一种利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法及产品和应用

1.本发明属于绿色生物合成纳米材料技术领域，具体涉及一种利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法及产品和应用。


背景技术：

2.纳米材料通常指尺度为1-100nm的材料，由于其具有小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应、体积效应等，在化工、医药、食品包装、环境技术、传感等领域具有广泛应用前景与巨大的应用潜力。在纳米杀菌材料方面，纳米银系材料现已被广泛研究，但是银系材料价格昂贵。纳米铜系材料成本效益较好，也是一种优良的抗菌剂，并且此前有研究报道，纳米氧化铜颗粒(cuonps)在玉米植株上通过木质部和韧皮部组织运输。
3.常见的纳米氧化铜的制备方法有沉淀法、固相合成法、水热法、电化学沉积法等，但通常这些合成方法需要的时间较长、能源消耗较高、纳米氧化铜的抗菌性能较低。采用植物提取物绿色合成纳米金属材料是现有技术的研究热点，合成的主要原理是，植物提取液中包含的酚类化合物、萜类化合物、生物碱和辅酶等物质，可以作为稳定剂制备纳米颗粒。由于合成过程绿色环保且高效，利用植物绿色合成纳米氧化铜已逐步替代传统合成方法成为一种具有广阔前景的生产方法。
4.公开号为cn114368777a的中国专利文献公开了一种利用高良姜提取液绿色合成纳米氧化铜的方法，方法包括：将高良姜与溶剂混合，加热，过滤得到高良姜提取液；进一步将高良姜提取液与含有铜离子的前驱体溶液混合反应得到纳米铜悬浮液，将纳米铜悬浮液离心得到纳米铜颗粒，进一步洗涤、干燥、煅烧、研磨后得到纳米氧化铜，但该工艺条件较为苛刻；且现有技术中公开的可用于合成纳米氧化铜颗粒的植物种类较少。
5.另外，水稻细菌性病害是水稻生长过程中的一类主要病害，容易造成我国农业经济的巨大损失。当前水稻细菌性病害的防治仍以化学防治为主，然而，传统化学农药容易引起细菌耐药性、污染环境等问题，且会对人体造成潜在危害。因此，有必要研发出一种绿色新型的防治水稻细菌性病害的方法。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，该制备工艺步骤简单，反应条件温和，绿色环保，得到的纳米氧化铜条状颗粒物大小均一，尺寸较小，具有良好的抑菌效果，特别是能够有效地抑制水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)等植物病原菌的活性，且具有优良的稳定性和分散性。
7.具体采用的技术方案如下：
8.一种利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，包括以下步骤：
9.(1)将木槿花花瓣预处理后研磨成粉末，与去离子水混合，于55-75℃下提取2-6小时，过滤后得到木槿花提取液；
10.(2)将木槿花提取液与cuo悬浮液混合反应，再将得到的混合液经过离心、洗涤、真空冷冻干燥处理得到所述的纳米氧化铜颗粒(cuonps)。
11.木槿花属于锦葵科木槿属植物，在我国分布广泛，其栽培品种众多，且花形艳丽，多应用于园林造景。木槿花在浙江民间多作为蔬菜原料烹饪成菜肴，其口感顺滑，风味独特。同时，木槿花因其富含类黄酮还具有药用价值，具有抗癌、预防心血管疾病等功效。类黄酮还是一种天然强抗氧化剂，无污染，毒性小，副作用少，对疾病的治疗和人体保健具有十分突出的作用。
12.在本发明方法中，选取用于观赏的木槿花为材料，利用其花瓣提取液制备cuonps。木槿花提取物的植物化学成分包括类黄酮、单宁、生物碱、类固醇、萜类、氨基酸、糖苷、粘液和树胶等，部分植物化学成分起到稳定剂的作用，部分植物化学成分能够与cuo相互作用，支持条状纳米结构的生长，合成纳米氧化铜条状颗粒物。
13.实验表明，通过本发明方法得到的纳米氧化铜颗粒结构稳定且对水稻细菌性病害具有一定的防治效果，特别是对水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)具有较强的抑制作用，应用前景广泛。
14.优选的，预处理步骤包括除尘处理以及干燥处理。
