一种用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法

1.本发明属于纳米医学技术领域，尤其涉及一种用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法。


背景技术：

2.目前，呼吸道过敏性疾病是机体免疫系统对外源性或内源性抗原产生的异常免疫应答；表现为发病器官的炎症反应；主要包括呼吸道过敏性疾病和自身免疫性疾病；发病率为30％以上，并逐年攀升。免疫耐受异常在呼吸道过敏性疾病对发病中有重要作用。目前对呼吸道过敏性疾病的治疗方法基本上属于控制临床症状，无法达到根治的目的。疫苗广泛地用于预防疾病和治疗确定的疾病(免疫治疗疫苗)。因此，需要设计一种更为有效的、应用于呼吸道过敏性疾病治疗的疫苗及其构建方法。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前对呼吸道过敏性疾病的治疗方法基本上属于控制临床症状，无法达到根治的目的。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法。
5.本发明是这样实现的，一种用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法包括：
6.利用复乳法使mal-peg-plga负载cd83蛋白治疗剂形成cd83纳米颗粒后，将20mg cd83纳米颗粒悬浮在经过tcep处理后的、ph为7.4的mo融合蛋白溶液，4℃孵育过夜，偶联后形成具有靶向功能的moc纳米颗粒。
7.进一步，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法还包括：
8.利用swiss model软件分别分析cd83蛋白和mo融合蛋白的三维结构，并确定半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺基团反应的路径。
9.进一步，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法还包括：
10.在moc纳米颗粒上构建选择目的细胞的装置；moc纳米颗粒携带促进产生抗原特异性调节性t细胞的材料，用于产生抗原特异性调节性t细胞；通过靶向抗原特异性t细胞促进treg细胞生成，实现气道粘膜免疫耐受功能重建。
11.进一步，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法包括以下步骤：
12.步骤一，进行纳米颗粒负载的免疫调节性蛋白cd83的制备；
13.步骤二，进行纳米颗粒靶向性分子mo融合蛋白的制备；
14.步骤三，进行moc纳米颗粒的制备。
15.进一步，所述步骤一中的纳米颗粒负载的免疫调节性蛋白cd83的制备包括：
16.利用原核表达系统对负载的核心免疫调节蛋白cd83进行诱导表达，并利用蛋白纯
化工程技术进行蛋白纯化；从ncbi网站上获取cd83蛋白的基因序列并进行基因序列合成；将合成的cd83基因序列与质粒pet-32a进行重组，重组合成的质粒利用限制性内切酶mlu i与xho i对构建的重组质粒pet-32a-cd83进行双酶切鉴定；经琼脂糖凝胶电泳后，将重组质粒pet-32a-cd83转化至感受态细胞bl21，在37℃下利用iptg诱导cd83蛋白表达。
17.进一步，所述cd83蛋白的基因序列为accession：np 001276844。
18.进一步，所述步骤二中的纳米颗粒靶向性分子mo融合蛋白的制备包括：
19.利用mhc-ii-抗原肽复合物修饰拟构建的纳米颗粒。从ncbi网站上获取mhc-ii蛋白的基因序列后与ova抗原表位、柔性连接子共同进行基因序列合成。mhc-ii-ova抗原肽融合蛋白由mhc-ii通过连接子与ova抗原肽相连，在重组蛋白的c末端连接3个半胱氨酸形成具有靶向功能的mo融合蛋白；将mo基因序列与pet-28a表达质粒进行重组，利用限制性内切酶bamhi与xho i对构建的重组质粒pet-28a-mo进行鉴定；经过琼脂糖凝胶电泳后，将重组质粒pet-32a-cd83转化至感受态细胞bl21，在37℃下诱导目的蛋白表达。
20.进一步，所述mhc-ii蛋白的基因序列为accession：1817375a，所述ova抗原表位的基因序列为iaimsalamvylgak，所述柔性连接子的基因序列为ggggs，所述半胱氨酸的基因序列ccc。
21.进一步，所述步骤三中的moc纳米颗粒的制备包括：
