用于检测刚地弓形虫的引物和探针及其应用、试剂和试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测刚地弓形虫的引物和探针及其应用、试剂和试剂盒。


背景技术：

2.刚地弓形虫遍布于世界各地，人群感染广泛。人感染弓形虫后，眼弓形虫病的发生率仅次于脑弓形虫病。弓形虫可在眼部引起局灶性坏死性视网膜炎或视网膜脉络膜炎，是后葡萄膜炎最常见的病因之一，相关临床和检验所对弓形虫的检测将对该病的防治有重要的实用价值。
3.刚地弓形虫(toxoplasma gondii，简称弓形虫)是一种呈世界性分布的专性细胞内寄生虫，广泛寄生于机体的有核细胞内，主要侵犯宿主的中枢神经系统、眼、淋巴结、肝和心等重要脏器。弓形虫病多数为先天性感染，80～90％的先天性弓形虫病伴有眼部疾病，是潜在的致盲眼病；后天获得性急性眼弓形虫病多为隐性感染。其预后主要取决于宿主的免疫力，正常人感染后可呈隐性或亚临床症状，而免疫缺陷的患者隐性感染的弓形虫活化可产生严重后果。由于人们生活习惯的改变，越来越多的人罹患眼弓形虫病。
4.眼弓形虫病(ocular toxoplasmosis，ot)被认为是感染性后葡萄膜炎最常见的原因之一。眼弓形体病是人体感染刚地弓形虫后，速殖子经血液传播跨越血-视网膜屏障进入眼部而引发的疾病。该病被认为是世界上最常见的视网膜感染性疾病，占后葡萄膜炎总病例的20-60％；在临床确诊的弓形虫感染病例中，眼弓形体病的发病率约为2％。在免疫功能正常的个体中，该疾病虽被认为“自愈性”疾病，但其危害仍不能忽视。该疾病除急性期所引起的坏死性视网膜炎造成的视力损害外，更大问题在于慢性期弓形虫包囊能够长期寄生在组织周围，存在疾病复发的风险，目前尚未发现有效的解决办法。眼弓形虫病易与其他类型葡萄膜炎混淆，临床上常被漏诊、误诊，可引起部分患者严重、不可逆性视功能损害。因此，加强和重视对该病的诊断非常重要。
5.目前弓形虫的鉴定方法主要有涂片染色法、动物接种分离法或细胞培养法、血清学检测、核酸检测等。涂片染色法简便，但检出率不高；动物接种分离法或细胞培养法是常用的细胞学检查方法，但较为困难和繁琐；血清学检测受个体免疫差异、抗体动力学影响，部分易受样本影响；以病原体特异性靶标基因为检测对象的核酸检测法灵敏度高、特异性强且检测快速，对于眼科感染性病原体的快速准确诊断具有很大的优势。
6.荧光定量pcr技术作为一种高灵敏度、高特异性、简便快速的检测方法已经在许多领域得到广泛应用。其优点包括：(1)高灵敏度，可检测低至1-5个拷贝数的病原体，有效避免漏检；(2)高特异性，在普通pcr的基础上增加高特异性的荧光探针，在同一反应管内同时检测多个靶标基因可进一步提高检测特异性，有效避免错检和漏检；(3)安全无污染，扩增反应和信号检测在同一个反应管内完成，不需要开盖操作，不容易产生气溶胶污染。
7.综上所述，刚地弓形虫的传统检测方式存在检测速度慢、诊断操作繁琐复杂、检出率不高的劣势，在临床上急需开发一种用于检测眼内液刚地弓形虫的方法以提供辅助诊
断。
8.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

9.本发明的第一目的在于提供一种用于检测刚地弓形虫的引物和探针，以解决上述问题中的至少一种。
10.本发明的第二目的在于提供上述引物和探针在制备刚地弓形虫检测产品中的应用。
11.本发明的第三目的在于提供一种用于检测刚地弓形虫的试剂。
12.本发明的第四目的在于提供一种用于检测刚地弓形虫的试剂盒。
13.第一方面，本发明提供了一种用于检测刚地弓形虫的引物和探针，所述引物包括第一引物对和第二引物对；
14.所述第一引物对具有如seq id no.1和seq id no.3所示的核酸序列；所述第二引物对具有如seq id no.6和seq id no.8所示的核酸序列；
15.所述探针包括第一探针和第二探针；
16.所述第一探针具有如seq id no.5所示的核酸序列；所述第二探针具有如seq id no.10所示的核酸序列。
17.作为进一步技术方案，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
18.作为进一步技术方案，所述荧光报告基团包括fam、vic、rox或cy5；
19.所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3或mgb。
