一种具有在人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株的筛选方法

1.本发明具体涉及一种具有在人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株的筛选方法，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.肠道菌群参与了人体内复杂的生理代谢过程，对于免疫防御的建立，神经系统甚至人类行为产生影响。当稳态的肠道菌群被破坏后，它们可能参与了诱发如肥胖、糖尿病、炎症性肠病(ibd)、肠易激综合征(ibs)等疾病的过程。因此，肠道微生物的种类和丰度保持相对稳定与人类的健康紧密相关。
3.双歧杆菌是人类肠道益生菌的代表，是公认的重要的益生菌，在人肠道中所占丰度较高，作为益生菌制剂在食品和药品中得到了广泛的应用。但双歧杆菌作为外源菌摄入可能会出现定殖时间短而无法长久发挥益生功效等问题，并且益生效果具有菌株特异性。有研究发现，各个双歧杆菌种在肠道中的丰度都随不同的饮食、年龄等状态的变化而呈现个体化特征。影响益生菌在人体肠道内丰度的因素可以分为宿主因素、环境因素以及菌株自身特异性三方面。其中，菌株自身特异性包括菌株对碳源、氮源的利用能力，对肠道上皮细胞的黏附能力等。
4.目前，检测肠道微生物的方法主要有传统培养法、聚合酶链式反应技术、荧光原位杂交、基因芯片、宏基因组测序技术等，研究人员以不同的目标为导向选择了不同的肠道微生物的筛选方法，如为了筛选低丰度拟杆菌而采用选择性培养基进行培养达到分离和富集所需菌种，或者使用宏基因组分析婴儿肠道内菌群丰度的动态变化后对肠道产酸微生物进行分离、纯化和鉴定，并检测了分离菌株的病原菌抑制作用、耐药性及抗生素敏感性，等等。具有定殖能力的双歧杆菌的筛选方法也是从基因层面展开的，有研究人员通过高通量dna测序筛选宿主的全基因组中促进定殖的基因，研究人员需要得到菌株的基因草图，确定其是否具有影响定殖能力的基因位点。检测双歧杆菌的定殖能力则需要进行长期跟踪的人群实验或者动物实验，通过设计在复杂样本中的特异性定量检测技术追踪摄入后的双歧杆菌定殖情况，整个实验过程比较繁琐、耗时较长。
5.但是如果能将宏基因组数据与菌株生理特性的体外实验数据相结合，找到与宏基因组数据中相关性极强的实验指标，则能使快速筛选具有占据丰度优势潜力的菌株成为可能。本发明首次提出使用代时、od
600 nm
及细胞黏附方法的组合来精准筛选具有高丰度潜力的双歧杆菌株，目前并没有筛选高丰度双歧杆菌菌株的方法出现，菌株在不同培养基中的代时和生长量具有显著差异，这也就使得其具备了筛选的条件，本发明首先证明了使用的筛选指标的科学性和可行性，其次使用本筛选方法能较其他方法更快速地、低成本地筛选出具备高丰度潜力的双歧杆菌菌株，甚至可以推广到提出一种筛选具有在肠道中占高丰度的潜力的菌株的方法，这对益生菌的应用是可以提供理论支持的。


技术实现要素：

6.本发明通过对长双歧杆菌这一已知在人肠道中占据属内丰度优势的双歧杆菌进行机制探究，找到造成长双歧杆菌占据属内丰度优势的关键因素并进行实验验证，进而总结出一种筛选在人肠道内具有高丰度潜力双歧杆菌菌株的方法；本发明提供了一种筛选在人肠道内占据高丰度潜力的双歧杆菌菌株的方法，所述方法为通过对菌株各项生理特性指标的实验及验证来预测其经摄入后在人肠道内是否能占据高丰度。
7.在本发明的一种实施方式中，所述生理特性指标的实验是碳源利用表型实验、氮源利用表型实验、对肠道上皮细胞的单菌以及竞争黏附能力实验等4项实验。
8.在本发明的一种实施方式中，碳源利用表型实验方法为：利用酸碱指示剂进行菌株的碳源利用能力测定，利用酶标仪测定菌株在不同碳源培养基中的代时、od
600 nm
值。
9.在本发明的一种实施方式中，氮源利用表型实验方法为：利用酶标仪测定菌株在不同氮源培养基中的od
600 nm
值。
10.在本发明的一种实施方式中，将上述实验结果放入表1～2，可判断该菌株是否具备高丰度潜力，可使用验证实验进行验证。判断双歧杆菌能否占据肠道内丰度优势的方法简述如下：通过10种碳源、6种氮源、2种黏附能力的指标进行判断。符合的指标越多，占据丰度优势的可能性越大。其中对于d-木糖、低聚果糖两种碳源的利用与其所占丰度的相关性极大，代时与丰度呈显著负相关、od
600 nm
值或碳源利用能力与丰度呈显著正相关。结论已通过人粪便体外发酵、小鼠粪便体外发酵验证。筛选表格如表1和表2所示。
11.表1具有高丰度潜力双歧杆菌的碳源筛选表格
[0012][0013]
表2具有高丰度潜力双歧杆菌的氮源及黏附能力筛选表格
[0014][0015]
注：显著程度表示每个指标与丰度相关性的显著程度，当p＜0.05时标注“*”，当p
＜0.01时标注“**”，当p＜0.001时标注“***”，当p＜0.0001时标注“****”。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，本发明提供了一种具有在人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌的筛选方法，所述方法为：
[0017]
(1)双歧杆菌的初步筛选
[0018]
1)将待筛选的双歧杆菌菌株在液体mmrs培养基中培养2～3代，离心重悬；
[0019]
2)将步骤1)重悬后的双歧杆菌接入将碳源替换为d-木糖的加有溴甲酚紫酸碱指示剂的液体mmrs培养基中，进行培养后，观察颜色变化，若颜色变黄则认为达标，为指标1；
[0020]
3)将步骤1)重悬后的双歧杆菌接入将碳源替换为低聚果糖的加有溴甲酚紫酸碱指示剂的液体mmrs培养基中，进行培养后，观察颜色变化，若颜色变黄则认为达标，为指标2；
[0021]
在任一碳源培养基中变黄的菌株进入下一轮实验；
[0022]
(2)双歧杆菌的复筛
[0023]
1)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌采用荧光染色法检测单株双歧杆菌对肠道上皮细胞ht-29的单黏附能力，单黏附能力≤0.27％达标；为指标3；
[0024]
2)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌采用绝对定量法检测不同种菌株对肠道上皮细胞ht-29的竞争黏附能力，竞争黏附能力≤4.3
×
105cfu/ml达标，为指标4；
[0025]
3)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到替换了不同碳源的mmrs液体培养基中，在37℃厌氧条件进行培养24h；分别检测以下指标：
[0026]
a、在碳源为d-木糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600 nm
；代时为94～705min或第24h的od
600 nm
≥0.19达标，为指标5和6；
[0027]
b、在碳源为低聚果糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600 nm
；代时为68～139min或第24h的od
600 nm
≥0.78达标，为指标7和8；
[0028]
c、在碳源为葡萄糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600 nm
；代时为55～141min或第24h的od
600 nm
≥0.83达标，为指标9和10；
[0029]
d、在碳源为菊粉的培养基中进行培养后，检测代时、od
600 nm
；代时为75～152min或第24h的od
600 nm
≥0.65达标，为指标11和12；
[0030]
e、在添加了溴甲酚紫的碳源为蔗糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标13；将变黄的菌株转移至蔗糖培养基中培养，检测od
600 nm
；第24h的od
600 nm
≥0.77达标，为指标14；
[0031]
f、在添加了溴甲酚紫的碳源为低聚半乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标15；将变黄的菌株转移至低聚半乳糖培养基中培养，检测od
600 nm
；第24h的od
600 nm
≥0.96达标，为指标16；
[0032]
g、在添加了溴甲酚紫的碳源为乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标17；将变黄的菌株转移至乳糖培养基中培养，检测od
600 nm
；第24h的od
600 nm
≥1.00达标，为指标18；
[0033]
h、在添加了溴甲酚紫的碳源为d-半乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标19；将变黄的菌株转移至d-半乳糖培养基中培养，检测od
600 nm
；第24h的od
600nm
≥0.63达标，为指标20；
[0034]
i、在添加了溴甲酚紫的碳源为d-麦芽糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认
为达标，为指标21；
[0035]
j、在添加了溴甲酚紫的碳源为海藻糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标22；
[0036]
4)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到含有不同氮源的氮源培养基中，在37℃厌氧条件进行培养48h；分别检测以下指标：
[0037]
k、在氮源为复合氮源的氮源培养基中进行培养后，检测od
600 nm
；第48h的od
600 nm
≥0.26达标，为指标23；所述复合氮源为胰蛋白胨、牛肉膏和酵母粉；
[0038]
l、在氮源为酵母浸粉fm818的氮源培养基中进行培养后，检测od