22.利用还原剂tcep还原mo融合蛋白c-末端的半胱氨酸后，使mal-peg-plga聚合物材料中的马来酰亚胺与mo融合蛋白c末端半胱氨酸经tcep还原后暴露出的巯基-sh进行反应，使mo融合蛋白与mal-peg-plga聚合物材料mal基团进行偶联，使mal-peg-plga纳米颗粒被具有靶向功能的mo融合蛋白修饰，从而具备靶向抗原特异性效应细胞的功能。
23.本发明的另一目的在于提供一种实施所述的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法构建得到的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗由纳米载体、核心治疗剂和mo融合蛋白组成；所述纳米载体为mal-peg-plga，所述核心治疗剂为cd83蛋白，所述mo融合蛋白由ovat细胞抗原肽、mhc-ii、半胱氨酸和连接子组成。
24.结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
25.本发明提供的纳米疫苗构建方法，通过在纳米颗粒上构建有选择目的细胞的装置；纳米颗粒携带有促进产生抗原特异性调节性t细胞的材料，目的是产生抗原特异性调节性t细胞，这些抗原特异性调节性t细胞能将抗原特异性th2细胞和抗原特异性th1细胞杀灭，从而抑制呼吸道过敏性疾病。
26.本发明提供的新型的、具有良好的生物安全性的moc纳米疫苗，是一种新型的、以去除哮喘发病为基础的、重建气道粘膜免疫耐受功能的新方法；可通过靶向抗原特异性t细胞促进treg细胞的生成，重建气道粘膜免疫耐受功能。
27.本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：本发明构建了一种以mo融合蛋白为靶分子、cd83为治疗剂、mal-peg-plga为纳米载体的moc纳米颗粒，在世界上首次明确了moc nps可抑制过敏性哮喘小鼠的th2型炎症反应，并在过敏反应环境下诱导气道组织抗原特异性treg的生成的作用机制，可为纳米疫苗在过敏性疾病免疫治疗中提供科学的理论基础和新方法。
28.本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：在特异性免疫治疗呼吸道过敏性疾病的研究中，如何在过敏状态下重建机体的免疫耐受功能是科学家一直研究的热点。本发明构建的纳米颗粒在模式动物体内可通过靶向其体内的抗原特异性t细胞，诱导其分化形成抗原特异性treg细胞，使气道得以重建其免疫耐受性功能。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本发明实施例提供的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法流程图；
31.图2是本发明实施例提供的mo融合蛋白设计示意图；
32.图3是本发明实施例提供的cd83纳米颗粒制备示意图；
33.图4是本发明实施例提供的moc纳米颗粒制备示意图；
34.图5是本发明实施例提供的cd83蛋白的纯化示意图；
35.图6是本发明实施例提供的mo融合蛋白的表达与纯化示意图；
36.图7是本发明实施例提供的mo-mal-peg-plga-cd83纳米颗粒(moc纳米颗粒)制备示意图；
37.图8是本发明实施例提供的moc纳米颗粒在不同ph环境下的缓释结果图；
38.图9是本发明实施例提供的激光共聚焦显微镜观察moc纳米颗粒结合肺组织抗原特异性t细胞示意图；
39.图10是本发明实施例提供的流式细胞术分析moc nps结合抗原特异性t细胞示意图；
40.图11是本发明实施例提供的流式细胞术分析moc纳米颗粒诱导treg细胞分化示意图；
41.图12是本发明实施例提供的经moc nps诱导后的抗原特异性treg细胞抑制效应t细胞的活化示意图；
42.图13是本发明实施例提供的过敏性哮喘小鼠经乙甲酰胆碱激发后的气道阻力示意图；
43.图14是本发明实施例提供的elisa检测过敏性哮喘小鼠血清ova特异性ige水平示意图；
44.图15是本发明实施例提供的moc纳米颗粒改善肺组织炎症示意图；
45.图16是本发明实施例提供的moc纳米颗粒对实验动物肺嗜酸性粒细胞的影响示意图；
46.图17是本发明实施例提供的流式细胞术检测过敏性哮喘小鼠肺组织treg细胞的比例示意图；
47.图中：(1)mal-peg-plga聚合物结构核磁共振谱图；(2)mal-peg-plga分子结构图；
(3)经swiss model软件分析后的cd83蛋白三维结构图；(4)mal-peg-plga负载cd83蛋白形成cd83纳米颗粒；(5)经swiss model软件分析后的mo融合蛋白三维结构图；(6)半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺基团反应的路径；(7)cd83纳米颗粒与mo融合蛋白偶联后形成moc纳米颗粒。