20.第二方面，本发明提供了上述引物和探针在制备刚地弓形虫检测产品中的应用。
21.第三方面，本发明提供了一种用于检测刚地弓形虫的试剂，包括上述引物和探针。
22.第四方面，本发明提供了一种用于检测刚地弓形虫的试剂盒，包括上述引物和探针以及pcr反应预混液。
23.作为进一步技术方案，所述pcr反应预混液，包括：buffer、mg
2+
、dntps、热启动taq酶和ung酶。
24.作为进一步技术方案，还包括用于检测人内参基因的第三引物对和第三探针。
25.作为进一步技术方案，所述人内参基因包括rp基因；
26.所述第三引物对具有如seq id no.11和seq id no.12所示的核酸序列；
27.所述第三探针具有如seq id no.13所示的核酸序列。
28.作为进一步技术方案，还包括阳性质控品；
29.所述阳性质控品包括刚地弓形虫rep529基因片段、cox1基因片段和人内参rp基因片段；
30.所述rep529基因片段能够被第一引物对和第一探针识别和扩增；
31.所述cox1基因片段能够被第一引物对和第一探针识别和扩增；
32.所述rp基因片段能够被第三引物对和第三探针识别和扩增。
33.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
34.本发明提供的用于检测刚地弓形虫的引物和探针，能够特异性识别刚地弓形虫的
rep529基因和cox1基因，特异性强，灵敏度高，能够用于刚地弓形虫的检测，以及与刚地弓形虫感染相关疾病的辅助诊断。
35.本发明提供的用于检测刚地弓形虫的试剂或者试剂盒，特异性强，灵敏度高，检测周期短，对眼内弓形虫感染的早期快速准确诊断和控制极其重要。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
37.图1为刚地弓形虫tox-rep529-f1/r2/p1引物探针组检测结果图；
38.图2为刚地弓形虫tox-rep529-f1/r3/p1引物探针组检测结果图；
39.图3为刚地弓形虫tox-rep529-f2/r2/p1引物探针组检测结果图；
40.图4为刚地弓形虫tox-rep529-f2/r3/p1引物探针组检测结果图；
41.图5为刚地弓形虫tox-cox1-f1/r1/p1引物探针组检测结果图；
42.图6为刚地弓形虫tox-cox1-f1/r2/p1引物探针组检测结果图；
43.图7为刚地弓形虫tox-cox1-f1/r3/p1引物探针组检测结果图；
44.图8为刚地弓形虫检测靶标rep529灵敏度结果图；
45.图9为刚地弓形虫检测靶标cox1灵敏度结果图；
46.图10为各种不同病原体的特异性检测结果图；
47.图11为刚地弓形虫临床阳性样本检测结果图；
48.图12为刚地弓形虫临床阴性样本检测结果图。
具体实施方式
49.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
50.第一方面，本发明提供了一种用于检测刚地弓形虫的引物和探针，所述引物包括第一引物对和第二引物对；
51.所述第一引物对具有如seq id no.1和seq id no.3所示的核酸序列；所述第二引物对具有如seq id no.6和seq id no.8所示的核酸序列；
52.所述探针包括第一探针和第二探针；
53.所述第一探针具有如seq id no.5所示的核酸序列；所述第二探针具有如seq id no.10所示的核酸序列。
54.本发明提供的用于检测刚地弓形虫的引物和探针，为发明人经过大量实验筛选得到，能够特异性识别刚地弓形虫的rep529基因和cox1基因，特异性强，灵敏度高，能够用于
刚地弓形虫的检测，以及与刚地弓形虫感染相关疾病的辅助诊断。
55.在一些优选的实施方式中，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
56.在一些优选的实施方式中，所述荧光报告基团包括但不限于fam、vic、rox或cy5；所述荧光淬灭基团包括但不限于bhq1、bhq2、bhq3或mgb；或者采用本领域技术人员所熟知的其他荧光报告基团和荧光淬灭基团。
57.第二方面，本发明提供了上述引物和探针在制备刚地弓形虫检测产品中的应用。
58.本发明提供的用于检测刚地弓形虫的引物和探针，特异性强，灵敏度高，能够用于刚地弓形虫的检测，以及与刚地弓形虫感染相关疾病的辅助诊断。