600 nm
；第48h的od
600nm
≥0.34达标，为指标24；
[0039]
m、在氮源为酵母浸粉fm888的氮源培养基中进行培养后，检测od
600 nm
；第48h的od
600 nm
≥0.36达标，为指标25；
[0040]
n、在氮源为酵母蛋白胨的氮源培养基中进行培养后，检测od
600 nm
；第48h的od
600 nm
≥0.32达标，为指标26；
[0041]
o、在氮源为酵母提取物的氮源培养基中进行培养后，检测od
600 nm
；第48h的od
600 nm
≥0.36达标，为指标27；
[0042]
(3)判断在人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株：按照步骤(1)～(2)的方法，检测上述27个指标，将至少符合17个指标的菌株，判断为人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株。
[0043]
在本发明的一种实施方式中，所述含有不同氮源的氮源培养基为：氮源1g、6g葡萄糖、10g无水k2hpo4、10g na2hpo4、0.25g mgso4·
7h2o、0.05g mnso4·
h2o，1g l-半胱氨酸盐酸盐，加水定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌20min；所述氮源为酵母浸粉fm818、酵母浸粉fm888、酵母提取物、l-脯氨酸、酵母蛋白胨或复合氮源；所述复合氮源为0.4g胰蛋白胨、0.4g牛肉膏、0.2g酵母粉。
[0044]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)的第1)步骤中，将待筛选的双歧杆菌菌株接种至液体mmrs培养基中，在厌氧37℃条件下进行培养2～3代，在8000rpm条件下离心2min并重悬菌体。
[0045]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)的第2)步骤中，所述进行培养的条件为：厌氧37℃培养24h；所述颜色变黄则认为达标，即进行培养后的溶液的ph值小于等于5.2则认为达标。
[0046]
在本发明的一种实施方式中，所述人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌包括但不限于长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、短双歧杆菌。
[0047]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)的第3)步骤中的若颜色变黄则认为达标，即进行培养后的溶液的ph值小于等于5.2则认为达标。
[0048]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)的第3)步骤中，将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到替换了不同碳源的mmrs液体培养基中，在37℃厌氧条件进行培养24h。
[0049]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)的第4)步骤中，将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到含有不同氮源的氮源培养基中，在37℃厌氧条件进行培养48h。
[0050]
在本发明的一种实施方式中，检测所述27个指标，将符合17个指标的菌株，判断为人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株。
[0051]
在本发明的一种实施方式中，所述筛选菌株的方法，还包括验证实验——人类粪便体外发酵实验。
[0052]
在本发明的一种实施方式中，所述验证方法为，收集7位健康志愿者粪便，配置gmm培养基进行24h体外发酵，若qrt-pcr绝对定量分析后经筛选的菌株在发酵24h后占据丰度优势，说明验证实验成功
[0053]
在本发明的一种实施方式中，所述验证实验方法为人粪便体外发酵实验：参考goodman等人的方法配置gmm培养基。将各菌株以接种量为109cfu/ml活菌量接入gmm培养基后，置于厌氧工作站中分别孵育0，24h，结束后取出置于冰上15min终止发酵，转移至-80℃保存备用。测试之前放于冰上解冻，样品经过10000g、4℃离心10min后，取沉淀使用粪便基因组dna提取试剂盒提取dna用于qrt-pcr绝对定量分析粪便中双歧杆菌种丰度的变化。
[0054]
有益效果
[0055]
本发明首次提出使用代时、od
600 nm
及细胞黏附方法的组合来精准筛选具有高丰度潜力的双歧杆菌株，初步证实长双歧杆菌占据丰度优势的机制为碳源谱、氮源谱广，代时短，生长量大，使得其能通过生长速度高于肠道洗脱速度来占据生长优势。并且，本发明还验证了基于双歧杆菌的优良生理特性为指标筛选出具有在肠道中占据双歧杆菌属内丰度优势的菌株的可行性，为双歧杆菌的筛选提供了一种精准有效的方法。具体地，通过双歧杆菌在10种碳源(菊粉，乳糖，d-半乳糖，蔗糖，葡萄糖，d-麦芽糖，d-木糖，低聚果糖，低聚半乳糖，海藻糖)、6种氮源(复合氮源、酵母浸粉fm818、酵母浸粉fm888、酵母提取物、l-脯氨酸、酵母蛋白胨)、2种黏附能力(单菌及竞争黏附能力)中的生理特性即可判断占据丰度优势的潜力，这些指标与宏基因组的数据已经进行了相关性关联，具有极强的正相关或负相关性。将筛选出的菌株进行人类粪便发酵的验证以及c57bl/6j小鼠粪便的反向验证，实验结果证实了符合筛选指标越多的菌株越能在粪便体系中保持丰度优势，从而佐证了这一筛选方法的可行性，具体如下：
[0056]
1、本发明设定了27项筛选指标，并规定实验菌株的达标数高于17项时认为其具有占据肠道高丰度的潜力。本发明从菌库的6种双歧杆菌中每种随机挑选了12株，共计72株双歧杆菌进行大范围的生理特性对比实验，将实验结果与宏基因组分析结果得到的丰度数据进行关联性分析，得到了相关性极强的27项筛选指标，以各项指标的中位数作为筛选标准，得到了27项筛选指标各自的达标范围。如表4所示，经过统计，长双歧杆菌的达标数为23.67
±
2.02，假小链双歧杆菌为20.75
±
4.86，短双歧杆菌为17.50
±
3.63，这3种双歧杆菌在宏基因组分析得到的丰度数据中，也显示出了高丰度的结果。而青春双歧杆菌达标数为11.25
±
2.67，动物双歧杆菌为7.75
±
1.71，两歧双歧杆菌为6.17
±
1.03，这3种双歧杆菌仅在个别年龄段或国家的人群中展现出高丰度。
[0057]
2、在27项筛选指标中，与碳源利用能力相关的指标占到了整体的74％，是非常重要的筛选指标。如表5所示，其中，长双歧杆菌、假小链和短双歧杆菌利用碳源的数目、代时、或是od
600 nm
值均与其他3种双歧杆菌显示出显著的区别(p＜0.05)。如在对8种碳源的利用能力实验中，长双歧杆菌利用碳源数为6.67
±
1.61，假小链为6.58
±
1.31，短双歧为6.17
±
0.72，而两歧双歧为3.83
±
1.03，动物双歧为3.00
±
1.35，青春双歧为1.00
±
1.04。这说明碳源利用能力在双歧杆菌属内是具有种间特异性的，它足以作为的筛选依据。
[0058]
3、筛选指标数目的总计或分项均体现了与丰度高低的正相关性。如长双歧杆菌的
达标总数为23.67
±
2.02，在验证实验中，其在模拟肠道环境中发酵24h后的增殖量为1.2
×
108cfu/ml，假小链双歧杆菌达标数为20.75
±
4.86，增殖量为4.01
×
107cfu/ml，短双歧杆菌达标数为17.50
±
3.63，增殖量为4.04
×
107cfu/ml。而动物双歧达标数为7.75
±
1.71，增殖量为2.23
×
107cfu/ml，两歧双歧达标数为6.17
±
1.03，增殖量为3.86
×
106cfu/ml。说明达标数目越多，其占据丰度优势的潜力越大。
[0059]
4、本发明从菌库中另外挑选了18株双歧杆菌作为本筛选方法的具体实施及验证，如表6及图6中的c所示，长双歧杆菌达标数为24.67
±
1.53，增殖量为8.21
×
107cfu/ml，假小链双歧杆菌达标数为18.67
±
0.58，增殖量为2.23
×
107cfu/ml，短双歧杆菌达标数为17.33
±
2.08，增殖量为3.61
×
107cfu/ml。而青春双歧达标数为1300
±
1.00，增殖量为1.84
×
107cfu/ml，两歧双歧达标数为5.67
±
1.15，动物双歧达标数为8.00
±
3.61，增殖量为7.21
×
106cfu/ml，两歧双歧达标数为5.67
±
1.15，增殖量为3.53
×
106cfu/ml。实验结果符合趋势，说明了本筛选方法的可行性。
[0060]
5、本发明的筛选方法与其他公开的筛选方法相比，具有更精准有效的筛选占据丰度优势潜力菌株的效果，以长双歧杆菌丰度为例，本筛选方法相比其他筛选方法将增殖量提高了57.89％。按照其他筛选方法对相同的72株双歧杆菌进行筛选，选取在2小时内在ph＝2.5环境下存活良好，在0.3％胆盐存在的条件下存活良好的双歧杆菌进行后续实验。根据其他筛选方法，将72株菌的耐酸耐胆盐能力的平均值、黏附能力进行排序，并从各种双歧杆菌中各挑选3株性能优良的双歧杆菌与本实验筛选出的优良菌株在相同条件下进行体外发酵实验。结果显示，本方法筛选出的长双歧杆菌增殖量为1.2
×
108cfu/ml，而其他方法筛选出的长双歧杆菌的增殖量为7.6
×
107cfu/ml；本方法筛选出的短双歧杆菌增殖量为4.04
×
107cfu/ml，而其他方法筛选出的短双歧杆菌的增殖量为2.31
×
107cfu/ml；本方法筛选出的青春双歧杆菌增殖量为1.16
×
107cfu/ml，而其他方法筛选出的青春双歧杆菌的增殖量为7.84
×
