肌肉骨骼系统疾病的诊断用组合物、用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物及其用途

1.本发明涉及与肌腱(腱)(tendon)、韧带(ligament)、肌肉(muscle)、软骨(cartilage)、神经(nerve)及骨(bone)有关的zkscan8基因，涉及基于该基因在患有肌肉骨骼系统疾病的对象中减少，通过其过表达来促进肌肉骨骼系统组织及细胞的恢复的新发现，通过测量zkscan 8表达量及抑制其表达来诊断及治疗各肌肉骨骼系统疾病的方法。


背景技术：

2.根据美国的统计，每年发生两千万以上的肌肉骨骼系统的损伤，已知其最常见的病因为扭伤(sprains)、骨折(fractures)及挫伤(contusions)等。每年用于治疗上述肌肉骨骼系统损伤或疾病的支出约达1500亿美元。
3.在由于因这样的肌肉骨骼系统的老化(退行性变化)及外伤引起的炎症、部分断裂或完全断裂而导致损伤的情况下，除缝合损伤的手术治疗、用于症状缓解的类固醇注射等药物治疗及物理治疗法以外，未开发出特别的治疗方法。
4.尤其在药物治疗的情况下，仅限于通过缓解局部炎症并减少促炎因子来缓解，药物也主要是用吲哚美辛、酮洛芬、布洛芬、乙酰水杨酸及氟比洛芬等非甾体抗炎药(nsaids)和类固醇药物，已知长期使用上述非甾体抗炎药具有可能导致胃肠疾病的副作用，长期使用类固醇药物也诱发骨质疏松症、高血压、神经学并发症等副作用。
5.为了解决上述问题，能够通过更为根本的组织再生来治疗肌腱(腱)、肌肉、软骨、神经及骨等肌肉骨骼系统疾病的细胞治疗剂备受瞩目。
6.于是，以血管紧张素ii1型受体阻断剂(angiotensinⅱtype1receptor blocker)及脂肪组织来源干细胞为有效成分的肌肉治疗剂为人所公知，但无法通过血管紧张素受体阻断剂来决定干细胞的分化，其效果尚不明确，因此具有无法保证其效果的问题。
7.并且，众所周知的是，在肩袖损伤大鼠模型中，以骨髓来源间充质干细胞和脂肪组织来源间充质干细胞为有效成分的治疗剂提高肌腱的胶原组织和胶原纤维的结构化，提高肌腱的抗拉强度，但在这样的再生肌腱中观察到碱性磷酸酶的活性表达的增加以及诱导异位骨形成的异常的组织变化。这样的异常组织变化具有引起增加肌腱再次断裂的风险以及延缓恢复等的副作用的问题。
8.为了解决上述问题，应能够诱导正常的组织再生，为此，应在物理刺激、与其他细胞共培养、基因支架、转染生物活性物质或分化诱导基因的同时，向我们希望的方向控制间充质干细胞。
9.zkscan 8(具有krba和scan结构域8的锌指蛋白(zinc finger protein with krab and scan domains 8))为c2h2-znf(锌指蛋白(zinc finger))蛋白转录因子的一类，为在n-末端具有krab(kruppel-associated box)结构域和sre-zbp及scan(ctfin51,aw-1and number 18cdna)结构域的转录因子(图1a)。
10.据报告，锌指蛋白(zfp，zinc finger protein)具有多种生物学活性，尤其已知在
包括胚胎干细胞(esc)在内的多种初始祖细胞中被发现。已知znf 589、268、300给造血干细胞的分化带来影响。但至今仍无有关zkscan 8(znf 192，ld5-1，zscan 40)的生物学特性的报告，尤其是至今仍无有关zkscan 8在肌肉骨骼系统中的功能的研究。
11.于是，本发明为了克服现有技术的问题，不仅在肌肉骨骼系统疾病的诊断方面，还在治疗方面确认了zkscan 8的可能性，通过此确认到其在肌肉骨骼系统疾病的诊断、预防以及治疗中的效果，从而完成本发明。
12.本说明书全文中参考的论文及专利文献多数都标出其引用。引用的论文及专利文献中公开的内容全部作为参考结合在本说明书中，从而更为明确本发明所述技术领域的水平及本发明的内容。
13.现有技术文献
14.专利文献
15.专利文献1：韩国授权专利第1219624号。


技术实现要素：