59.第三方面，本发明提供了一种用于检测刚地弓形虫的试剂，包括上述引物和探针。
60.本发明提供的试剂包括上述引物和探针，因此具有上述引物和探针的全部有益效果。
61.第四方面，本发明提供了一种用于检测刚地弓形虫的试剂盒，包括上述引物和探针以及pcr反应预混液。将引物和探针以及pcr反应预混液混合，以获得pcr反应体系。
62.本发明提供的试剂盒包括上述引物和探针，因此具有上述引物和探针的全部有益效果。
63.在一些优选的实施方式中，所述pcr反应预混液，包括：buffer、mg
2+
、dntps、热启动taq酶和ung酶。
64.在一些优选的实施方式中，试剂盒检测的样品包括眼内液。
65.在一些优选的实施方式中，还包括用于检测人内参基因的第三引物对和第三探针。
66.通过设置内参，以提高检测的准确性。
67.在一些优选的实施方式中，所述人内参基因包括rp基因；
68.所述第三引物对具有如seq id no.11和seq id no.12所示的核酸序列；
69.所述第三探针具有如seq id no.13所示的核酸序列。
70.在一些优选的实施方式中，还包括阳性质控品；
71.所述阳性质控品包括刚地弓形虫rep529基因片段、cox1基因片段和人内参rp基因片段；
72.所述rep529基因片段能够被第一引物对和第一探针识别和扩增；
73.所述cox1基因片段能够被第一引物对和第一探针识别和扩增；
74.所述rp基因片段能够被第三引物对和第三探针识别和扩增。
75.下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
76.实施例1用于检测眼内液中刚地弓形虫的pcr引物探针组的筛选
77.1.病原体核酸快速提取，具体步骤如下：
78.1.1取50-200μl眼内液样本置于1.5ml离心管中，12000rpm离心1-5min，去上清液；
79.1.2加入100μl核酸抽提液(5％chelex-100/te混悬液)，90-100℃加热2-10min；
80.1.3 12000rpm离心1-5min，上清液即为眼内液病原体快速提取的核酸溶液，可直接用于pcr检测或-20℃保存备用。
81.2.引物探针组的设计，通过分析大量刚地弓形虫的基因序列，选择rep529和cox1基因作为刚地弓形虫检测的靶标基因，针对两个不同的检测靶标分别设计引物和探针，针对人内参rp基因设计相应的引物和探针，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，引物探针组序列信息如表1所示：
82.表1引物探针组序列表
83.名称序列序号修饰tox-rep529-f1cttggagccacagaagggacseqidno.1tox-rep529-f2cctgtgcttggagccacagseqidno.2tox-rep529-r2gcctycatctacagtcctgatseqidno.3tox-rep529-r3cacgccacccyctcatcctseqidno.4tox-rep529-p1aggggactacagacgcgatgccseqidno.55`fam，3`bhq1tox-cox1-f1agatacacgagcwtacttctcagseqidno.6tox-cox1-r1ctgcaytacccataactacaccseqidno.7tox-cox1-r2gcagcccataaatctaytgttcgseqidno.8tox-cox1-r3cctrtagtaccwcctagagtaaatseqidno.9tox-cox1-p1tgacaattatgattgctattcctacaggseqidno.105`vic，3`bhq1rp-f10catggcggtgtttgcagatttseqidno.11rp-r10agcggctgtctccacaagtcseqidno.12rp-p10acctgcgagcgggttctgacctseqidno.135`cy5，3`bhq3
84.(备注：y＝t/c，w＝a/t，r＝a/g)。
85.3.阳性质控模板合成：分别合成含目的扩增片段序列的质粒作为阳性质控，三个阳性质控分别命名为tox-rep529、tox-cox1和human-rp，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。