106cfu/ml；本方法筛选出的假小链双歧杆菌增殖量为4.01
×
107cfu/ml，而其他方法筛选出的假小链双歧杆菌并不增殖；本方法筛选出的动物双歧杆菌增殖量为3.86
×
106cfu/ml，而其他方法筛选出的动物双歧杆菌增殖量为1.58
×
106cfu/ml。可知本筛选方法得到的高丰度潜力菌株增殖远高于其他筛选方法的增殖。综上所述，该筛选方法能够快速且精准的筛选出具有高丰度潜力的双歧杆菌菌株。
[0061]
6、本发明确定了d-木糖和低聚果糖作为筛选的重要指标并对d-木糖进行了验证。d-木糖可以特异性的区分双歧杆菌的不同种，实验发现，两歧双歧和短双歧均不能利用d-木糖，而长双歧杆菌表现出了对d-木糖优秀的利用能力，比如长双歧杆菌在d-木糖培养基中的平均代时为146.16min，动物双歧、假小链、青春双歧分别为714.26min，320.90min，485.44min；长双歧杆菌在d-木糖培养基中的平均od
600 nm
为0.81，动物双歧、假小链、青春双歧分别为0.19，0.33，0.17。将d-木糖作为体外发酵培养基的唯一碳源进行实验，结果显示，长双歧杆菌增殖达1.08
×
108cfu/ml，假小链和青春双歧分别为5.41
×
106cfu/ml和9.06
×
106cfu/ml，动物双歧、短双歧和两歧双歧不增殖。
[0062]
7、本发明将小鼠粪便中丰度较高的双歧杆菌分离出来并按照27项筛选指标进行了生理特性的检测，结果如表7显示，在小鼠肠道中占据了88.89％的假长双歧杆菌的总达标数为18项，并且在总计或是代时、od
600 nm
值的符合指标数都高于其他3种双歧杆菌(假小链双歧杆菌达标13项、短双歧杆菌达标13项、两歧双歧杆菌达标6项，总体丰度仅占
11.11％)。进一步验证了筛选指标的可行性。
[0063]
8、本发明可以对未来益生菌菌株筛选的开发提供新的方案及思路，可以为相关功能性食品或药品的开发提供研究基础，使肠道菌群结构的研究得到丰富与拓展。本发明提供了一种新型的筛选具有高丰度潜力的双歧杆菌菌株的方法。
附图说明
[0064]
图1为不同国家、不同年龄段健康人群的宏基因组分析；其中，a为放线菌门内各属丰度分布，b为双歧杆菌属内各种丰度分布平均图，c为双歧杆菌属内各种丰度分布的个体情况。
[0065]
图2为6种双歧杆菌在不同碳源培养基中的代时及od
600 nm
值比较。
[0066]
图3为6种双歧杆菌在不同氮源培养基中的od
600 nm
值比较。
[0067]
图4为6种双歧杆菌对肠道上皮细胞的黏附能力；其中，a为单菌对ht-29的黏附，b为多菌对ht-29的竞争黏附能力，c为多菌黏附ht-29细胞中各菌种所占比例饼图。
[0068]
图5为双歧杆菌生理特性指标与宏基因组所得丰度的相关性热图。
[0069]
图6为双歧杆菌接入体外发酵培养基中发酵24h后各双歧杆菌的增殖。其中，a为双歧杆菌接入正常体外发酵培养基中发酵24h后各双歧杆菌的增殖量；b为双歧杆菌接入以d-木糖为唯一碳源的体外发酵培养基中发酵24h后各双歧杆菌的增殖量；c为18株双歧杆菌接入正常体外发酵培养基中发酵24h后各双歧杆菌的增殖量。
[0070]
图7为c57bl/6j和balb/c小鼠体内双歧杆菌的丰度。其中，a为c57bl/6j属水平堆积图；b为两种小鼠体内双歧杆菌属相对丰度；c为balb/c小鼠双歧杆菌丰度；(d)c57bl/6j体内双歧杆菌丰度。
[0071]
图8为从c57bl/6j小鼠体内分离出的双歧杆菌在不同碳源培养基中的代时及od
600 nm
值。其中，a为代时，b为od
600 nm
。
[0072]
图9为从c57bl/6j小鼠体内分离出的双歧杆菌在不同氮源培养基中的od
600 nm
值。
[0073]
图10为用其他方法筛选出的双歧杆菌的耐酸耐胆盐能力比较。
[0074]
图11为用本筛选方法及其他筛选方法筛选出的双歧杆菌接入正常体外发酵培养基发酵24h后各双歧杆菌的增殖。
[0075]
备注：实验数据均以“平均值
±
标准差”(mean
±
sd)表示，两组之间的差异用非配对t检验方法进行统计学分析，两组以上差异用one-way anova单因素方差分析法进行统计学分析，p《0.05表示具有显著性差异，字母a-d表示显著性。
具体实施方式
[0076]
下述实施例中所涉及的90株双歧杆菌，分别为长双歧杆菌长亚种15株(fhubzx30m2、fgdlz8m1、fgdlz78m2、fsccd3m1、fjsnt54m6、fgdlz72m1、fgdlz73m1、fjswxj3m1、fjsnt40m12、fjswxj18m1、fsccd5m1、fgdlz19m5、fjsnt39m10、fgdlz4m1和fjswxj5m1)、动物双歧杆菌乳亚种15株(fxjsw62_t82、jswx39m2_t79、sdjn2m
②
1032、jswx25m8、zjtz1m2_t80、fhnzz11l4_t77、zjhzd20m6_t76、fsdhzd8m6_t72、ffjndd7m3_t73、hunan2016_222、shxxa4m1_t78、fbjhd4m6_t74、ahwh4m1、hunan2016_mrs176_t70、hunan2016 222)、短双歧杆菌15株(fjnd2m11、jswx39m4、fhnfq4m7、fhnxy47m8、cj951、hen_
jz_9m1、hunan_2016_49_7、fhnxy43m2、fzjhz13_m2、ffjnd14l2、cj653、cj1041、fhnfq22m5、fhnfq49m1b、fhnxy48m6)、青春双歧杆菌15株(fhnxy34m5、m1、nc31、fcj25-9、ny15、hunan2016_112、fxjws49m24、fxjcj15m4、fxjcj13m2、fhnfq41m3、fhnfq21m2和fgsyc30m5、z25，fxjws23m27，fsdjn12w5)、两歧双歧杆菌15株(fjswx25m1、fxjcj353、fxjcj279、fjswx20m6、m2-03f02632、m129r01m5、fahwh24m3、fhnfq21m6、fjswx4m1、fjsnt162、fjswx19m5、fjswx39m3、jswx232、jswx267、jswx25m8)、假小链双歧杆菌15株(fhnba14m1、fxjws49m35、fjsnt36m3、fgsyc12m4、fxjws49m33、fgz16i1m1、fgz16i1m3、fahbz2m3、ffjnd17m1、fjsnt37m5、a14、fxjws49m21、fxjws49m7、fgz16i2m4、fgz16i2m6)；1株参比菌株：鼠李糖乳杆菌lactobacillus rhamnosus gg(lgg)。
[0077]
上述菌株均用30％(vol/vol)甘油以液体培养物状态保藏于江南大学食品微生物菌种保藏中心。
[0078]
下述实施例中所涉及的培养基如下：
[0079]
双歧杆菌使用mmrs液体培养基：其配方为(1l)：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、20g葡萄糖、5g乙酸钠、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸二铵、0.1g七水硫酸镁、0.05g一水硫酸锰、1g半胱氨酸盐酸盐，加入蒸馏水至1000ml；ph：6.2～6.4；115℃灭菌20min。
[0080]
鼠李糖乳杆菌使用mrs液体培养基：其配方为(1l)：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、20g葡萄糖、5g乙酸钠、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸二铵、0.1g七水硫酸镁、0.05g一水硫酸锰，加入蒸馏水至1000ml；115℃灭菌20min。
[0081]
mmrs、mrs固体培养基：配方与上述液体培养基一致，在加入蒸馏水定容后，再加入1.8％琼脂，115℃灭菌20min。
[0082]
不同碳源培养基：配置不含葡萄糖的de man,rogosa,sharpe(mmrs)液体培养基。将菊粉，乳糖，d-半乳糖，蔗糖，葡萄糖，d-麦芽糖，d-木糖，低聚果糖，低聚半乳糖，海藻糖制成浓度为1g/10ml的糖液经滤膜过滤后加入上述无糖mmrs中，使糖终浓度为1％(wt/vol)。
[0083]
不同氮源培养基：氮源1g(酵母浸粉fm818、酵母浸粉fm888、酵母提取物、l-脯氨酸、酵母蛋白胨)、6g葡萄糖、10g无水k2hpo4、10g na2hpo4、0.25g mgso4·7h2o、0.05g mnso4·
h2o，1g l-半胱氨酸盐酸盐，对照组氮源为0.4g胰蛋白胨、0.4g牛肉膏、0.2g酵母粉，加水定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌20min。
[0084]
人类粪便体外发酵gmm培养基：胰蛋白胨，0.2％；酵母提取物，0.1％；l-半胱氨酸，3.2mm；葡萄糖，2.2mm；纤维二糖，2.9mm；麦芽糖，2.8mm；果糖，2.2mm；牛肉膏，0.5％；磷酸二氢钾，100mm；七水硫酸镁，0.008mm；碳酸氢钠，4.8mm；氯化钠，1.37mm；氯化钙，0.8％；维生素k，5.8mm；硫酸亚铁，1.44mm；血红素组氨酸溶液，0.1％；吐温80，0.05％；维生素mix，1％；微量元素mix，1％；乙酸，30mm；异戊酸，1mm；丙酸，8mm；丁酸，4mm；刃天青，4mm；琼脂，1.2％；
[0085]
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
[0086]
代时的实验方法：将活化后的实验菌株od
600nm
值调到0.1左右(以培养基作为空白)，按1％接种量接种到96孔板中，每个菌株做三个平行，将96孔板置于37℃厌氧培养箱的酶标仪内，每隔30min测定od
600nm