具体实施方式
48.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
49.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
50.为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
51.本发明实施例提供的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗由纳米载体、核心治疗剂和mo融合蛋白组成；
52.其中，纳米载体为mal-peg-plga，核心治疗剂为cd83蛋白，mo融合蛋白由ovat细胞抗原肽、mhc-ii、半胱氨酸和连接子组成。
53.本发明实施例提供的具有良好的生物安全性的moc纳米疫苗，是一种新型的、以去除哮喘发病为基础的、重建气道粘膜免疫耐受功能的新方法，可通过靶向抗原特异性t细胞促进treg细胞的生成，重建气道粘膜免疫耐受功能。
54.本发明实施例提供的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法包括：利用复乳法使mal-peg-plga负载cd83蛋白治疗剂形成cd83纳米颗粒后，将20mg cd83纳米颗粒悬浮在经过tcep处理后的、ph为7.4的mo融合蛋白溶液，4℃孵育过夜，偶联后形成具有靶向功能的moc纳米颗粒。
55.本发明实施例提供的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法还包括：利用swiss model软件分别分析cd83蛋白和mo融合蛋白的三维结构，并确定半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺基团反应的路径。
56.本发明实施例提供的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法还包括：在moc纳米颗粒上构建选择目的细胞的装置；moc纳米颗粒携带促进产生抗原特异性调节性t细胞的材料，用于产生抗原特异性调节性t细胞；通过靶向抗原特异性t细胞促进treg细胞生成，重建气道粘膜免疫耐受功能。
57.如图1所示，本发明实施例提供的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法包括以下步骤：
58.s101，进行纳米颗粒负载的免疫调节性蛋白cd83的制备；
59.s102，进行纳米颗粒靶向性分子mo融合蛋白的制备；
60.s103，进行moc纳米颗粒的制备。
61.本发明实施例提供的步骤s101中的纳米颗粒负载的免疫调节性蛋白cd83的制备包括：利用原核表达系统对负载的核心免疫调节蛋白cd83进行诱导表达，利用蛋白纯化工程技术进行蛋白纯化；从ncbi网站上获取cd83蛋白的基因序列并进行基因序列合成；将合
抗原肽复合物修饰拟构建的纳米颗粒。从ncbi网站上获取mhc-ii蛋白的基因序列(accession：1817375a)后与ova抗原表位(iaimsalamvylgak)、柔性连接子(ggggs)共同交付于上海生工生物科技有限公司进行基因序列合成。mhc-ii-ova抗原肽(mo)融合蛋白由mhc-ii通过连接子与ova抗原肽相连，在重组蛋白的c末端连接3个半胱氨酸(ccc)形成具有靶向功能的mo融合蛋白，如图6a所示。将mo基因序列与pet-28a表达质粒进行重组，利用限制性内切酶bamh i与xho i对构建的重组质粒pet-28a-mo进行鉴定，经过琼脂糖凝胶电泳后，如图6b所示，在500bp处可见mo目的基因片段，且与所设计的mo重组基因序列大小相符合。将重组质粒pet-32a-cd83转化至感受态细胞bl21(de3)后，在37℃下诱导目的蛋白表达，结果显示在37℃下菌体上清液大量表达mo目的蛋白，因此mo融合蛋白为可溶性蛋白，如图6c所示。经过亲和层析纯化后，本发明纯化出了高纯度的mo融合蛋白，如图6d所示。
73.1.3moc纳米颗粒的制备