16.技术问题
17.本发明人多番致力于发掘与肌肉骨骼系统疾病，具体地，为了发掘与肌腱(腱)、肌肉、软骨、神经及骨疾病相关的生物标记物。结果，不仅确认到zkscan 8在肌腱(腱)、肌肉、软骨、神经(nerve)及骨疾病中减少，还确认到可以通过zkscan 8的过表达来预防、改善或治疗肌肉骨骼系统疾病，从而完成本发明。
18.因此，本发明的目的在于，提供肌肉骨骼系统疾病的诊断用组合物。
19.本发明的再一目的在于，提供一种提供用于肌肉骨骼系统疾病的诊断的信息的方法。
20.本发明的还有一目的在于，提供用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物。
21.本发明的另一目的在于，提供用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物的筛选方法。
22.本发明的又一目的在于，提供组合物在制备治疗肌肉骨骼系统疾病的药物或动物用药物中的新用途，上述组合物包含zkscan 8基因、包含上述基因的载体、包含上述载体的细胞或其培养液作为有效成分。
23.本发明的其他目的及优点将通过下述发明的详细说明、发明要求保护范围以及附图得以进一步明确。
24.技术方案
25.根据本发明的一实施方式，本发明提供一种肌肉骨骼系统疾病诊断用组合物，包含测量zkscan 8基因或由上述基因编码的蛋白质的表达水平的制剂作为有效成分。
26.本发明人为了发掘在提供用于诊断肌肉骨骼系统疾病，具体地，在提供用于诊断肌腱(腱)、肌肉、软骨、神经及骨疾病的综合性且可靠度高的信息的同时可以在无组织试样的情况下仅通过体液检查来简单地测量的生物标记物而多番努力研究。结果，不仅发现zkscan 8在肌肉骨骼系统中特异性地表达，还发现若发生肌肉骨骼系统损伤或疾病，则其表达减少，通过此提供有关肌肉骨骼系统疾病的发病与否及疾病发展阶段的信息，从而可以作为能够诊断肌肉骨骼系统疾病的优秀的生物标记物。
27.本说明书中的术语“诊断”包括个体对特定疾病的敏感性(susceptibility)的判断、对个体现在是否患有特定疾病的判断以及对患有特定疾病的个体的预后(prognosis)的判断。本发明的zkscan 8基因或由上述基因编码的蛋白质的表达水平不仅是现在是否发病的标记物，还是有关发病风险的遗传标记物，通过其检测来提供现在是否患有肌肉骨骼系统疾病的判断以及虽然个体尚未患肌肉骨骼系统疾病但未来发病的可能性相关的预后(prognosis)的判断的信息。因此，术语“肌肉骨骼系统疾病的诊断”也可以表达为“肌肉骨骼系统疾病的发病风险的预测”。
28.本说明书中的术语“肌肉骨骼系统疾病的诊断用组合物”是指包括为了判断对象的肌肉骨骼系统疾病的发病与否而测量zkscan 8基因或由上述基因编码的蛋白质的表达水平的手段在内的统合的混合物(mixture)或设备(device)，因此，也可以表达为“肌肉骨骼系统疾病的诊断用试剂盒”。
29.根据本发明的具体实例，zkscan 8蛋白为c2h2-znf(锌指蛋白)蛋白转录因子的一类，为在n-末端具有krab结构域和sre-zbp及scan结构域的转录因子。
30.上述zkscan 8基因可以由序列1来表示，在nbci中，基因命名(gene symbol)可以为zkscan 8，可以为以gene id 7745登记的碱基序列。其最佳化的序列可以由序列3来表示。
31.由上述zkscan 8基因编码的蛋白质可以为以ncbi accession number np_001265048登记的氨基酸序列，可以由序列2来表示。
32.根据本发明的具体实例，由本发明的组合物诊断的肌肉骨骼系统疾病是指因肌肉骨骼系统(肌腱、韧带、肌肉、软骨、神经及骨等)的负担运动发生的颈部与腰部、上下肢的神经、肌肉及其周围身体组织等处出现的疾病。更具体地，上述肌肉骨骼系统疾病为选自由肌腱(肌腱)疾病、韧带疾病、肌肉疾病、软骨疾病、神经疾病及骨疾病组成的组中的一种以上，优选地，为肌腱疾病或韧带疾病，更具体地，可以为肌腱疾病。