值并记录，24h后停止实验。以菌株生长时间为横坐标，od
600nm
值为纵坐标绘制菌株生长曲线，取指数生长期的数据，以菌株生长时间为横坐标，以log(od
600nm
,2)为纵坐标，绘制曲线，根据曲线拟合度r2(》0.98)、线性公式，计算代时，线性
斜率倒数即为代时，计算公式为：log2a
t
＝log2a0+t/g。其中g表示双歧杆菌的生长代时，a0表示进入对数生长期时菌株的初始吸光度，a
t
表示t时刻双歧杆菌吸光度。
[0087]
od
600nm
值的测定：菌株活化后，取1ml菌液，8000rpm离心5min收集菌体，无菌生理盐水重悬制得菌液。以1％的接种量将菌液接种至不同碳(氮)源培养基中，置于37℃厌氧工作站中培养48h后取出，利用酶标仪测定od
600nm
值。以葡萄糖和无糖的mmrs培养基(对照组氮源和无氮源培养基)分别作为阳性与阴性对照。
[0088]
碳源谱的实验方法：在不同碳源培养基中加入溴甲酚紫溶液，将菌液按接种量1％加入96孔板中，培养24h，每隔2h观察记录一次颜色变化，若颜色由紫变黄，则说明该菌株可以利用该碳源进行代谢。
[0089]
肠道上皮细胞的单菌黏附能力实验方法：ht-29细胞在dmem完全培养基中生长良好，直至铺满12孔板皿底后开始黏附实验。向12孔板中添加实验菌株之前，用无菌pbs缓冲液洗涤12孔板单层ht-29细胞两次，再向每孔加入1ml浓度为108cfu/ml的细菌；将12孔板转移至5％co2培养箱中，37℃培养4h后；用pbs溶液洗涤12孔板中每孔的单层细胞层3次以上，以洗脱没有黏附的细菌和代谢分泌物；然后向每孔中加入250μl 0.25％胰蛋白酶-edta孵育10min；再加入250μl血清终止消化；将细胞吹打下来，收集每个孔内溶液10，000g离心10min重悬，使用多功能酶标仪测定荧光强度。黏附率(％)＝黏附后荧光强度/黏附前荧光强度
×
100。
[0090]
肠道上皮细胞的竞争黏附能力实验方法：使用实时定量聚合酶链反应(qrt-pcr)分析的绝对定量的方法检测多个菌株对ht-29细胞的竞争性黏附能力。向10cm培养皿中添加实验菌株之前，用无菌pbs缓冲液洗涤培养皿中的ht-29细胞两次，再向其中加入浓度为108cfu/ml的每种菌株各1ml；将培养皿转移至5％co2培养箱中，37℃培养4h后；用pbs溶液洗涤培养皿中的单层细胞层3次上，以洗脱没有黏附的细菌和代谢分泌物；然后向皿中加入1ml 0.25％胰蛋白酶-edta孵育10min；再加入4ml血清终止消化；将细胞吹打下来，收集皿中溶液10，000g离心10min重悬。提取样品中的总dna：使用细菌基因组dna提取试剂盒提取菌液中的dna，用超微量分光光度计测定dna的浓度(最好在1.7-2.0之间)，并且储存于-20℃备用。标准曲线构建——用标准株构建标准曲线：将每株双歧杆菌标准菌株用液体培养基培养至第三代18h的菌液离心收集后，用生理盐水进行10倍浓度梯度稀释，使用试剂盒提取每个梯度菌株的基因组dna。测定不同浓度的标准株的dna浓度(稀释6个梯度)用于构建标准曲线。采用mmrs平板涂布的方法分别对每株目标菌株培养18h后的菌液(初始梯度，100稀释)进行计数。设置阴性对照，使用水代替菌株基因组dna，提取不同长双歧杆菌菌株混和物的dna(各菌株数量通过平板计数获得)和实验动物粪便(无目标菌株)的dna作为模板优化pcr条件，使得pcr测定得到的目标菌株含量与平板计数得到的菌株含量一致。qpcr反应体系与扩增程简述如下：20μl体系，2
×
supermix(bio-rad)10μl，dna模板2μl，上下游引物各2μl，ddh2o(pcr级水)4μl。扩增程序为：95℃，2min；95℃、5s，65℃、30s；建立融解曲线：65℃到95℃以0.5℃增量且2-5s/步，进行30个循环，95℃聚合酶激活和dna变性5min。得到cq值。根据计数结果、稀释倍数、cq值就可以绘制出lg(cfu)-cq值标准曲线。将粪便原始dna进行qpcr实验得到的cq值代入标曲即可得到粪便中所求菌种的cfu数量，所涉及的引物如表3所示。
[0091]
表3双歧杆菌种特异性引物
[0092][0093]
小鼠粪便中双歧杆菌的分离：配制mmrs固体培养基时，添加1.8％琼脂，并在倒平板前，分别按1
‰
、0.5
‰
培养基的体积加入无菌的莫匹罗星和无菌的制霉菌素，即终浓度分别为100μg/ml莫匹罗星、25u/ml制霉菌素。将小鼠粪便样品经过生理盐水进行梯度稀释以后，选择合适浓度的稀释液各1ml于mmrs固体培养基平皿中，涂布均匀，每个梯度1个平皿，置于厌氧工作站中37℃倒置培养48h。从划线纯化的平板上分别挑取一个单菌落接种至相应的10ml液体培养基中，培养24～48h，鉴定为所需菌种后加入30％甘油于-80℃保藏备用。
[0094]
人粪便体外发酵实验：收集7位健康志愿者粪便制成菌悬液并与配置好的gmm培养基进行混和制得体外发酵培养基。将各菌株以接种量为109cfu/ml活菌量接入gmm培养基后，置于厌氧工作站中分别孵育0，24h，结束后取出置于冰上15min终止发酵，转移至-80℃保存备用。测试之前放于冰上解冻，发酵体系的ph值用标准ph计进行测量，其余样品经过10000g、4℃离心10min后，取沉淀，使用粪便基因组dna提取试剂盒提取dna用于qrt-pcr绝对定量分析粪便中双歧杆菌种的丰度变化。
[0095]
实施例1：具有高丰度潜力双歧杆菌菌株的筛选指标的确定
[0096]
1、双歧杆菌种类的选择
[0097]
对来自美国健康成年人(样本数：23，年龄18-40岁，分组名：am)、美国健康青少年(样本数：37，年龄7-14岁，分组名：ac)、奥地利健康老年人(样本数：49，年龄60-80岁，分组名：eo)、中国健康成年人(样本数：113，年龄18-40岁，分组名：cm)的宏基因组数据进行分析，结果如图1所示。图1中的a说明双歧杆菌属在上述任何国家或年龄段的人群中，其在放线菌门内的丰度占比最高。图1中的b和c分别展示了上述4组人群中双歧杆菌属内丰度分布的平均情况和个体情况。
[0098]
结果显示，长双歧杆菌(bifidobacterium longum)在4组人群肠道中占比都最高(属内平均相对丰度为45.63％)，其次为青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)、假小链双歧杆菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)、动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)和短双歧杆菌(bifidobacterium breve)等，属内平均相对丰度分别为14.72％、12.65％、11.29％、5.14％和3.45％。
[0099]
确定实验用双歧杆菌菌种为上述6种菌。
[0100]
2、实验用菌悬液的制备：
[0101]
本研究共选用72株双歧杆菌，分别为长双歧杆菌长亚种12株、动物双歧杆菌乳亚种12株、短双歧杆菌12株、青春双歧杆菌12株、两歧双歧杆菌12株、假小链双歧杆菌12株，以及一株参比菌株鼠李糖乳杆菌lgg。
[0102]
分别将上述冷藏于-80℃的双歧杆菌保菌管取出，待其融化后，用接种环蘸取少量菌液于mmrs固体培养基上划线，于厌氧工作站中37℃恒温培养48h。
[0103]
将冷藏于-80℃的lgg保菌管取出，待其融化后，用接种环蘸取少量菌液于mrs固体培养基上划线，置于37℃有氧环境培养24h。
[0104]
待其长出菌落后，挑取单菌落接种于5ml mmrs液体管中，厌氧培养18～24h，按上述操作重复2～3次得到活化的菌液。
[0105]
菌株培养后，取1ml菌液，8000rpm离心5min收集菌体，无菌生理盐水重悬，调整od 600nm
至0.8左右。
[0106]
3、双歧杆菌的碳源利用表型：
[0107]
(1)双歧杆菌碳源谱的确定
[0108]
分别将上述72株菌的菌悬液接入96孔板(含有不同的替换了碳源的mmrs液体培养基)中进行碳源谱实验，在17种碳源(菊粉，乳糖，d-半乳糖，蔗糖，葡萄糖，d-麦芽糖，d-木糖，低聚果糖，低聚半乳糖，甘露糖，海藻糖，d-果糖，d-阿拉伯糖，纤维二糖，甘露醇，l-鼠李糖，可溶性淀粉)中，在厌氧37℃条件下，培养24h，每隔2h观察记录一次颜色变化，颜色变黄(ph值≤5.2)，则说明该菌株可以利用该碳源进行代谢。将每种双歧杆菌利用每种碳源的株数记录并换算成比例即为每种双歧杆菌对该碳源的利用比例。结果如表4所示。
[0109]
表4双歧杆菌对不同碳源的利用情况
[0110][0111]
注：每种双歧杆菌均选择了12株进行实验，实验结果为
“‑”
为所有菌株都不利用，“+”为50％以下菌株利用，“++”为50％-90％菌株利用，“+++”为90％以上菌株利用。
[0112]
结果显示，动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌分别利用8、9、10种碳源，而长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、短双歧杆菌分别能利用12、13、14种碳源。不同种之间利用碳源的广度具有差异性，因此碳源谱可以作为差异指标来进行筛选。
[0113]
(2)双歧杆菌在不同碳源培养基中的代时及od
600 nm
值
[0114]
通过(1)中的实验，确定大部分双歧杆菌均能利用的碳源种类，在该步骤中确定不同种的双歧杆菌对这些碳源的利用能力是否具有强弱的差异性。因此，选择大部分菌株都利用的10种碳源(葡萄糖、d-木糖、低聚果糖、蔗糖、低聚半乳糖、乳糖、d-半乳糖、d-麦芽糖、乳糖、菊粉)按照上述方法，进行代时及od
600 nm
的测定，探究是否对不同碳源的利用有强弱之分。
[0115]
按照上述步骤(1)的方法，分别将上述72株菌接入含有不同碳源培养基的96孔板中，分别测定72株双歧杆菌在不同种碳源培养基中的生长曲线并计算代时，以及od