86.4.引物探针组的筛选：配制不同稀释浓度的阳性质控，使用针对各自检测靶标设计合成的不同引物探针组分别扩增对应的阳性质控，根据实验结果分析不同引物探针组的扩增性能并确定最优的引物探针组；
87.4.1荧光定量pcr反应体系如表2所示，pcr检测循环参数设置如表3所示；
88.表2荧光定量pcr反应体系
89.试剂反应体系(30μl)tris-hcl(500mm；ph8.3)1.2μlkcl(1m)1.5μlmgcl2(250mm)0.24μldatp(10mm)0.6μldctp(10mm)0.6μldgtp(10mm)0.6μldttp(10mm)0.6μldutp(10mm)1.2μltaq酶(5u/μl)0.6μlung酶(1u/μl)0.3μl
pcrforwardprimer(10μm)0.6μlpcrreverseprimer(10μm)0.6μlprobe(10μm)0.6μl模板5μl无菌纯化水补水至30μl
90.表3pcr检测循环参数设置
[0091][0092]
4.2刚地弓形虫检测靶标tox-rep529不同引物探针组筛选检测结果如图1、图2、图3和图4所示，由检测结果可知刚地弓形虫检测靶标tox-rep529最优的引物探针组为tox-rep529-f1/r2/p1，具体检测数据结果如表4所示：
[0093]
表4刚地弓形虫检测靶标tox-rep529引物探针组筛选数据结果(ct值)
[0094][0095]
4.3刚地弓形虫检测靶标tox-cox1不同引物探针组筛选检测结果如图5、图6和图7所示，由检测结果可知刚地弓形虫检测靶标tox-cox1最优的引物探针组为tox-cox1-f1/r2/p1，具体检测数据结果如表5所示：
[0096]
表5刚地弓形虫检测靶标tox-cox1引物探针组筛选数据结果(ct值)
[0097][0098]
4.4综合上述引物探针组的筛选结果，确定刚地弓形虫检测靶标tox-rep529、tox-cox1和人内参基因rp的引物探针组分别为tox-rep529-f1/r2/p1、tox-cox1-f1/r2/p1和rp-f10/r10/p10。
[0099]
5.多重荧光定量pcr反应体系的构建：使用上述所筛选的引物探针组进行多重荧光定量pcr反应体系的构建，最终的反应体系体积为30μl。多重荧光定量pcr反应体系组分
如表6所示，使用不同梯度稀释浓度的阳性质控进行检测，具体检测数据结果如表7所示；由实验结果可知检测靶标rep529和cox1的灵敏度均至少可达2copies/μl。
[0100]
表6多重荧光定量pcr反应体系组分表
[0101][0102][0103]
表7多重荧光定量pcr反应体系构建检测数据结果(ct值)
[0104][0105]
实施例2多重荧光定量pcr反应体系的方法学验证
[0106]
1.灵敏度验证，将阳性质控分别稀释成浓度为5copies/μl、2copies/μl和1copies/μl的模板，使用上述实施例1所构建的多重荧光定量pcr反应体系确定该检测方法的灵敏度，以重复检测20次且检出率≥95％的阳性质控浓度作为本检测方法的最低检出限；模板浓度为1copies/μl时，灵敏度检测结果如图8和图9所示，检测结果数据如表8和表9所示，可以看出，当阳性质控浓度为1copies/μl时，刚地弓形虫两个检测靶标的阳性检出率均≥95％；当阳性质控浓度低于1copies/μl时，阳性检出率低于95％；综合上述灵敏度检测结果可知，该发明建立的多重荧光定量pcr检测方法的灵敏度为1copies/μl(即
1000copies/ml)。
[0107]
表8刚地弓形虫检测靶标rep529灵敏度检测结果数据(阳性检出率＝100％)
[0108]
30.0033.3234.1634.0833.3233.1333.2933.7733.0434.3832.9832.4434.3633.3032.8731.1533.5033.4234.0932.98
[0109]
5表9刚地弓形虫检测靶标cox1灵敏度检测结果数据(阳性检出率＝95％)
[0110]
33.1532.4332.3033.3632.3232.1732.3532.47noct32.2433.1833.4533.3933.7731.3731.4632.3532.2031.4532.20
[0111]