33.上述肌腱疾病可以为因过度使用或老化发生的机件磨损引起撕裂而发生的肌腱的慢性障碍或损伤，或者可以通过因肌腱断裂或肌腱从骨上分离而发生的急性肌腱损伤来诱发。
34.上述肌腱疾病可以为选自由肌腱损伤(tendon injury)、肌腱断裂(tendon rupture)、肌腱炎(tendinitis)、肌腱变性(tendinosis)及腱鞘炎(tendosynovitis)组成的组中的一种以上。
35.肌腱断裂为因使肌肉附着于骨上的作为纤维性绳带的肌腱(腱)的一部分撕裂或全部断裂引起分为两个组织而诱发的疾病，可以为选自由跟腱断裂(acute achilles tendon rupture)及膑腱断裂(patellar tendon rupture)组成的组中的一种以上。
36.肌腱炎为当向肌腱单位(musculotendinous unit)施加突发且过度的负荷时，由因肌腱的微撕裂(micro tear)发生的肌腱自身的炎症诱发的疾病，可以为选自由胫骨结节骨骺炎(osgood schlatter)、腱鞘炎(tenosynovitis)、钙化性肌腱炎(calcific tendinitis)、髌腱炎(patellar tendinitis)、跟腱炎(achilles'tendonitis)、肱二头肌肌腱炎(biceps tendinitis)、肩袖肌腱炎(rotator cuff tendinitis)、外上髁炎(lateral epicondylitis)、冈上肌肌腱炎(supraspinatus tendinitis)、三头肌肌腱炎(triceps tendonitis)及内上髁炎(medial epicondylitis)组成的组中的一中以上。
37.肌腱变性为由因慢性的过度使用(overuse)引起的肌腱自身胶原的退行性变化而发生的非炎症或慢性炎症诱发的疾病，可以为选自由跟腱变性(achilles tendinopathy)、膑腱变性(patella tendinopathy)及肱二头肌肌腱变性(bicipital tendinopathy)组成的组中的一种以上。
38.上述韧带疾病可以为选自由股四头肌韧带断裂(knee quadriceps ligment rupture)、冠状韧带扭伤(coronary ligment sprain)、副韧带损伤(collateral ligament rupture)、前交叉韧带损伤(anterior cruciate ligament injury)、后交叉韧带损伤(posterior cruciate ligament injury)、踝关节韧带损伤(ankle ligament injury)、韧带断裂(ligment rupture)及扭伤(sprain)组成的组中的一种以上。
39.上述肌肉疾病为因由肌肉的直接、间接外伤、过负荷及过度使用诱导的损伤而发生的疾病，包括因肌肉减少、肌肉萎缩、肌肉损伤、肌肉紧张、肌肉破裂、肌肉损耗或肌肉退化诱发的疾病的范围。上述肌肉疾病有大腿肌肉紧张(肌肉破裂)、肌肉组织损伤、肩袖破裂、腘绳肌损伤、肋锁综合征(costoclavicular syndrome)、股四头肌肌腱炎(knee quadriceps tendinosis)等。
40.上述软骨疾病是指因软骨、软骨组织和/或关节组织(滑膜、关节囊、软骨下骨等)因受到机械刺激或炎症反应受到伤害而发生的疾病，包括软骨损伤疾病。上述软骨疾病可以选自软骨退行性关节炎(degenerative arthritis)、髌骨骨折(patella fracture)、炎症性关节炎(inflammatory arthritis)、髌骨软骨软化症(patella chondromalacia)、骨软骨瘤病(osteochondromatosis)、扭伤(distortion)、滑囊炎(bursitis)、半月板损伤(meniscal injury)、圆盘形半月板撕裂(meniscal tear)、半月板囊肿(meniscus cyst)、关节内琉璃体(intra-articular vitreous)、剥脱性骨软骨炎(exfoliation osteochondritis)、滑膜皱襞综合征(plica syndrome)、膝内翻(genu varum)、膝外翻(knock-knee)及膝关节响(snapping knee)组成的组中。