600 nm
值；结果如图2所示。
[0116]
结果显示：六种双歧对l-鼠李糖均不利用；图2中的代时显示，在6种双歧杆菌中，长双歧杆菌在mmrs培养基中的平均代时为96.15min，要显著低于其他4种双歧杆菌(青春双歧除外)，与参比菌lgg不具有显著差异(p《0.05)。
[0117]
在以其他8种碳源为唯一碳源的培养基中，双歧杆菌属内有以下差异：长双歧在低聚半乳糖、菊粉、d-半乳糖、乳糖中与其他5种双歧杆菌以及参比菌lgg不具备显著差异；在低聚果糖中，代时显著优于两歧双歧和假小链双歧杆菌(长双歧代时为76.34min，假小链代时为149.25min)；在木糖中，代时显著优于动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌和短双歧杆菌(长双歧代时为146.16min，动物双歧杆菌、假小链杆菌、青春双歧杆菌分别为714.26min，320.90min，485.44min)；在麦芽糖和蔗糖中，代时显著优于两歧双歧杆菌(p《0.05)，长双歧杆菌在这两种碳源培养基中代时分别为123.46min、169.49min，两歧双歧杆菌为416.67、0min。
[0118]
图3中的od
600 nm
值显示，长双歧杆菌在低聚半乳糖、低聚果糖、木糖、菊粉、麦芽糖、蔗糖、乳糖培养基中的od
600 nm
值显著高于参比菌lgg(p《0.05)。在6种双歧杆菌中，长双歧杆菌(od
600 nm
＝0.82)在mmrs培养基中的od
600 nm
值要显著高于两歧双歧杆菌(od
600nm
＝0.47，p《0.05)。在以其他8种碳源为唯一碳源的培养基中，双歧杆菌属内有以下差异：长双歧杆菌在低聚半乳糖(od
600 nm
＝1.20)、低聚果糖(od
600 nm
＝1.10)和d-半乳糖(od
600 nm
＝0.68)中，od值显著高于动物双歧杆菌(od
600 nm
＝0.62、拟杆.18、0.16)和两歧双歧杆菌(od
600nm
＝0.42、0.11、0.22)；长双歧杆菌在麦芽糖(od
600 nm
＝1.21)和蔗糖(od
600 nm
＝0.95)中，od
600 nm
显著高于两歧双歧杆菌(od
600 nm
＝0.18、0.06)；长双歧杆菌在菊粉中的od
600 nm
值(od
600 nm
＝0.84)显著高于动物双歧杆菌(od
600 nm
＝0.39)、两歧双歧杆菌(od
600 nm
＝0.16)和短双歧杆菌(od
600 nm
＝0.62)；在乳糖中，双歧杆菌属内没有显著差异；而长双歧杆菌在木糖中的od
600 nm
值(od
600 nm
＝0.81)显著高于其他5种双歧杆菌(p《0.05)。
[0119]
结果显示，不同种双歧杆菌在对低聚半乳糖、低聚果糖、d-半乳糖、木糖、麦芽糖、蔗糖和菊粉等7种碳源的利用能力，即在不同碳源培养基中的生长速率或生长量上展现出了显著差异，其中，长双歧杆菌展现出了优良的生理特性。不同种之间利用碳源的强弱具有差异性，因此碳源利用能力可以作为差异指标来进行筛选。
[0120]
4、双歧杆菌的氮源利用表型：
[0121]
(1)双歧杆菌氮源谱
[0122]
分别将上述72株菌的菌悬液接入24深孔板中进行氮源利用实验，在含有不同氮源的氮源培养基中，分别在37℃厌氧条件下，培养48h，记录48h后的od
600 nm
值。结果如图3所示。
[0123]
含有不同氮源的氮源培养基为：氮源1g、6g葡萄糖、10g无水k2hpo4、10g na2hpo4、0.25g mgso4·
7h2o、0.05g mnso4·
h2o，1g l-半胱氨酸盐酸盐，加水定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌20min；所述氮源为：酵母浸粉fm818、酵母浸粉fm888、酵母提取物、大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、l-脯氨酸、酵母蛋白胨或复合氮源，所述复合氮源为0.4g胰蛋白胨、0.4g牛肉膏、0.2g酵母粉。
[0124]
结果显示：在对照(复合氮源)培养基中，长双歧杆菌的od
600 nm
值(od
600 nm
＝0.30)显著高于两歧双歧杆菌(od
600 nm
＝0.09)，与参比菌lgg无显著差异。在其他8种氮源培养基中，双歧杆菌属内差异如下：长双歧杆菌的od
600 nm
值在酵母浸粉fm818(od
600 nm
＝0.44)、fm888(od
600 nm
＝0.42)、鱼粉蛋白胨(od
600 nm
＝0.16)、大豆蛋白胨(od
600 nm
＝0.22)、酵母提取物(od
600 nm
＝0.43)中显著高于两歧双歧杆菌(od
600 nm
＝0.15、0.12、0.06、0.06、0.13)，与参比菌lgg无显著差异；长双歧杆菌在胰蛋白胨(od
600 nm
＝0.12)和酵母蛋白胨(od
600 nm
＝0.43)中的od
600 nm
值显著高于两歧双歧(od
600 nm
＝0.05、0.04)和假小链双歧杆菌(od
600 nm
＝0.09、0.27)。
[0125]
结果可知，双歧杆菌不同种之间对于氮源的利用具有偏好性，因此氮源利用能力可以作为差异指标来进行筛选。
[0126]
5、双歧杆菌对肠道上皮细胞的黏附能力
[0127]
(1)单个菌株对ht-29细胞的黏附能力
[0128]
单菌黏附实验：采用荧光染色法检测单株双歧杆菌对肠道上皮细胞ht-29的黏附能力；结果如图4中的a所示。
[0129]
结果显示，长双歧杆菌的单株黏附能力(0.07％)不如其他双歧杆菌，仅略强于假小链双歧杆菌(0.04％)，参比菌lgg黏附能力较强(1.64％)。单菌实验结果如图4所示，可看出黏附能力较强的为两歧双歧杆菌(0.44％)、青春双歧杆菌(0.92％)、动物双歧杆菌(0.57％)等。但是不同种双歧杆菌的黏附能力同样展现出了种间的显著差异性，因此单株菌的黏附能力可以作为差异指标来进行筛选。
[0130]
(2)多个菌株对ht-29细胞的竞争性黏附
[0131]
多个菌株对ht-29细胞的竞争性黏附：采用qrt-pcr绝对定量法检测多种双歧杆菌对肠道上皮细胞ht-29的竞争黏附能力，得到每种双歧杆菌的黏附数据，结果如图4中的b所示。
[0132]
图4中的b和c为qpcr进行绝对定量得到的六种双歧杆菌在同一环境中对ht-29细胞的竞争黏附能力可知，长双歧杆菌的竞争黏附能力不如其他几种双歧杆菌。qpcr进行绝对定量得到的六种双歧杆菌在同一环境中对ht-29细胞的黏附能力可知，长双歧杆菌的竞争黏附能力(3.50
×
104cfu/ml)不如其他几种双歧杆菌(动物双歧2.72
×
106cfu/ml，短双歧1.17
×
106cfu/ml，青春双歧4.2
×
105cfu/ml，两歧双歧4.4
×
105cfu/ml，)。
[0133]
单菌及混菌实验均说明长双歧杆菌在属内占据优势的原因可能不在于具有良好
的黏附能力。但是不同种双歧杆菌的竞争黏附能力展现出了种间差异性，因此竞争黏附能力可以作为差异指标来进行筛选。
[0134]
6、双歧杆菌的生理特性指标与丰度的相关性分析
[0135]
将实验中涉及的6种双歧杆菌共计72株的生理特性指标(包括对于碳源、氮源的od
600 nm
值、代时、碳源利用能力、对肠道上皮细胞的单菌黏附及竞争黏附能力等)与宏基因组分析中的欧洲、美洲、亚洲人群双歧杆菌丰度进行spearman相关性分析，初步确定与双歧杆菌丰度呈显著相关的是哪些指标，并进行实验验证。实验结果如图5所示。
[0136]
结果显示：
[0137]
图5为双歧杆菌生理特性指标与其丰度的相关性热图，取各指标的中位数与丰度进行spearman相关性分析，cm、am、ac、eo分别为中国成年人、美国成年人、美国青少年、欧洲老年人分组，hz为前四组汇总的中位数数据。以hz组来看，双歧杆菌在不同国家人群中的丰度与其对于不同碳氮源利用的od
600 nm
值(如：蔗糖、木糖、菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖、乳糖、葡萄糖、d-半乳糖、对照氮源、l-脯氨酸、酵母提取物、酵母蛋白胨、酵母浸粉fm818\fm888)呈极显著正相关(p＜0.01)；与其对于在不同培养基中的代时(如：碳源为菊粉、葡萄糖、木糖、低聚果糖等)呈极显著负相关(p＜0.01)；与碳源谱(同种12株双歧能否利用的比例)木糖、d-麦芽糖、蔗糖、低聚半乳糖、d-半乳糖、低聚果糖、海藻糖等呈显著正相关(p＜0.01)；与其对于肠道上皮细胞的单菌黏附及竞争黏附能力呈极显著负相关(p＜0.0001)。而在这些46项生理指标中，od
600 nm
值相关的有17项(碳源相关9项，氮源相关8项)，碳源谱有11项，代时相关有8项。
[0138]
综上所述，双歧杆菌生理特性指标中的碳源利用表型(葡萄糖、菊粉、低聚半乳糖、d-半乳糖、乳糖、木糖和低聚果糖)与其丰度有显著的相关性，特别是木糖、低聚果糖两种，在碳源谱、代时、od
600 nm
值三项指标中均有显著相关性。
[0139]
综上所述：具有占据丰度优势的双歧杆菌的筛选指标共27项如下所示：代时4项(d-木糖、低聚果糖、葡萄糖和菊粉)，od
600 nm
值13项(d-木糖、低聚果糖、葡萄糖、菊粉、蔗糖、低聚半乳糖、乳糖、d-半乳糖、对照氮源、酵母浸粉fm818/fm888、酵母蛋白胨和酵母提取物)，碳源利用能力共8项(d-木糖、低聚果糖、蔗糖、低聚半乳糖、乳糖、d-半乳糖、d-麦芽糖和海藻糖)，黏附能力2项(单株和竞争黏附能力)。
[0140]
7、符合指标数目的确定
[0141]
目的：我们已经确定了27项筛选指标作为筛选具有丰度优势潜力的菌株的标准，那么当各项指标达到哪些阈值时我们认为是达标的，这需要进一步的确定和验证。
[0142]
将72株菌各项指标的中位数进行统计并作为划分达标与否的界限，我们得到了表1～2作为筛选标准。按照表1～2所列项目统计72株菌的达标情况。
[0143]
结果显示：