2.特异性验证，以刚地弓形虫、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、a族链球菌、肺炎链球菌、大肠埃氏菌、白色念珠菌基因组dna为模板进行特异性验证；检测结果表明只有刚地弓形虫基因组dna可同时检测两个检测靶标rep529和cox1的特异性扩增，金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、a族链球菌、肺炎链球菌、大肠埃氏菌、白色念珠菌基因组dna均未出现扩增，特异性验证检测结果如图10所示。
[0112]
3.真实临床标本验证，使用本发明建立的多重荧光定量pcr反应体系检测经过临床鉴定的刚地弓形虫阴性样本(7例)和阳性样本(6例)；检测结果表明7例刚地弓形虫阳性样本均可同时检测出两个靶标基因阳性信号，检测结果如图11所示；而6例刚地弓形虫阴性样本中两个靶标基因检测均为阴性，内参基因检测为阳性，检测结果如图12所示。
[0113]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种用于检测刚地弓形虫的引物和探针，其特征在于，所述引物包括第一引物对和第二引物对；所述第一引物对具有如seq id no.1和seq id no.3所示的核酸序列；所述第二引物对具有如seq id no.6和seq id no.8所示的核酸序列；所述探针包括第一探针和第二探针；所述第一探针具有如seq id no.5所示的核酸序列；所述第二探针具有如seq id no.10所示的核酸序列。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团包括fam、vic、rox或cy5；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3或mgb。4.权利要求1-3任一项所述的引物和探针在制备刚地弓形虫检测产品中的应用。5.一种用于检测刚地弓形虫的试剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物和探针。6.一种用于检测刚地弓形虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物和探针以及pcr反应预混液。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应预混液，包括：buffer、mg
2+
、dntps、热启动taq酶和ung酶。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于检测人内参基因的第三引物对和第三探针。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述人内参基因包括rp基因；所述第三引物对具有如seq id no.11和seq id no.12所示的核酸序列；所述第三探针具有如seq id no.13所示的核酸序列。10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控品；所述阳性质控品包括刚地弓形虫rep529基因片段、cox1基因片段和人内参rp基因片段；所述rep529基因片段能够被第一引物对和第一探针识别和扩增；所述cox1基因片段能够被第一引物对和第一探针识别和扩增；所述rp基因片段能够被第三引物对和第三探针识别和扩增。

技术总结
本发明提供了一种用于检测刚地弓形虫的引物和探针及其应用、试剂和试剂盒，涉及生物技术领域。本发明提供的用于检测刚地弓形虫的引物和探针，引物包括第一引物对和第二引物对；第一引物对具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的核酸序列；第二引物对具有如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的核酸序列；探针包括第一探针和第二探针；第一探针具有如SEQ ID NO.5所示的核酸序列；所述第二探针具有如SEQ ID NO.10所示的核酸序列。该引物和探针，特异性强，灵敏度高，能够用于刚地弓形虫的检测，以及与刚地弓形虫感染相关疾病的辅助诊断。及与刚地弓形虫感染相关疾病的辅助诊断。及与刚地弓形虫感染相关疾病的辅助诊断。


技术研发人员：陆成慧 邓永杰
受保护的技术使用者：智德明创生物科技（无锡）有限公司
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/7/12