41.根据本发明的具体实例，使用本发明的组合物诊断的肌肉骨骼系统疾病为肌腱疾病。根据本发明，基于in-silico分析作为本发明的生物标记物的zkscan 8的结果，不但确认到与肌肉骨骼系统(肌腱、韧带、肌肉、骨、软骨、神经等)的生成及发育有关，而且，肌腱变性动物模型的试样分析结果确认到其表达随肌腱变性的进展减少(参照图3)。因此，本发明的zkscan 8可以提供有关肌肉骨骼系统疾病的发病与否的信息。
42.根据本发明的具体实例，测量上述zkscan 8基因的表达水平的制剂为与上述zkscan 8基因特异性结合的核酸分子。
43.在本说明书中，术语“核酸分子”具有包括脱氧核糖核酸(dna)(基因组脱氧核糖核酸(gdna)及互补脱氧核糖核酸(cdna))以及核糖核酸(rna)分子的含义，核酸分子中基本结构单位核苷酸不仅包括自然的核苷酸，还包括糖或碱基部位变形的相似物(analogue)(scheit,nucleotide analogs,john wiley,new york(1980)；uhlman及peyman,chemical reviews,90:543-584(1990))。“与zkscan 8基因特异性结合的核酸分子”是指因具有与本发明的zkscan 8基因实质上互补性的碱基序列而可以特异性地杂交的核酸分子，例如，包括引物及探针。
44.本说明书中的术语“引物”是指在诱导与核酸链(模板)互补性的引物延伸产物的合成的条件下，即，在核苷酸与脱氧核糖核酸聚合酶等脱氧核糖核酸聚合剂的存在、适当的
温度和ph的条件下起到合成的开始作用的寡核苷酸。具体地，引物为脱氧核糖核苷酸单链。本发明中使用的引物可以包括天然的(naturally occurring)脱氧核糖核苷酸(dnmp)(即，damp、dgmp、dcmp及dtmp)、变型核苷酸或非天然核苷酸，还可以包括核糖核苷酸。
45.本发明的引物可以为在目标核酸中退火来通过模板依赖性核酸聚合酶与目标核酸形成互补序列的延伸引物(extension primer)，它延伸至固定的探针退火的位置来占据探针退火的位置。
46.本发明中使用的延伸引物包括与目标核酸，例如，与zkscan 8基因的特定碱基序列互补的杂交核苷酸序列。术语“互补”是指在规定的退火或杂交条件下使引物或探针与目标核酸序列选择性杂交的充分的互补，使包括实质互补(substantially complementary)的情况及完全互补(perfectly complementary)的情况，具体地，是指完全互补的情况。本说明书中的术语“实质上互补的序列”不仅包括完全一致的序列，还包括在能够在特定序列中通过退火来起到引物作用的范围内的与比较对象的序列部分不一致的序列。
47.在本发明中，引物应具有能够在聚合剂的存在下引发延伸产物的合成的充分的长度。引物适当的长度根据多个因素，例如温度、ph及引物的来源(source)来确定，但典型地为15个-30个核苷酸。短的引物分子为了与模板形成充分稳定的混合复合物，通常需要更低的温度。这样的引物的涉及可以通过相关技术人员参照目标核苷酸序列来轻易实施，例如，可以利用引物设计用程序(例如primer 3程序)。
48.本说明书中的术语“探针”是指能够与特定核苷酸序列杂交的包括脱氧核糖核苷酸及核糖核苷酸在内的自然或变形的单体或具有结合的线型低聚物。具体地，为了在杂交中的最大效率，探针为单链，更具体地，为脱氧核糖核苷酸。本发明中使用的探针可以使用与上述zkscan 8基因的特定碱基序列完全(perfectly)互补的序列，还可以在不妨碍特异性杂交的范围内使用实质上(substantially)互补的序列。通常，通过杂交形成的二倍体杂交(duplex)的稳定性取决于末端的序列一致性，因此，以在目标序列的3＇-末端或5＇-末端使用互补性的探针为佳。