74.基于前面的实验结果，本发明已制备了纳米材料需负载的免疫调节性c83蛋白及修饰mal-peg-plga表面的靶向分子mo融合蛋白。由于马来酰亚胺基团可与蛋白质中的巯基发生迈克尔加成反应，使mo融合蛋白偶联到mal-peg-plga表面，因此本发明先利用还原剂tcep还原mo融合蛋白c-末端的半胱氨酸后，使mal-peg-plga聚合物材料中的马来酰亚胺与mo融合蛋白c末端半胱氨酸经tcep还原后暴露出来的巯基(-sh)进行反应，使mo融合蛋白与mal-peg-plga聚合物材料mal基团进行偶联，使mal-peg-plga纳米颗粒被具有靶向功能的mo融合蛋白修饰，从而具备靶向抗原特异性效应细胞的功能，如图7所示。
75.1.4moc纳米颗粒的物理特征
76.利用复乳法使mal-peg-plga负载cd83蛋白治疗剂形成cd83纳米颗粒后，将20mg cd83纳米颗粒悬浮在经过tcep处理后的mo融合蛋白溶液(ph7.4)，4℃孵育过夜，形成具有靶向功能的moc纳米颗粒。
77.利用马尔文激光粒度仪对制备的纳米颗粒进行检测，结果如表1所示，moc nps(moc纳米颗粒)、mo nps(被mo融合蛋白修饰的但未负载cd83蛋白的纳米颗粒)、cd83 nps(负载cd83蛋白但未被mo融合蛋白修饰的纳米颗粒)以及blanknps(空载的纳米颗粒)平均粒径大小都小于200nm，表面zeta电位都呈现为负电位，且pdi值都小于0.3，都具有良好的分散性。其中，经mo融合蛋白修饰后的moc nps、mo nps粒径对比未被修饰的cd83 nps及blanknps较大；而未被修饰的cd83 nps及blanknps也较经mo融合蛋白修饰后的moc nps、mo nps的pdi值低，zeta电位值高，这些资料证明，经mo融合蛋白修饰后影响了纳米颗粒的粒径、zeta电位以及pdi系数数值的变化。另一方面，moc纳米颗粒与cd83纳米颗粒负载cd83蛋白的包封率都达到75％以上，其中，包封率为75.12％，因此，1mg moc纳米颗粒中负载cd83蛋白的含量等同于15μg游离的cd83蛋白。
78.表1纳米颗粒的物理特征
[0079][0080]
2、moc纳米颗粒特性分析
[0081]
2.1moc纳米颗粒cd83蛋白药物的释放率
[0082]
在结果1.4中已明确moc纳米颗粒的物理特征，为进一步分析moc纳米颗粒的释药速率，本发明采用ph 7.4与ph 6.8的pbs溶液分别模拟呼吸道正常生理状态下和过敏状态下(过敏性哮喘患者呼吸道粘膜微环境下ph为6.8～7.0)的微环境，利用透析法分析moc纳米颗粒在6、12、24、48、72、96h时的体外释放率。
[0083]
结果如图8所示，本发明可以观察到在ph值为7.4的正常生理状态的微环境下，在48h时，moc纳米颗粒的累计释放率接近40％，而在ph值为6.8的病理微环境下，moc纳米颗粒释放速率加快且累计释放率超过40％。72h时，在ph值为7.4的正常生理状态的微环境下moc纳米颗粒开始突释放蛋白且在96h时累计释放率达到了95％；而在ph值为6.8的病理微环境下moc纳米颗粒累积释放率已达到了95％左右。这提示moc纳米颗粒在正常生理环境下可以保持一个较为缓慢的释放速率，而酸性的病理环境条件则加速moc纳米颗粒释放药物的速率。
[0084]
采用透析法模拟机体内环境药物缓释对moc纳米颗粒在环境中药物的释放速度进行分析。在ph 7.4、ph 6.8pbs溶液中，测定6、12、24、48、72、96h时moc纳米颗粒释放cd83蛋白的速率。此部分研究每组实验至少重复3次，折线图数据以means
±
sem表示，每组样本数据都经过三次重复分析。
[0085]
2.2激光共聚焦显微镜观察moc纳米颗粒结合肺组织抗原特异性t细胞
[0086]
由分析报道可知，mhc-ii-ova抗原肽分子复合物能靶向过敏原ova特异性t细胞表面的tcr从而诱导t细胞活化并大量扩增。本发明利用mo融合蛋白修饰cd83纳米颗粒后，使moc纳米颗粒具有靶向靶向抗原特异性t细胞的功能。因此，为验证moc纳米颗粒的靶向性，本发明取cd4
+
cd62l
+
t细胞(抗原特异性t淋巴细胞)在体外进行固定后与带荧光素fkr648-moc纳米颗粒共孵育6h，并利用碘化丙啶对细胞核进行染色。染色后的cd4
+
cd62l
+
t细胞在激光共聚焦显微镜下进行观察，结果显示带有fkr648荧光素的blank nps与cd83 nps未附着在细胞表面，说明未被mo融合蛋白修饰的纳米颗粒不能与cd4
+
cd62l
+
t细胞表面的靶分子结合，因此不能与cd4
+
cd62l
+
t细胞表面的tcr结合。而带有荧光素fkr648的mo nps与moc纳米颗粒明显的附着在cd4
+
cd62l
+
t细胞表面，这证明被mo融合蛋白修饰的纳米颗粒可与cd4
+
cd62l
+
t细胞表面的tcr分子结合，moc纳米颗粒具有靶向cd4
+
cd62l
+
t细胞的功能。
[0087]
如图9所示，取脾脏cd4