15.使用研磨仪将预处理后的木槿花花瓣研磨成粉末，研磨仪选用的程序为65-90hz，90-120s。频率过低会导致植物材料提取效率较低，频率过高则会造成不必要能源消耗。
16.优选的，步骤(1)中，木槿花花瓣粉末与去离子水的质量比为1：90-100。
17.步骤(2)中，木槿花提取液与cuo悬浮液混合反应的条件为：温度55-75℃，时间3-6h。温度设置过低会导致反应不充分、合成效果不佳，最终会影响纳米氧化铜颗粒的粒径大小以及其稳定性和均匀性，从而影响其抑菌效果；温度设置过高则容易导致合成物变质，同时会造成不必要的能源消耗。
18.优选的，所述的cuo悬浮液的浓度为0.16-0.24mg/ml，木槿花提取液与cuo悬浮液的体积比为1-3：1。木槿花有效成分含量过高会影响纳米氧化铜颗粒的生成，而其用量过低则会导致最终产物合成的效率降低。
19.优选的，离心速率为10000-14000rpm，离心时间为8-15min，离心速率过低、时间过短，则会导致上清不澄清，从而使最终获得的纳米氧化铜颗粒含量较少以及杂质较多，进而影响产物的抑菌效果。
20.本发明还提供了所述的利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法制得的纳米氧化铜颗粒，该纳米氧化铜颗粒呈纳米条状，粒径为20-50nm，其结构稳定、尺寸小且大小均一。
21.本发明还提供了所述的纳米氧化铜颗粒在抑制植物病原菌中的应用，优选的，所述的植物病原菌包括水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzaepv.oryzae,xoo)。
22.本发明还提供了所述的纳米氧化铜颗粒作为农用杀菌剂在防治植物病原菌引发的植物病害中的应用，所述的植物病害包括水稻白叶枯病等水稻细菌性病害。实验表明，本发明方法制得的纳米氧化铜颗粒对于水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)具有较强的抑菌效果，可以控制其引起的水稻白叶枯病等病害，能够替代传统的化学抑菌剂，降低病害带来的经济损失。
23.防治植物病害的具体应用方法为：将纳米氧化铜颗粒溶于水制得cuonps悬浮液，
再将cuonps悬浮液均匀喷洒于所防治的植物上。
24.优选的，cuonps悬浮液浓度为50-200μg/ml，在此优选范围内的农用杀菌剂对水稻白叶枯病等水稻细菌性病害防治效果好，进一步提高浓度，效果提高不多。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
26.(1)本发明得到的纳米氧化铜颗粒结构稳定、平均粒径小且大小均一，并且能够有效地抑制水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)等植物病原菌的活性，具有很强的杀菌效果；
27.(2)本发明工艺消耗相对较少且不产生有毒副产物，十分环保和安全，属于绿色合成工艺，且工艺简单，无需添加额外的催化剂，反应条件温和，适合大规模生产；
28.(3)将本发明得到的cuonps作为农用抗菌剂应用于防治水稻细菌性病害，具有很好的防治效果，该植物来源的农用杀菌剂不仅不会对人体带来潜在危害，也不会污染环境，应用方式也简单易行，在农业生产领域中有广阔的应用前景。
附图说明
29.图1为利用木槿花提取液合成的cuonps的紫外可见光谱图。
30.图2中的a为实施例1中制得的cuonps的红外光谱图，b为cuonps的扫描电镜图，c为cuonps的x射线衍射图。
31.图3为实施例1中制得的cuonps的eds图。
32.图4为不同浓度cuonps悬浮液对水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)的抑菌效果图，其中，a为抑菌圈光学图片，b为抑菌圈直径变化统计图，c为吸光值变化图，图中，a，b，c，d表示不同处理间5％水平上差异显著。
33.图5为不同浓度cuonps悬浮液对水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)生物膜形成的影响结果图；图中，a，b，c表示不同处理间5％水平上差异显著。