49.适合杂交的条件可以参照joseph sambrook,et al.,molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,n.y.(2001)及haymes,b.d.,et al.,nucleic acid hybridization,a practical approach,irl press,washington,d.c.(1985)中记载的事项来确定。
50.根据本发明的具体实例，上述测量由zkscan 8基因编码的蛋白质的表达水平的制剂为与由zkscan 8基因编码的蛋白质特异性结合的抗体或适体。
51.本说明书中的术语“抗体”是指指示抗原性部位的特异性的蛋白质分子，本发明的目标抗体是指能够与由zkscan 8基因编码的蛋白质特异性结合的抗体，可以包括多克隆抗体、单克隆抗体及重组抗体等。不仅如此，还可以包括人类化抗体等特殊抗体。上述抗体可以包含抗体分子的功能性片段，包括具有2个全长的轻链及2个全长的重链的完全形态。抗体分子的功能性片段是指至少保有抗原结合功能的片段，可以为fab、f(ab')、f(ab')2及fv等。上述抗体只要是利用本发明所属技术领域的普通技术人员公知的技术制备的就都可以使用。
52.本说明书中的术语“适体”是指由其自身具有稳定的三维结构的情况下具有与目标分子具有高亲和性并能够特异性结合的特征的特殊种类的单链核酸(脱氧核糖核酸
(dna)、核糖核酸(rna)或变形核酸)构成的多核苷酸的一种。如上所述，适体由能够与抗体一样与抗原物质特异性结合的比蛋白质的稳定性高、结构简单并且易于合成的核苷酸构成，可以替代抗体来使用。
53.适体的一般性的内容在bock lc et al.,nature 355(6360):5646(1992)；hoppe-seyler f,butz k"peptide aptamers:powerful new tools for molecular medicine".j mol med.78(8):42630(2000)；cohen ba,colas p,brent r."an artificial cell-cycle inhibitor isolated from acombinatorial library".proc natl acad sci usa.95(24):142727(1998)中详细公开。
54.根据本发明的具体实例，本发明的诊断用组合物可以为选自由尿液、唾液、精液、泪液、羊水(amniotic fluid)、脑脊髓液(cerebrospinal fluid)、滑膜液(synovial fluid)、心包液(pericardial fluid)、腹水(peritoneal fluid)、血液、血浆及血清组成的组中的一种以上体液，或者可以为从肌肉骨骼系统中分离的组织或细胞。最具体地，为从肌肉骨骼系统中分离的组织或细胞。
55.根据本发明，可以通过测量本发明的zkscan 8的浓度来诊断肌肉骨骼系统疾病。通过此，本发明通过组织检查提供可靠度高的临床信息，从而可以实现患者的便利性、程序的简便性和经济性。
56.根据本发明的再一实施方式，本发明提供包括如下步骤的提供肌肉骨骼系统疾病的诊断所需的信息的方法：步骤1)，在从怀疑患有肌肉骨骼系统疾病的个体中分离的生物试样中测量zkscan 8基因或由上述基因编码的蛋白质的表达水平；以及步骤2)，比较上述测量的zkscan8基因或由上述基因编码的蛋白质的表达水平与正常对照组试样的表达水平。
57.有关本发明中所要诊断的肌肉骨骼系统疾病的内容已在上述内容中叙述，为避免过度的重复，将省略其记载。
58.本发明中的术语“生物试样”是指从包括人类在内的哺乳动物中获得的包含表达zkscan 8的细胞的所有试样，包括组织、器官、细胞或细胞培养液，但不限定于此。更具体地，上述表达zkscan 8的细胞为构成肌肉骨骼系统的组织或细胞，最具体地，为肌腱细胞、韧带组织、韧带细胞。
59.对上述zkscan 8基因或编码其的蛋白质的表达水平的检测可以利用对zkscan 8具有特异性的引物、探针、抗体、适体进行。