[0144]
筛选内容如表1～2所示，筛选指标共计27项，经筛选后6种双歧杆菌(每种12株，共计72株)达标情况如表5所示。
[0145]
表5双歧杆菌符合指标数
[0146]
[0147][0148]
注：不同字母(a
–
d)表示不同组之间存在显着差异，p＜0.05。
[0149]
可知，长双歧、假小链和短双歧的达标数显著高于其他3种双歧杆菌(p＜0.05)，它们在中国人肠道中的丰度(图1中的b)也占到了整个双歧杆菌属的70％以上。并且符合指标数越高的，宏基因组分析结果展示出的丰度也越高。这显示了表1～2作为筛选表格的可行性。
[0150]
8、人粪便体外发酵验证实验
[0151]
在6种双歧杆菌中经筛选得到各项指标较优的每种双歧杆菌各3株进行验证实验。按照上述方法制备人类粪便发酵培养基，将活菌体浓度为109cfu/ml的每种双歧杆菌分别接入体外发酵培养基中发酵24h后，提取粪便基因组并进行双歧杆菌的绝对定量实验，观察每种双歧杆菌在人类体外发酵培养基中的增殖情况。
[0152]
结果显示：
[0153]
在6种双歧杆菌中经筛选得到各项指标较优的每种双歧杆菌各3株进行了验证实验。如图6中的a所示，长双歧杆菌增殖达1.2
×
108cfu/ml，短双歧和假小链双歧分别达到4.04
×
107cfu/ml和4.01
×
107cfu/ml，动物双歧和青春双歧分别达到2.23
×
107cfu/ml和1.16
×
107cfu/ml，两歧双歧杆菌增殖量仅为3.86
×
106cfu/ml。实验证明，符合指标越多，其占据高丰度的潜力越大。通过实验结果，我们可以认为符合17项指标以上的菌株为具有占据分丰度优势潜力的菌株。
[0154]
实施例2：具有高丰度潜力双歧杆菌菌株的筛选
[0155]
1、双歧杆菌的初步筛选
[0156]
(1)双歧杆菌菌悬液的制备
[0157]
从菌库中另外挑取长双歧杆菌(fjsnt39m10、fgdlz4m1和fjswxj5m1)、短双歧杆菌(fhnfq22m5、fhnfq49m1b、fhnxy48m6)、假小链杆菌(fxjws49m7、fgz16i2m4、fgz16i2m6)、两歧双歧杆菌(jswx232、jswx267、jswx25m8)、青春杆菌杆菌(z25，fxjws23m27，fsdjn12w5)和动物双歧杆菌(ahwh4m1、hunan2016_mrs176_t70、hunan2016 222)每种各3株；将18株双歧杆菌，在液体mmrs培养基中，于厌氧工作站中37℃恒温培养48h，待其长出菌落后，挑取单菌落接种于5ml mmrs液体管中，厌氧培养18～24h，按上述操作重复2～3次得到活化的菌液，菌株培养后，取1ml菌液，8000rpm离心5min收集菌体，无菌生理盐水重悬，调整od
600nm
至0.8左右；
[0158]
(2)配制加入了溴甲酚紫的无糖mmrs培养基，将d-木糖、低聚果糖的糖液按浓度为1g/10ml的比例经过滤分别加入无糖mmrs培养基中，使得糖终浓度为1％(wt/vol)，使用排枪将含不同碳水化合物的培养基加入到96孔板内，每孔200μl；将得到的双歧杆菌菌悬液以
2％(v/v)接种量接种到96孔板内，设置阴性对照组，培养24h，每隔2h观察记录一次颜色变化，颜色变黄(ph值≤5.2)的菌株进入下一轮实验；
[0159]
将碳源替换为d-木糖的加有溴甲酚紫酸碱指示剂的液体mmrs培养基中，进行培养后，观察颜色变化，若颜色变黄则认为达标，为指标1；
[0160]
将碳源替换为低聚果糖的加有溴甲酚紫酸碱指示剂的液体mmrs培养基中，进行培养后，观察颜色变化，若颜色变黄则认为达标，为指标2。
[0161]
2、双歧杆菌的复筛
[0162]
(1)单菌黏附实验：将步骤1初筛后得到的双歧杆菌采用荧光染色法检测单株双歧杆菌对肠道上皮细胞ht-29的黏附能力；单黏附能力≤0.27达标；为指标3；
[0163]
(2)多个菌株对ht-29细胞的竞争性黏附：
[0164]
将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌采用qrt-pcr绝对定量法检测多种双歧杆菌对肠道上皮细胞ht-29的竞争黏附能力；单菌及竞争黏附能力与丰度呈显著负相关，双歧杆菌菌株符合的指标越多说明具备高丰度潜力的可能性越大；竞争黏附能力≤4.3
×
105达标；为指标4；
[0165]
(3)将步骤1初筛后得到的双歧杆菌分别接入到替换了不同碳源的mmrs液体培养基中，在37℃厌氧条件进行培养24h；具体为：
[0166]
1)配置不含葡萄糖的mmrs液体培养基，将d-木糖、低聚果糖、菊粉、乳糖、d-半乳糖、蔗糖、葡萄糖、d-麦芽糖、低聚半乳糖和海藻糖制成浓度为1g/10ml的糖液经滤膜过滤后加入上述无糖mmrs中，使糖终浓度为1％(wt/vol)。
[0167]
2)将上述步骤1中初筛后的双歧杆菌菌悬液以1％(v/v)接种量接入96孔板，每孔200μl，将经步骤1得到的筛选过的双歧杆菌菌悬液以od
600nm
值调到0.1左右(以培养基作为空白)，1％(v/v)接种量接种，将96孔板置于37℃厌氧培养箱的酶标仪内，设定参数：总时长24h，振动频率高频，每隔30min测定一次，绘制生长曲线，并计算代时和记录第24hod
600nm
值；分别检测：
[0168]
a、在碳源为d-木糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600nm
；代时为94～705min或第24h的od
600nm
≥0.19达标，为指标5和6；
[0169]
b、在碳源为低聚果糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600nm
；代时为68～139min或第24h的od
600nm
≥0.78达标，为指标7和8；
[0170]
c、在碳源为葡萄糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600nm
；代时为55～141min或第24h的od
600nm
≥0.83达标，为指标9和10；
[0171]
d、在碳源为菊粉的培养基中进行培养后，检测代时、od
600nm
；代时为75～152min或第24h的od
600nm
≥0.65达标，为指标11和12；
[0172]
e、在添加了溴甲酚紫的碳源为蔗糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标13；将变黄的菌株转移至蔗糖培养基中培养，检测od
600nm
；第24h的od
600nm
≥0.77达标，为指标14；
[0173]
f、在添加了溴甲酚紫的碳源为低聚半乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标15；将变黄的菌株转移至低聚半乳糖培养基中培养，检测od
600nm
；第24h的od
600nm
≥0.96达标，为指标16；
[0174]
g、在添加了溴甲酚紫的碳源为乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达
标，为指标17；将变黄的菌株转移至乳糖培养基中培养，检测od
600nm
；第24h的od
600nm
≥1.00达标，为指标18；
[0175]
h、在添加了溴甲酚紫的碳源为d-半乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标19；将变黄的菌株转移至d-半乳糖培养基中培养，检测od
600nm
；第24h的od
600nm
≥0.63达标，为指标20；
[0176]
i、在添加了溴甲酚紫的碳源为d-麦芽糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标21；
[0177]
j、在添加了溴甲酚紫的碳源为海藻糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标22；
[0178]
4)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到含有不同氮源的氮源培养基(同实施例1)中，在37℃厌氧条件进行培养48h；分别检测以下指标：
[0179]
k、在氮源为复合氮源的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
600nm
≥0.26达标，为指标23；所述复合氮源为胰蛋白胨、牛肉膏和酵母粉；
[0180]
l、在氮源为酵母浸粉fm818的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
600nm
≥0.34达标，为指标24；
[0181]
m、在氮源为酵母浸粉fm888的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
600nm
≥0.36达标，为指标25；
[0182]
n、在氮源为酵母蛋白胨的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
600nm
≥0.32达标，为指标26；
[0183]
o、在氮源为酵母提取物的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
600nm
≥0.36达标，为指标27。
[0184]
结果显示：
[0185]
筛选内容如表1～2所示，筛选指标共计27项，经筛选后6种双歧杆菌(每种各3株共计18株)达标情况如表6所示。
[0186]
表6双歧杆菌符合指标数
[0187][0188]
可见，长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、短双歧杆菌达标数均在17个以上。符合实施例1中的筛选标准。
[0189]
3、人粪便体外发酵验证实验
[0190]
(1)人类粪便体外发酵gmm培养基，即人类粪便发酵培养基的制备