34.图6为水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)经cuonps悬浮液处理后的细胞染色结果图，其中，a为阴性对照，b为经cuonps悬浮液处理后的细胞；图中，b-+，b++表示活死菌的占比。
35.图7中的a、b、c分别为cuonps悬浮液对水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)细胞的破坏效果随时间变化图，a的处理时间最短，b次之，c最长。
36.图8为不同浓度cuonps悬浮液对水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)处理24h后细胞内溶物rna外渗的统计结果图，图中，a，b，c，d表示不同处理间5％水平上差异显著。
具体实施方式
37.下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
38.水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)，该病原菌是从浙江省金华市田间患病水稻叶片中分离得到。
39.cuo悬浮液由氧化铜溶于去离子水中制备得到，氧化铜的粒度为100目。
40.实施例1
41.(1)将新采摘下来的木槿花花瓣洗净、烘干，用研磨仪在90hz，90s的程序下研磨成粉末，称取2g木槿花瓣粉末与200ml去离子水混合，将其置于升温至55℃的水浴锅中提取5小时，在此过程中间断地用玻璃棒搅拌，然后在室温下冷却，再充分过滤去除固体杂质，得到木槿花提取液；
42.(2)取200ml步骤(1)得到的木槿花提取液与200ml浓度为0.16mg/ml的cuo悬浮液混合，置于温度为55℃的水浴锅中，每隔15分钟搅拌一次，待4小时后将混合液取出，将混合液以转速14000rpm离心8分钟，去除上清液，取沉淀进行洗涤、真空冷冻干燥后得到粉末状的纳米氧化铜颗粒。
43.利用紫外可见吸收光谱(uv-vis)、扫描电子显微镜(sem)、能谱仪(eds)、傅里叶变换红外光谱(ftir)、x射线衍射(xrd)评价cuonps的结构特征和理化性质。
44.图1为利用木槿花提取液合成的cuonps的紫外可见光谱，结果表明其在255-275nm范围内有吸收峰，合成的cuonps在255nm处出现表面等离子体共振峰。
45.图2中的a为实施例1中制得的cuonps的红外光谱图，由该图可知cuonps已被成功合成；b为cuonps的扫描电镜图，可以看出合成cuonps为条状颗粒物，粒径为20-50nm，c为cuonps的x射线衍射图，由图可知，cuonps分别出现(110)，(002)，(200)，(-202)，(-113)，(-331)的特征峰，与cuo粉末衍射图特征峰相一致，证明合成了稳定的cuonps。
46.图3为实施例1中制得的cuonps的eds图，该纳米氧化铜颗粒主要由cu和o两种元素组成，cu元素占比为77.68％，o元素占比为22.23％。
47.实施例2
48.(1)将新采摘下来的木槿花花瓣洗净、烘干，用研磨仪在85hz，110s的程序下研磨成粉末，称取2g木槿花叶片与190ml去离子水混合，将其置于升温至60℃的水浴锅中提取4小时，在此过程中间断地用玻璃棒搅拌，然后在室温下冷却，再充分过滤去除固体杂质，得到木槿花提取液；
49.(2)取300ml步骤(1)得到的木槿花提取液与200ml浓度为0.2mg/ml的cuo悬浮液混合，置于温度为60℃的水浴锅中，每隔15分钟搅拌一次，待4小时后将混合液取出，将混合液以转速12000rpm离心10分钟，去除上清液，取沉淀进行洗涤、真空冷冻干燥后得到粉末状的纳米氧化铜颗粒。
50.实施例3
51.(1)将新采摘下来的木槿花花瓣洗净、烘干，用研磨仪在80hz，100s的程序下研磨成粉末，称取2g木槿花瓣粉末与180ml去离子水混合，将其置于升温至65℃的水浴锅中提取3小时，在此过程中间断地用玻璃棒搅拌，然后在室温下冷却，再充分过滤去除固体杂质，得到木槿花提取液；
52.(2)取400ml步骤(1)得到的木槿花提取液与200ml浓度为0.24mg/ml的cuo悬浮液混合，置于温度为65℃的水浴锅中，每隔15分钟搅拌一次，待4小时后将混合液取出，将混合液以转速10000rpm离心15分钟，去除上清液，取沉淀进行洗涤、真空冷冻干燥后得到粉末状的纳米氧化铜颗粒。