60.在从怀疑患有肌肉骨骼系统疾病的个体中分离的生物试样中测量zkscan 8的表达水平的步骤可以通过杂交法、免疫分析法或基因扩增方法等相关行业公知的多种测量表达水平的方法来进行。但不特别限定于此。若测量结果为zkscan 8的表达水平减少，则可以提供诊断及判定上述个体患有肌肉骨骼系统疾病所需的信息。
61.在本发明中，怀疑患有肌肉骨骼系统疾病的个体为已经发病或预想将要发病的个体或组织的试样，是指要诊断其病症的对象试样。
62.并且，本发明中的“正常对照组”是指未罹患所要检测的肌肉骨骼系统疾病的个体。
63.本说明书中的术语“表达水平的减少”是指因肌肉骨骼系统疾病引起zkscan 8表达的显著减少。
64.根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含zkscan 8蛋白作为有效成分的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物。
65.根据本发明的另一实施方式，本发明提供用于预防及治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，包含含有zkscan 8基因的载体、包含上述载体的细胞或其培养液作为有效成分。
66.上述组合物为zkscan 8蛋白的新用途，上述用途可以涉及预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的用途。
67.上述zkscan 8基因可以由序列1表示，在nbci中，基因命可以为zkscan 8，可以为以gene id 7745登记的碱基序列。由上述zkscan8基因编码的蛋白质可以为以ncbi accession number np_001265048登记的氨基酸序列，可以由序列2来表示。zkscan 8基因最佳化的序列可以由序列3来表示。
68.根据本发明的一实例，当向肌腱损伤大鼠处理过表达zkscan 8的细胞时，确认到与未做任何处理的大鼠相比，因肌腱组织损伤引起的非正常的行动状态减少，肌腱组织的恢复得到促进。随着肌肉骨骼系统疾病中zkscan 8表达的增加，可以观察到用于解决肌肉骨骼系统疾病的病理过程的如恢复胶原排列等的一连补偿作用，因此，包含zkscan8基因或蛋白的组合物可以示出预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的效果。
69.在本发明中，上述zkscan 8蛋白中可以包含其变异体或功能性同等物。上述蛋白变异体或功能性同等物通过氨基酸的附加、取代或缺失来与zkscan 8蛋白的氨基酸序列具有60％以上的序列同源性，优选地，具有70％以上的序列同源性，更优选地，具有80％以上的序列同源性，是指示出与本发明的zkscan 8蛋白实质上相同的活性的多肽。上述功能性同等物可以包括例如zkscan 8蛋白的氨基酸序列的氨基酸中的一部分被取代、缺失或附加的氨基酸序列变异体。优选地，氨基酸的取代可以为保护性取代，天然存在的氨基酸的保护性取代的例如下：脂肪族氨基酸(gly、ala、pro)、疏水性氨基酸(ile、leu、val)、芳香族氨基酸(phe、tyr、trp)、酸性氨基酸(asp、glu)、碱性氨基酸(his、lys、arg、gln、asn)及含硫氨基酸(cys、met)。优选地，氨基酸的缺失可以位于与本发明的zkscan 8蛋白的活性无直接关联的部分。并且，优选地，上述功能性同等物的范围还可以包括zkscan 8蛋白的基本骨架及保持其生理活性的情况下多肽的一部分化学结构变形的多肽衍生物。例如，可以包括用于变更本发明的zkscan 8蛋白的稳定性、储存性、挥发性或溶解度等的结构变更及在保持生理活性的情况下与其他蛋白质融合来制备的融合蛋白等。
