蓿的qhs1基因变异片段则说明杂交成功，反之说明杂交失败；5)根据需要，可以进行dna测序结果比对，将pcr产物进行测序，扩增片段序列分别与紫花苜蓿和黄花苜蓿的qhs1基因进行比对，以确定扩增产物是否包含qhs1片段。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：1)首先对紫花苜蓿与黄花苜蓿进行杂交，以紫花苜蓿作为母本，黄花苜蓿为父本进行人工授粉杂交，选取长势优良的典型父本植株，在小花翼瓣微开时进行杂交，杂交时去雄，授父本花粉，通过蒺藜苜蓿的qhs1基因在新疆大叶和黄花苜蓿的基因组数据库中blast筛选紫花苜蓿和黄花苜蓿中的qhs1同源基因，挑选得分最高的基因进行序列比对，筛选一段具有核苷酸序列变异的非保守区域作为dna分子标记，其为seq id no.1，使用primer 5.0设计相关引物；2)使用ctab法提取杂花苜蓿叶片的gdna进行pcr扩增，pcr扩增使用taq酶；3)配置浓度为1.2％的琼脂糖tae溶液，加入核酸染料进行制胶，凝固30min后取pcr产物3-5ul点样；4)电泳谱带中若同时含有紫花与黄花qhs1基因的变异片段，则说明杂交成功。再通过测序确认扩增片段是否与目标序列匹配；5)根据需要，可以进行dna测序结果比对，将pcr产物进行测序，扩增片段序列分别与紫花黄花苜蓿的qhs1基因进行比对，以确定扩增产物为qhs1片段。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：1)首先对紫花苜蓿与黄花苜蓿进行杂交，以紫花苜蓿作为母本，黄花苜蓿为父本进行人工授粉杂交，选取长势优良的典型父本植株，在小花翼瓣微开时进行杂交，杂交时去雄，授父本花粉；通过蒺藜苜蓿的qhs1基因在新疆大叶和黄花苜蓿的基因组数据库中blast筛选紫花苜蓿和黄花苜蓿中的qhs1同源基因，挑选得分最高的基因，通过对比紫花与黄花苜蓿的qhs1序列筛选一段具有核苷酸序列变异的非保守区域作为dna分子标记，其为seq id no.1，根据该序列，使用primer 5.0设计相关引物；引物序列如下：
2)使用ctab法提取杂花苜蓿叶片的gdna进行pcr扩增。pcr扩增使用taq酶，退火温度根据引物tm调整；3)配置浓度为1.2％的琼脂糖tae溶液，加入核酸染料进行制胶，凝固30min后取pcr产物3-5ul点样；4)电泳谱带中若两对引物均有条带，长度为紫花与黄花qhs1基因的变异片段，则说明杂交成功；5)根据需要，可以进行dna测序结果比对，将pcr产物进行测序，扩增片段序列分别与紫花黄花苜蓿的qhs1基因进行比对，以确定扩增产物为qhs1片段。

技术总结
本发明涉及一种快速鉴定紫花和黄花苜蓿杂交的方法，所述方法，步骤如下：步骤如下：1)首先对紫花苜蓿与黄花苜蓿进行杂交，然后将紫花苜蓿SEQ ID NO.2与黄花苜蓿的QHS1基因SEQ ID NO.3进行比对，筛选一段具有核苷酸序列变异的非保守区域作为DNA分子标记，其为SEQ ID NO.1；2)提取紫花与黄花苜蓿杂交后代的gDNA，以紫花与黄花苜蓿杂交后代的gDNA作为模板进行PCR扩增；3)琼脂糖凝胶电泳进行产物鉴定；4)结果判定，电泳谱带若同时包含紫花与黄花苜蓿的QHS1基因变异片段则说明杂交成功，反之说明杂交失败。杂交失败。杂交失败。


技术研发人员：柴茂峰 孙越 任雅儒 李想 张天艺 王召明 苑峰 刘亚玲 丛丽丽 谢红丽
受保护的技术使用者：蒙草生态环境（集团）股份有限公司
技术研发日：2023.04.02
技术公布日：2023/7/12