53.样品分析
54.抑菌效果评价：
55.(一)cuonps悬浮液浓度对抑菌效果的影响
56.为了评估cuonps抑制水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)的活性，将实施例1中制备的cuonps粉末分别配制成浓度为50、100、200μg/ml溶液，通过测定菌液吸光值、平板抑菌圈直径评估不同cuonps悬浮液浓度的抑菌性能。
57.由图4中的a和b可知，将平板放置于适宜的条件下培养24h后，处理组与对照组相比，添加cuonps悬浮液的平板上抑菌圈最大可达到39mm；由图4中的c可知，将处理组和对照组放置于适宜的条件下培养24h后，处理组浓度为50、100、200μg/ml的cuonps悬浮液，其最小和最大生长抑制率分别为36.12％，79.65％，可见浓度越高抑菌效果越好，但是当浓度在200μg/ml的基础上进一步提高时，其抑菌率增加不多，抑菌效果增加不明显。
58.由图4可知，cuonps悬浮液的浓度越高，抑菌效果越好，利用木槿花合成的cuonps能够显著抑制水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzaepv.oryzae,xoo)的生长。
59.(二)cuonps悬浮液浓度对植物病原菌生物膜形成的影响
60.生物膜通过提高细菌在恶劣条件下的生存能力，抵御来自植物的抑菌物质对细菌的抑制作用，促进细菌在寄主植物的定殖，从而在植物病原菌的毒力中发挥了重要功能。
61.为了充分了解实施例1中合成的cuonps对水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)生物膜形成的影响，选取浓度为50、100、200μg/ml的cuonps悬浮液分别加入od600相等的病原菌液中，以等体积的菌液为空白对照，在适宜条件下培养24小时后，通过测量生物膜形成的od570数值来监测纳米氧化铜对其生物膜形成的影响。
62.图5为不同浓度cuonps悬浮液对水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)生物膜形成的影响结果图；由该图可知，随着纳米氧化铜颗粒浓度的增加，病原菌生物膜的形成量逐渐降低，在浓度为200μg/ml cuonps悬浮液处理后，其生物膜形成量减少了79.17％。由此表明，纳米氧化铜颗粒抑制植物病原菌生物膜的形成从而降低病原菌的生存和定殖能力。
63.(三)cuonps悬浮液的抑菌效果
64.为了进一步证明cuonps确实能够通过破坏细菌的细胞结构而导致其死亡，从而起到良好的抑菌作用，将实施例1中合成的cuonps粉末与水配制成200μg/ml的悬浮液。将得到的cuonps悬浮液与水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)反应8h后，通过流式细胞仪下进行观察，以经过双蒸馏水处理后的样品为阴性对照，得到的结果图如图6所示，其中，死亡的细胞能让pi(碘化丙啶)进入细胞核中对细胞核进行染色呈红色，pi对活细胞的细胞核不能染色。
65.图6中的a为阴性对照，细胞凋亡率为2.02％；图6中的b为经cuonps悬浮液处理后的细胞，可以看出，经过200μg/ml cuonps悬浮液处理后病原菌细胞显著减少，其细胞凋亡率为99.42％，说明cuonps能够抑制细胞的生长。
66.此外，通过透射电镜可以更加直观地看出细胞破坏程度。图7中的a、b、c为浓度为200μg/ml的cuonps悬浮液处理下水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)被破坏的不同程度，由a图可见纳米颗粒进入完整、正常的细胞，而b、c两图显示细菌细胞经过纳米氧化铜处理后，纳米氧化铜破坏细胞结构使细胞呈现不正常的状态从而使细胞死亡。
67.(四)cuonps对植物病原菌物质外渗的影响
68.通过测定经不同浓度cuonps悬浮液处理的水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)内溶物外渗的量，从而评估合成的cuonps的杀菌能力。