70.并且，本发明zkscan 8蛋白能够以其自身或药学上可接受的盐的形态来使用。在本发明中，“药学上可接受的”是指在生理学上可接受的，在向人类给药时不妨碍活性成分的作用且通常不引起胃肠障碍、头晕等过敏反应或与之相似的反应。优选地，上述盐为通过药学上可接受的游离酸(free acid)形成的酸附加盐，游离酸可以使用有机酸和无机酸。上述有机酸包括柠檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸及天冬氨酸，但不限定于此。并且，上述无机酸包括盐酸、溴酸、硫酸及磷酸，但不限定于此。
71.在本发明中，上述zkscan 8蛋白或其片段可以从天然中提取或合成(merrifleld,j.amer.chem.soc.85:2149-2156,1963)，或者可以通过基于脱氧核糖核酸序列的基因重组方法来制备(sambrook et al,molecular cloning,cold spring harbor laboratory press,new york,usa,第二版,1989)。
72.在本发明中，上述载体可以为选自由线状脱氧核糖核酸、质粒脱氧核糖核酸及重组病毒载体组成的组中的一种以上，上述病毒可以为选自由逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒及慢病毒组成的组中的一种以上。
73.将本发明的载体向宿主细胞内运输的方法有例如微注射法(harland and weintraub,j.cell biol.101:1094-1099(1985))、磷酸钙沉淀法(chen and okayama,mol.cell.biol.7:2745-2752(1987))、电穿孔法(tur-kaspa et al.,mol.cell biol.,6:716-718(1986))、脂质体介导的转染法(nicolau et al.,methods enzymol.,149:157-176(1987))、deae-葡聚糖处理法(gopal,mol.cell biol.,5:1188-1190(1985))以及基因枪(yang et al.,proc.natl.acad.sci.,87:9568-9572(1990))，但不限定于此。
74.包含上述载体的细胞可以为选自由干细胞(stem cells)、树突状细胞(dendritic cells)、自体肿瘤细胞(autologous tumor cells)及已建立的肿瘤细胞(established tumor cells)组成的组中的一种以上，但不限定于此。
75.本发明中的术语“干细胞”为具有能够分化为多种身体组织的能力的未分化细胞，可以分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stem cell)、多分化能干细胞干细胞(multipotent stemcell)等。上述干细胞可以与前体细胞(precursor cell)、祖细胞(progenitor cells)等术语混用。在本发明中，干细胞可以为胚胎干细胞(embryonic stem cell，esc)、诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cell，ipsc)或间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)，更具体地，可以为间充质干细胞。
76.上述间充质干细胞可以为源自骨髓、脂肪、脐带或脐带血的间充质干细胞。优选地，上述间充质干细胞可以为脐带来源间充质干细胞。
77.有关在本发明中作为诊断或治疗对象的肌肉骨骼系统疾病的内容已在上述内容中叙述，为避免过度的重复，将省略其记载。
78.本说明书中的术语“预防”是指虽未诊断对象患有疾患或疾病，但在具有患这样的疾患或疾病的对象中抑制疾病或疾病的发病的行为。
79.本说明书中的术语“治疗”是指如下含义：(a)抑制疾患、疾病或症状的发展；(b)减轻疾患、疾病或症状；或者(c)消除疾患、疾病或症状。若向对象给药本发明的组合物，则起到通过促进或激活zkscan 8的表达来促进向肌肉骨骼系统的分化，或者通过肌肉骨骼系统组织的恢复和诱导胶原的形成来抑制肌肉骨骼系统疾病症状的发展或者消除或减轻症状的作用。因此，本发明的组合物自身可以作为肌肉骨骼系统疾病的治疗组合物，或者也可以与其他药理成分一同给药来应用为对上述疾病的治疗辅助剂。因此，本说明书中的术语“治疗”或“治疗剂”包括“治疗辅助”或“治疗辅助剂”的含义。