+
cd62l
+
t淋巴细胞进行固定后，分别与blanknps、cd83 nps、mo nps和moc nps共同孵育6h后进行碘化丙啶(呈红色)染色20min，结束后利用激光共聚焦显微镜进行观察(原始放大倍数：
×
63)。
[0088]
2.3流式细胞术分析moc纳米颗粒靶向性结合抗原特异性t细胞
[0089]
从2.2的分析结果显示，带有荧光素fkr648的mo nps与moc nps可与cd4
+
cd62l
+
t细胞表面靶分子结合从而附着在细胞表面。为进一步验证这一结果，本发明利用流式细胞术分析被带有荧光素fkr648的纳米颗粒结合的cd4
+
cd62l
+
t细胞的数量。从流式分析结果可观察到，blanknps、cd83 nps组中只有很少带有荧光素fkr648的cd4
+
cd62l
+
t；而mo nps、moc nps组中被fkr648-纳米颗粒附着的cd4
+
cd62l
+
t细胞数量较未被mo融合蛋白修饰的blanknps、cd83 nps组显著性增多(*p《0.0001)，进一步证明了moc纳米颗粒可靶向结合抗原特异性t细胞。
[0090]
如图10所示，取小鼠脾脏cd4
+
cd62l
+
t淋巴细胞，固定后分别与fkr648-blank nps、fkr648-cd83 nps、fkr648-mo nps和fkr648-moc nps共同孵育6h，利用流式细胞术分析fkr648+t细胞的比例。a，圈门内为fkr648+t细胞；b，柱形图为fkr648+t细胞数量的统计。*p《0.0001，与blank nps相比较。此部分研究每组实验至少重复3次，柱形图数据以means
±
sem表示，每组样本数据都经过三次重复分析。
[0091]
3.1moc nps诱导肺组织抗原特异性treg细胞分化
[0092]
在上一步实验中本发明已明确moc纳米颗粒可靶向抗原特异性t细胞，为进一步验证moc纳米颗粒负载的cd83治疗剂在靶向抗原特异性t细胞后的作用，本发明取do11.10小鼠(一种ova特异的转基因小鼠)及balb/c小鼠脾脏cd4
+
t细胞进行体外培养，与saline、blanknps、cd83 nps、mo nps、moc纳米颗粒共孵育96h，利用流式细胞术检测cd4
+
t细胞中cd25
+
fxop3
+
t细胞的分化情况。从流式结果本发明可以观察到，与saline、ova、blanknps、cd83nps、mo nps共孵育后，treg细胞的比例无明显变化，而经moc nps治疗后的treg细胞的比例显著性增加，这证明moc nps可通过影响抗原特异性cd4
+
t细胞分化促进treg细胞的生成。
[0093]
如图11所示，a-b、do11.10或balb/c cd4
+
cd62l
+
t细胞(teff)在moc nps或对照组(saline、blanknps、cd83 nps、mo nps)存在下以10μg纳米颗粒/ml培养4天。然后通过流式细胞术分析细胞。a，门控流式细胞术图显示treg计数。b，柱形图为treg细胞比例的统计。*p《0.001，与a组相比，此部分研究每组实验至少重复3次，柱形图数据以means
±
sem表示，每组样本数据都经过三次重复分析。
[0094]
3.2moc nps促进抗原特异性treg细胞的活性
[0095]
虽然cd83可诱导调节性t细胞的生成，但cd83是否能与特异性过敏原共同作用诱导抗原特异性treg分化并进一步并活化需要做更进一步的研究。treg细胞在控制机体免疫耐受和炎症反应过程中发挥着重要的作用。本发明已经观察到moc nps可诱导抗原特异性treg细胞的产生，为进一步确认moc nps诱导的抗原特异性treg细胞的功能性，本发明利用cfse标记do11.10小鼠cd4
+
t细胞，取经moc nps诱导后的treg细胞(cd4
+
cd25
+
cd127-t细胞)，balb/c小鼠cd4
+
t细胞(naive t cells,nt)。将细胞分为saline组，ova组，ova/treg组(treg:cd4
+
t,1:5)，ova/nt(dc:nt,1:5)组，细胞培养三天后利用流式细胞术观察treg细胞对效应cd4
+
t的抑制功能。
[0096]
从结果本发明可以观察到，在体外培养条件下，加入ova后激活了效应t细胞，ova组与ova/nt组中的效应t细胞出现明显的细胞增殖现象，但在经moc nps干预后treg细胞存在下，抗原特异性t细胞的这种细胞增殖的生命现象则明显被抑制。这进一步证明了moc nps诱导后的treg细胞具有抑制抗原特异性效应t细胞功能的特性。
[0097]
如图12所示，利用cfse标记do11.10 cd4