[0191]
制备正常的以葡萄糖为碳源的gmm培养基，收集7位健康成年人的粪便制备成粪便悬液接入gmm培养中制备成人类粪便发酵培养基。
[0192]
(2)将上述实验中的每种双歧杆菌各3株进行验证实验。按照上述方法制备人类粪便发酵培养基，将活菌体浓度为109cfu/ml的每种双歧杆菌分别接入体外发酵培养基中发酵24h后，提取粪便基因组并进行双歧杆菌的绝对定量实验，观察每种双歧杆菌在人类体外发酵培养基中的增值情况。
[0193]
结果显示，在6种双歧杆菌中经筛选得到各项指标较优的每种双歧杆菌各3株进行了验证实验。如图6中的c所示，长双歧杆菌增值达8.21
×
107cfu/ml，短双歧杆菌和假小链双歧杆菌分别达到3.61
×
107cfu/ml和2.23
×
107cfu/ml，动物双歧杆菌和青春双歧杆菌分别达到7.21
×
106cfu/ml和1.84
×
107cfu/ml，两歧双歧杆菌增值量仅为3.53
×
106cfu/ml。
[0194]
实验证明，符合指标越多，其占据高丰度的潜力越大。
[0195]
实施例3：重要指标验证实验
[0196]
目的：确定实施例1中的重要筛选指标d-木糖是否使得不同种双歧杆菌在模拟肠道环境中展现出了不同差异(双歧杆菌在d-木糖培养基中的代时、od值、碳源利用比例均与其丰度呈现极强的正相关性，p＜0.0001)。
[0197]
1、筛选指标的验证实验
[0198]
(1)人类粪便体外发酵gmm培养基，即体外发酵培养基的制备
[0199]
制备gmm培养基，但用d-木糖替换其中的碳源，收集7位健康成年人的粪便制备成粪便悬液接入gmm培养中制备成体外发酵培养基；
[0200]
(2)将实施例1制备得到的活菌体浓度为109cfu/ml的每种双歧杆菌菌悬液，分别接入体外发酵培养基中发酵24h后，提取粪便基因组并进行双歧杆菌的绝对定量实验，观察每种双歧杆菌在人类体外发酵培养基中的增殖情况。结果如图6中的b所示。
[0201]
在对d-木糖这一重要指标的验证实验中，如图6中的b所示，长双歧杆菌增殖达1.08
×
108cfu/ml，假小链和青春双歧分别达到5.41
×
106cfu/ml和9.06
×
106cfu/ml，动物双歧、短双歧和两歧双歧不增殖。在这6种双歧杆菌在木糖培养基中的代时、od
600nm
值等生理特性实验中，长双歧杆菌的全部实验菌株(共12株)均达标，假小链双歧杆菌2株(共12株)达标，青春双歧杆菌3株(共12株)达标，短双歧杆菌、动物双歧杆菌和青春双歧杆菌各12株均不达标，与验证结果符合。
[0202]
2、验证实验——小鼠体内占据高丰度优势的双歧杆菌菌株的生理特性是否占优
[0203]
目的：探究表1～2的筛选方法是否适用于预测小鼠体内分离出的双歧杆菌的生理特性和丰度的关系
[0204]
(1)小鼠粪便中双歧杆菌的分离及属内丰度测定
[0205]
收集健康c57bl/6j和balb/c小鼠粪便，检测其中双歧杆菌的组成并分离双歧杆菌。据报道，balb/c小鼠本底的双歧杆菌很少甚至低于分子方法检测限，因此该种小鼠被广泛应用于各种双歧杆菌的定殖评价。结果如图7所示。
[0206]
结果显示：
[0207]
图7中的c可知，c57bl/6j小鼠体内99.52％为假长双歧杆菌，剩余0.47％双歧杆菌为动物双歧乳亚种、短双歧杆菌、青春双歧等，但相对丰度极低。balb/c小鼠的双歧杆菌属丰度(低于0.1％)远低于c57bl/6j体内的丰度(14.5％)，且在极低的丰度中也是假长双歧占高丰度(99.52％)，其次为长双歧杆菌(0.47％)。结果显示，分离出的双歧杆菌分别为：假长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌和假小链双歧杆菌。
[0208]
(2)小鼠粪便中双歧杆菌生理特性的测定
[0209]
将步骤(1)分离出的双歧杆菌按照上述实施例2的方法检测碳源、氮源等各项指标的符合情况。结果如图8～9所示。
[0210]
结果显示：图8中的a可知，从c57bl/6j小鼠体内分离出的假长双歧杆菌在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中代时(103.88min)显著高于分离出的两歧双歧杆菌(176.30min)、短双歧杆菌(186.61min)和假小链双歧杆菌(180.20min)；
[0211]
假长双歧杆菌在低聚半乳糖(149.48min)、d-半乳糖(326.21min)、乳糖(181.02min)、低聚果糖(86.46min)等碳源中也要显著优于其他某些分离出的双歧杆菌(p＜0.05)。
[0212]
从od
600nm
值看，假长双歧在以葡萄糖(od
600nm
＝1.25)、低聚半乳糖(od
600nm
＝1.23)、d-半乳糖(od
600nm
＝0.84)、乳糖(od
600nm
＝1.35)、木糖(od
600nm
＝0.33)、低聚果糖(od
600nm
＝1.00)等碳源中也显著高于其他某些分离出的双歧杆菌(p＜0.05)。
[0213]
4种双歧杆菌在氮源利用偏好上也具有较大差异。如图9所示，假长双歧杆菌能较好的利用6种氮源，其他3种双歧杆菌仅在酵母提取物的利用上强于假长双歧杆菌(od
600nm
＝0.33)。表7统计了从小鼠中分离出的4种双歧杆菌按照表1标准所得的符合指标数。
[0214]
表7从小鼠体内分离出的双歧杆菌符合指标数
[0215][0216]
结果显示，假长双歧杆菌的总达标数大于17项，符合丰度优势潜力菌株的标准，并且在总计或是代时、od
600nm
值的符合指标数都高于其他3种双歧杆菌，这与它们在小鼠体内的丰度高低趋势一致。即在c57bl/6j小鼠中，占据丰度优势的假长双歧杆菌在碳源、氮源利用方面的代时、od
600nm
值要显著优于其他丰度较低的双歧杆菌。
[0217]
因此，该验证实验显示，在小鼠体内占据高丰度的双歧杆菌菌株的生理特性同样占据优势。
[0218]
实施例4：本筛选方法与其他筛选方法比较
[0219]
1、其他筛选方法
[0220]
具体方法，参考记载于公开号为cn105112333a，名称为一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌及筛选方法和应用，实施例4中：
[0221]
用该方法重新对本实验中的72株双歧杆菌进行筛选，即进行耐酸、耐胆盐特性以及肠道上皮细胞黏附能力的检测。按照该专利公开的方法，以4％接种量分别将菌悬液接种到ph＝2或0.3％胆盐的mrs+1
‰
半胱氨酸的液体试管中，震荡均匀后将液体转移到96孔板中，每株菌3个平行，每隔两个小时用酶标仪测定其od
600nm
值，将实验组数据与对照组(ph＝7.0无胆盐)数据进行比较，数据相差越小说明耐受性能越好。选取在2小时内在ph＝2.5环境下存活良好，在0.3％胆盐存在的条件下存活良好的双歧杆菌进行后续实验。
[0222]
结果显示：
[0223]
根据其他筛选方法，将72株菌的耐酸耐胆盐能力的平均值、黏附能力进行排序，黏附能力如图4中的a所示。如图10为实验菌株的耐酸耐胆盐能力强弱情况。可见，参比菌lgg的耐酸耐胆盐能力很强(与对照组数据之差仅为0.10)，具有作为参比菌的资质，长双歧杆菌(与对照组数据之差为0.13)和两歧双歧杆菌(与对照组数据之差为0.11)的耐酸耐胆盐能力强于其他双歧杆菌菌种。将实验菌株的耐酸耐胆盐能力的平均值及黏附能力综合考量，选取在各项指标中表现较优的每种双歧杆菌各3株进行体外发酵实验。选取菌株分别为：长双歧杆菌(fhubzx30m2、fgdlz72m1、fjswxj3m1)、动物双歧杆菌(ffjndd7m3_t73、fxjsw62_t82、fsdhzd8m6_t72)、两歧双歧杆菌(fjswx4m1、fjswx20m6、fxjcj279)、短双歧杆菌(hen_jz_9m1、cj653、jswx39m4)、假小链双歧杆菌(fjswx49m21、fjswx49m35、fgz16i1m1)、青春双歧杆菌(m1、fhnxy34m5、fcj25-9)。
[0224]
2、将筛选得到的菌株按上述方法进行人粪便体外发酵实验，检测发酵24h后的增殖情况。结果如图11所示。结果表明，除了动物双歧杆菌外，使用本方法筛选出的其他5种双歧杆菌的增殖量均高于上述所列的其他筛选方法。
[0225]
结果显示：
[0226]
本方法筛选出的长双歧杆菌增殖量为1.2
×
108cfu/ml，而其他方法筛选出的长双歧杆菌的增殖量为7.6
×
107cfu/ml；本方法筛选出的短双歧杆菌增殖量为4.04
×
107cfu/ml，而其他方法筛选出的短双歧杆菌的增殖量为2.31
×
107cfu/ml；本方法筛选出的青春双歧杆菌增殖量为1.16
×
107cfu/ml，而其他方法筛选出的青春双歧杆菌的增殖量为7.84
×
106cfu/ml；本方法筛选出的假小链双歧杆菌增殖量为4.01
×
107cfu/ml，而其他方法筛选出的假小链双歧杆菌并不增殖；本方法筛选出的动物双歧杆菌增殖量为3.86
×
106cfu/ml，而其他方法筛选出的动物双歧杆菌增殖量为1.58
×
106cfu/ml。可知本筛选方法得到的高丰度潜力菌株增殖远高于其他筛选方法的增殖。综上所述，该筛选方法能够快速且精准的筛选出具有高丰度潜力的双歧杆菌菌株。
[0227]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种在人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株的筛选方法，其特征在于，所述方法为：(1)双歧杆菌的初步筛选1)将待筛选的双歧杆菌菌株在液体mmrs培养基中培养2～3代，离心重悬；2)将步骤1)重悬后的双歧杆菌接入将碳源替换为d-木糖的加有溴甲酚紫酸碱指示剂的液体mmrs培养基中，进行培养后，观察颜色变化，若颜色变黄则认为达标，为指标1；3)将步骤1)重悬后的双歧杆菌接入将碳源替换为低聚果糖的加有溴甲酚紫酸碱指示剂的液体mmrs培养基中，进行培养后，观察颜色变化，若颜色变黄则认为达标，为指标2；在任一碳源培养基中变黄的菌株进入下一轮实验；(2)双歧杆菌的复筛1)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌采用荧光染色法检测单株双歧杆菌对肠道上皮细胞ht-29的单黏附能力，单黏附能力≤0.27％达标；为指标3；2)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌采用绝对定量法检测不同种菌株对肠道上皮细胞ht-29的竞争黏附能力，竞争黏附能力≤4.3