69.由图8可知，cuonps悬浮液浓度为200μg/ml时，细胞内溶物外渗最多，表明xoo菌株细胞结构受破坏程度最大。随着cuonps悬浮液浓度的降低，其细胞内溶物rna和dna的含量逐渐减少，表明细胞受破坏程度降低。
70.由此可知，cuonps对植物病原菌内溶物的外渗有影响，从而表明其能够破坏植物病原菌的细胞结构。
71.应用例
72.在温室或田间称取实施例1得到的cuonps粉末2g溶于10l水中配置成200μg/ml的cuonps悬浮液，均匀地喷施在可能发病的农作物水稻上，观察发现喷施过cuonps悬浮液的农作物较未喷施的农作物生长较好，由此可以说明cuonps悬浮液能够有效地对农作物进行病害防治。
73.以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将木槿花花瓣预处理后研磨成粉末，与去离子水混合，于55-75℃下提取2-6小时，过滤后得到木槿花提取液；(2)将木槿花提取液与cuo悬浮液混合反应，再将得到的混合液经过离心、洗涤、真空冷冻干燥处理得到所述的纳米氧化铜颗粒。2.根据权利要求1所述的利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，其特征在于，预处理步骤包括除尘处理以及干燥处理。3.根据权利要求1所述的利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，其特征在于，使用研磨仪将预处理后的木槿花花瓣研磨成粉末，研磨仪选用的程序为65-90hz，90-120s。4.根据权利要求1所述的利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)中，木槿花花瓣粉末与去离子水的质量比为1：90-100。5.根据权利要求1所述的利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，其特征在于，步骤(2)中，木槿花提取液与cuo悬浮液混合反应的条件为：温度55-75℃，时间3-6h。6.根据权利要求1所述的利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，其特征在于，所述的cuo悬浮液的浓度为0.16-0.24mg/ml，木槿花提取液与cuo悬浮液的体积比为1-3：1。7.根据权利要求1所述的利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法，其特征在于，离心速率为10000-14000rpm，离心时间为8-15min。8.根据权利要求1-7任一所述的利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法制得的纳米氧化铜颗粒。9.根据权利要求8所述的纳米氧化铜颗粒在抑制植物病原菌中的应用，其特征在于，所述的植物病原菌包括水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae,xoo)。10.根据权利要求8所述的纳米氧化铜颗粒作为农用杀菌剂在防治植物病原菌引发的植物病害中的应用，其特征在于，所述的植物病害包括水稻细菌性病害。

技术总结
本发明公开了一种利用木槿花提取液制备纳米氧化铜颗粒的方法及产品和应用，属于绿色生物合成纳米材料技术领域，方法包括以下步骤：(1)将木槿花花瓣预处理后研磨成粉末，与去离子水混合，于55-75℃的温度下提取3-6小时，过滤后得到木槿花提取液；(2)将木槿花提取液与CuO悬浮液混合反应，再将得到的混合液经过离心、洗涤、真空冷冻干燥处理得到所述的纳米氧化铜颗粒。该制备工艺步骤简单，反应条件温和，绿色环保，得到的纳米氧化铜条状颗粒物大小均一，尺寸较小，能够有效地抑制水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)等植物病原菌的活性，防治水稻细菌性病害。防治水稻细菌性病害。防治水稻细菌性病害。


技术研发人员：李斌 李冰 徐鑫焱 吕路琼 黄雪芳 罗金燕
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.03.01
技术公布日：2023/7/12