+
t细胞，在不同组别的细胞中加入saline、ova，ova与treg细胞(treg细胞：cd4+t，1：5)、ova与nt细胞(nt：为balb/c小鼠幼稚t细胞与dc细胞以5：1数量混合的细胞)，各组别的细胞在体外培养三天后，利用流式细胞术进行分析。a，门控直方图显示增殖细胞计数；b，柱形图为增殖细胞比例的统计。*p《0.001，与saline组相比,此部分研究每组实验至少重复3次，柱形图数据以means
±
sem表示，每组样本数据都经过三次重复分析。
[0098]
4.1moc纳米颗粒抑制过敏性哮喘小鼠气道高反应
[0099]
过敏性哮喘的气道高反应性(airway hyper responsiveness，ahr)主要是由于气道接触过敏原后的反应程度：机体在正常情况下对外源性抗原的刺激并不能引起气道平滑肌的收缩从而引发气道高反应性，但呼吸道过敏性患者尤其是哮喘患者则可能因为气道处于炎症状态下接触过敏原后产生过度反应，出现气道管壁痉挛、内外压力的改变、肿胀、管腔被粘液阻塞以及气道平滑肌细胞易激性的增加，使气道气流阻力的增加从而引起阻塞性通气不足的现象，患者在临床表征上出现咳嗽喘息等症状。因此，气道高反应性可以反应过敏性哮喘尤其是过敏性哮喘疾病严重的程度的重要指标之一。对气道反应性的测定是诊断过敏性哮喘最有力的客观证据，可对过敏性哮喘病情的判定及疗效评估具有重要的临床意义。
[0100]
实验小鼠经过敏原ova致敏后，在激发阶段会导致实验小鼠产生明显的气道高反应(ahr)。本发明通过对过敏性哮喘小鼠进行ahr分析以此评估moc nps对气道炎症反应的疗效，如图13所示，利用不同浓度的乙甲酰胆碱(methacholine)吸入激发后，经moc nps治疗后的实验小鼠气道阻力对比ova模型组与blanknps组得到明显的改善，由此可以推断moc nps能够抑制呼吸道疾病的气道高反应。
[0101]
实验小鼠最后一次经过敏原ova激发后，在24小时内利用小鼠肺功能检测仪检测经不同浓度的乙甲酰胆碱(0、3、6、12、25、50mg/ml)雾化激发后实验小鼠气道阻力值的变化。此部分研究每组实验至少重复3次，曲线图数据以means
±
sem表示，与ova组比较，*p《0.001，每组样本数据都经过三次重复分析。
[0102]
4.2moc纳米颗粒抑制实验动物体内ova特异性ige水平
[0103]
已知血清ige升高是过敏性哮喘最直接的临床提示。当外源性过敏原ova进入机体时，机体进入对ova过敏原产生特异性致敏状态，免疫系统中的b淋巴细胞在抗原刺激下转化为浆细胞，产生能与过敏原ova发生特异性结合的ige抗体。ige对肥大细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞具有高度亲和性，能够与其细胞膜上的ige受体结合进而引起机体产生一系列病理反应，并释放与过敏反应相关的炎症活性介质。
[0104]
由此，本发明构建过敏性哮喘小鼠后，通过眼球取血收集实验小鼠血清，利用elisa实验测试小鼠血清中的ova特异性ige水平进一步评估moc nps对过敏性哮喘炎症反应的抑制作用。结果如图14所示，本发明可以观察到moc nps相比较致敏组(ova模型组、blanknps组)能够明显抑制过敏性哮喘小鼠血清中的ova特异性ige水平。
[0105]
按照动物伦理程序对小鼠进行眼球取血，4℃静置6小时候离心取上清，利用elisa实验测试血清中ova特异性ige水平。与ova组比较，*p《0.001。此部分研究每组实验至少重复3次，柱形图数据以means
±
sem表示，每组样本数据都经过三次重复分析。
[0106]
4.3moc纳米颗粒改善肺组织炎症
[0107]
从4.1的分析结果数据表明，气道病变显著增加了气流阻力，因此本发明切除实验小鼠肺组织进行病理切片分析，结果如图15所示，与naive组比较，致敏组(ova组及blanknps组)可见明显的支气管粘膜上皮水肿、管壁增厚，狭窄、形态不规则，周围有大量的炎症细胞浸润，经moc nps治疗后能够显著缓解支气管粘膜水肿变形、管壁增厚，抑制支气管周围炎症细胞浸润的病理状况。
[0108]
4.4moc纳米颗粒对实验动物肺嗜酸性粒细胞的影响
[0109]
过敏性哮喘是一种非特异性的呼吸道变态反应性炎症，呼吸道组织局部聚集嗜酸性粒细胞等多种炎症细胞，释放并活化多种炎症介质参与呼吸道变态反应性疾病的发生发展。本发明通过收集实验小鼠肺泡灌洗液(bronchial lavage fluid，balf)，经过甩片后进行瑞氏-吉姆萨染色。在光学显微镜下可观察到，与naive组比较，致敏组(ova组及blank nps组)可见数量明显增加的嗜酸性细胞细胞，而对比ova组及blanknps组，经moc nps治疗后显著性减少了肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量，可见moc nps能够抑制肺部炎性细胞的浸润。