×
105cfu/ml达标，为指标4；3)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到替换了不同碳源的mmrs液体培养基中，在37℃厌氧条件进行培养24～48h；分别检测以下指标：a、在碳源为d-木糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600nm
；代时为94～705min或第24h的od
600nm
≥0.19达标，为指标5和6；b、在碳源为低聚果糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600nm
；代时为68～139min或第24h的od
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≥0.78达标，为指标7和8；c、在碳源为葡萄糖的培养基中进行培养后，检测代时、od
600nm
；代时为55～141min或第24h的od
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≥0.83达标，为指标9和10；d、在碳源为菊粉的培养基中进行培养后，检测代时、od
600nm
；代时为75～152min或第24h的od
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≥0.65达标，为指标11和12；e、在添加了溴甲酚紫的碳源为蔗糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标13；将变黄的菌株转移至碳源为蔗糖的培养基中培养，检测od
600nm
；第24h的od
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≥0.77达标，为指标14；f、在添加了溴甲酚紫的碳源为低聚半乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标15；将变黄的菌株转移至碳源为低聚半乳糖的培养基中培养，检测od
600nm
；第24h的od
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≥0.96达标，为指标16；g、在添加了溴甲酚紫的碳源为乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标17；将变黄的菌株转移至碳源为乳糖的培养基中培养，检测od
600nm
；第24h的od
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≥1.00达标，为指标18；h、在添加了溴甲酚紫的碳源为d-半乳糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标19；将变黄的菌株转移至碳源为d-半乳糖的培养基中培养，检测od
600nm
；第24h的od
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≥0.63达标，为指标20；i、在添加了溴甲酚紫的碳源为d-麦芽糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达标，为指标21；j、在添加了溴甲酚紫的碳源为海藻糖的培养基中进行培养后，若颜色变黄则认为达
标，为指标22；4)将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到含有不同氮源的氮源培养基中，在37℃厌氧条件进行培养48h；分别检测以下指标：k、在氮源为复合氮源的氮源培养基中进行培养后，检测od
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；第48h的od
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≥0.26达标，为指标23；所述复合氮源为胰蛋白胨、牛肉膏和酵母粉；l、在氮源为酵母浸粉fm818的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
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≥0.34达标，为指标24；m、在氮源为酵母浸粉fm888的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
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≥0.36达标，为指标25；n、在氮源为酵母蛋白胨的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
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≥0.32达标，为指标26；o、在氮源为酵母提取物的氮源培养基中进行培养后，检测od
600nm
；第48h的od
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≥0.36达标，为指标27；(3)判断在人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株：按照步骤(1)～(2)的方法，检测上述27个指标，将至少符合17个指标的菌株，判断为人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述含有不同氮源的氮源培养基为：氮源1g、6g葡萄糖、10g无水k2hpo4、10g na2hpo4、0.25g mgso4·
7h2o、0.05gmnso4·
h2o，1g l-半胱氨酸盐酸盐，加水定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌20min；所述氮源为酵母浸粉fm818、酵母浸粉fm888、酵母提取物、l-脯氨酸、酵母蛋白胨或复合氮源，所述复合氮源为0.4g胰蛋白胨、0.4g牛肉膏、0.2g酵母粉。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)的第1)步骤中，将待筛选的双歧杆菌菌株接种至液体mmrs培养基中，在厌氧37℃条件下进行培养2～3代，在8000rpm条件下离心2min并重悬菌体。4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)的第2)步骤中，所述进行培养的条件为：厌氧37℃培养24h；所述颜色变黄则认为达标，即进行培养后的溶液的ph值≤5.2则认为达标。5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌包括但不限于长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、短双歧杆菌。6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)的第3)步骤中的若颜色变黄则认为达标，即进行培养后的溶液的ph值≤5.2则认为达标。7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)的第3)步骤中，将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到替换了不同碳源的mmrs液体培养基中，在37℃厌氧条件进行培养24h。8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)的第4)步骤中，将步骤(1)初筛后得到的双歧杆菌分别接入到含有不同氮源的氮源培养基中，在37℃厌氧条件进行培养48h。9.一种快速筛选在肠道中双歧杆菌属内具有高丰度潜力的目标菌株的方法，其特征在于，所述方法为，将待测双歧杆菌菌株按照权利要求1～8任一所述的筛选方法进行筛选，检测所述27个指标，将至少符合17个指标的菌株，判断为在肠道中具有双歧杆菌属内高丰度
潜力的目标菌株。10.权利要求1～9任一所述的筛选方法在体外筛选具有在人体肠道中占据双歧杆菌属内高丰度潜力的双歧杆菌中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有在人肠道中占据高丰度潜力双歧杆菌菌株的筛选方法，属于微生物技术领域。本发明主要针对长双歧杆菌这一已知的在双歧杆菌属内占据丰度优势的菌种进行生理特性的探究，将碳水化合物利用、含氮化合物利用以及对肠道上皮细胞黏附能力与丰度进行关联，找到与丰度显著相关的10个碳水化合物，6种含氮化合物以及2种黏附能力的筛选指标，并经过小鼠粪便实验和人类粪便体外发酵实验验证，证明了该筛选方法的可行性。本发明证实了该筛选方法筛选出来的双歧杆菌在小鼠和人类的粪便中均能占据丰度优势，并且菌种利用碳源的OD


技术研发人员：翟齐啸 李刘若兰 于雷雷 田丰伟 陆文伟 崔树茂 王刚 赵建新 陈卫 张灏
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/7/12