[0110]
如图16所示，通过肺泡灌洗收集过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗液后，进行离心取细胞，将细胞数调整至5
×
104ml，涂片后经瑞氏-姬姆萨染色，利用嗜酸性粒细胞的形态特点进行细胞计数。a，光学显微镜下balf细胞经瑞氏-姬姆萨染色后结果图(
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400)；b，balf嗜酸性粒细胞计数百分比。与ova组比较，*p《0.001。此部分研究每组实验至少重复3次，柱形图数据以means
±
sem表示，每组样本数据都经过三次重复分析。
[0111]
4.5moc纳米颗粒促进treg细胞生成诱导机体免疫耐受
[0112]
在机体免疫系统中，免疫系统中的免疫细胞处于异常反应的状态，而过度的免疫炎症反应导致会引起局部组织损伤，如呼吸道鼻黏膜炎症及支气管炎症等；甚至也会造成处于过敏状态下的机体死亡。treg细胞是具有免疫抑制作用的一类t淋巴细胞亚群，在与其它亚群的免疫细胞相互作用的过程中能够通过细胞间的接触以及分泌免疫抑制性细胞因子，产生免疫应答反应识别并清除免疫系统中的有害物质，对机体免疫系统起到负性调节的作用。在机体处于过敏状态时，促进treg细胞在免疫系统中的生成，能够抑制机体免疫系统的过敏反应和提高对过敏原的主动耐受性，避免过敏性炎症疾病的发生发展。
[0113]
本发明之前的分析数据显示，moc nps能够在体外实验中诱导抗原特异性treg细胞的生成。因此，本发明将在体内实验进一步验证moc nps对实验小鼠肺部肺部组织treg细胞的生成的影响。由此，本发明通过提取实验小鼠肺组织单个细胞后，利用流式细胞术分析实验小鼠肺组织细胞中的treg细胞的比例，进一步评估moc nps对过敏性哮喘模型小鼠肺部组织treg细胞生成的调节作用。结果如图17所示，本发明观察到与naive组比较，ova组及blanknps组中肺组织treg细胞数量无明显差异，但经moc nps治疗后，实验小鼠肺组织中treg细胞数量与致敏组相比显著性增高，这证明moc nps能够通过有效的促进处于过敏状态下的机体肺组织中treg细胞的生成。
[0114]
如图17所示，取实验小鼠肺组织细胞，消化后成肺单个细胞，利用荧光抗体cd4-percp-cy5.5、cd25-pe、foxp3-apc标记treg细胞，进行流式细胞术检测。a，流式图中圈门内为cd4
+
cd25
+
foxp3
+
t细胞(treg)的比例；b，柱形图显示a流式图门控内th2细胞的计数(b)。条形图数据表示为每组6只小鼠的means
±
sem。与ova组比较，*p《0.001。与用生理盐水治疗的ova组相比(*)。每个实验至少重复3次。每组样本数据都经过三次重复分析。
[0115]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法包括：利用复乳法使mal-peg-plga负载cd83蛋白治疗剂形成cd83纳米颗粒后，将20mgcd83纳米颗粒悬浮在经过tcep处理后的、ph为7.4的mo融合蛋白溶液，4℃孵育过夜，偶联后形成具有靶向功能的moc纳米颗粒。2.如权利要求1所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法还包括：利用swissmodel软件分别分析cd83蛋白和mo融合蛋白的三维结构，并确定半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺基团反应的路径。3.如权利要求1所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法还包括：在moc纳米颗粒上构建选择目的细胞的装置；moc纳米颗粒携带促进产生抗原特异性调节性t细胞的材料，用于产生抗原特异性调节性t细胞；通过靶向抗原特异性t细胞促进treg细胞生成，实现气道粘膜免疫耐受功能重建。4.如权利要求1所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法包括以下步骤：步骤一，进行纳米颗粒负载的免疫调节性蛋白cd83的制备；步骤二，进行纳米颗粒靶向性分子mo融合蛋白的制备；步骤三，进行moc纳米颗粒的制备。5.如权利要求4所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述步骤一中的纳米颗粒负载的免疫调节性蛋白cd83的制备包括：利用原核表达系统对负载的核心免疫调节蛋白cd83进行诱导表达，并利用蛋白纯化工程技术进行蛋白纯化；从ncbi网站上获取cd83蛋白的基因序列并进行基因序列合成；将合成的cd83基因序列与质粒pet-32a进行重组，重组合成的质粒利用限制性内切酶mlui与xhoi对构建的重组质粒pet-32a-cd83进行双酶切鉴定；经琼脂糖凝胶电泳后，将重组质粒pet-32a-cd83转化至感受态细胞bl21，在37℃下利用iptg诱导cd83蛋白表达。6.如权利要求5所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述cd83蛋白的基因序列为accession：np001276844。7.如权利要求4所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述步骤二中的纳米颗粒靶向性分子mo融合蛋白的制备包括：利用mhc-ii-抗原肽复合物修饰拟构建的纳米颗粒；从ncbi网站上获取mhc-ii蛋白的基因序列后与ova抗原表位、柔性连接子共同进行基因序列合成；mhc-ii-ova抗原肽融合蛋白由mhc-ii通过连接子与ova抗原肽相连，在重组蛋白的c末端连接3个半胱氨酸形成具有靶向功能的mo融合蛋白；将mo基因序列与pet-28a表达质粒进行重组，利用限制性内切酶bamhi与xhoi对构建的重组质粒pet-28a-mo进行鉴定；经过琼脂糖凝胶电泳后，将重组质粒pet-32a-cd83转化至感受态细胞bl21，在37℃下诱导目的蛋白表达。8.如权利要求7所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述mhc-ii蛋白的基因序列为accession：1817375a，所述ova抗原表位的基因序列为iaimsalamvylgak，所述柔性连接子的基因序列为ggggs，所述半胱氨酸的基因序列ccc。
9.如权利要求4所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，其特征在于，所述步骤三中的moc纳米颗粒的制备包括：利用还原剂tcep还原mo融合蛋白c-末端的半胱氨酸后，使mal-peg-plga聚合物材料中的马来酰亚胺与mo融合蛋白c末端半胱氨酸经tcep还原后暴露出的巯基-sh进行反应，使mo融合蛋白与mal-peg-plga聚合物材料mal基团进行偶联，使mal-peg-plga纳米颗粒被具有靶向功能的mo融合蛋白修饰，从而具备靶向抗原特异性效应细胞的功能。10.一种实施如权利要求1～9任意一项所述的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法构建得到的用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗，其特征在于，所述用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗由纳米载体、核心治疗剂和mo融合蛋白组成；其中，所述纳米载体为mal-peg-plga，所述核心治疗剂为cd83蛋白，所述mo融合蛋白由ovat细胞抗原肽、mhc-ii、半胱氨酸和连接子组成。

技术总结
本发明属于纳米医学技术领域，公开了一种用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法，用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗由纳米载体、核心治疗剂和MO融合蛋白组成；用于气道粘膜免疫耐受功能重建的纳米疫苗构建方法包括：利用复乳法使Mal-PEG-PLGA负载CD83蛋白治疗剂形成CD83纳米颗粒后，将CD83纳米颗粒悬浮在经过TCEP处理后的MO融合蛋白溶液，孵育过夜，偶联后形成具有靶向功能的MOC纳米颗粒。本发明的新型的、具有良好的生物安全性的MOC纳米疫苗，是一种新型的、以去除哮喘发病为基础的、重建气道粘膜免疫耐受功能的新方法，可以重建气道粘膜免疫耐受功能。可以重建气道粘膜免疫耐受功能。可以重建气道粘膜免疫耐受功能。


技术研发人员：莫丽华 罗向前 智敏
受保护的技术使用者：南方医科大学深圳医院
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/12