80.本说明书中的术语“给药”或“向
…
给药”是指通过向对象直接给药本发明的组合物的治疗有效量来在对象的体内形成相同的量。
81.本发明中的术语“治疗有效量”是指组合物内包含用来充分地向所要给药本发明的组合物的个体提供充分的治疗或预防效果的药理成分的组合物的含量，其中包括“预防有效量”的含义。
82.本说明书中的术语“对象”不受限制地包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴。具体地，本发明的对象为人。
83.根据本发明的具体实例，向上述pscaav载体插入序列1的zkscan8基因来制备表达
载体并将其命名为
‘
pscaav-zkscan 8’，其图谱如图1b所示。通过将上述制备的表达载体转染到人脐带来源间充质干细胞(umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells，ucmsc)内来向细胞中导入。若处理过表达zkscan 8的脐带来源间充质干细胞，则增加肌腱的最大断裂负荷和刚性。并且，若处理过表达zkscan 8的脐带来源间充质干细胞，则显出抑制肌腱组织的炎症、防止退行性变化、恢复胶原纤维的排列以及抑制异位软骨形成的效果。即，可知当将过表达zkscan8的脐带来源间充质干细胞应用在全层断裂损伤时，可以使损伤的肌腱的缺损组织再生并预防肌腱功能的损伤并恢复及提高肌腱功能。因此，本发明的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物增加zkscan 8的表达或活性。
84.根据本发明的又一实施方式，本发明提供包括如下步骤的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物的筛选方法：步骤(a)，使损伤的肌腱(腱)、韧带、肌肉、软骨、或骨细胞与试验物质接触；以及步骤(b)，测量上述试样中的zkscan 8的表达水平。
85.在上述步骤(b)中，若zkscan 8的表达水平相比于正常对照组增加，则上述试验物质判定为用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物。
86.有关在本发明中作为诊断或治疗对象的肌肉骨骼系统疾病的内容已在上述内容中叙述，为避免过度的重复，将省略其记载。
87.本发明中的术语“损伤的肌腱(腱)、韧带、肌肉、软骨、骨、神经细胞”是指从包括人类在内的哺乳动物中获得的包括zkscan 8的表达降低的肌肉骨骼系统细胞在内的所有试样。上述损伤的肌腱(腱)、韧带、肌肉、软骨、骨或神经细胞可以从因外部的压力、操作、断裂、撕裂、骨折炎症等引起损伤的肌肉骨骼系统组织或器官中获得，包括细胞或细胞培养液。更具体地，可以为上述损伤的肌腱(腱)、韧带、肌肉、软骨、骨或神经细胞，其中，优选地，可以为肌腱细胞或韧带细胞。
88.在提及本发明的筛查方法时使用的术语“试验物质”是指为了通过向包含表达zkscan 8的细胞的试样中添加来检查是否给zkscan 8的表达水平带来影响而筛选时使用的未知物质。上述试验物质包括化合物、核苷酸、肽以及天然提取物，但不限定于此。在处理试验物质的生物试样中测量zkscan 8的表达水平的步骤可以通过本发明所属技术领域中公知的多种测量表达水平的方法来进行。若测量结果为zkscan 8的表达水平增加，则可以判定上述试验物质为用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物。
89.本说明书中的术语“表达水平的增加”通过试验物质使zkscan 8基因的表达显著增加，从而使zkscan 8的表达水平或生物体内固有的功能增加以使受损的肌肉骨骼系统组织的恢复作用到达可测量的水平。
90.发明的效果
91.归纳本发明的特征及优点如下：(a)本发明提供肌肉骨骼系统疾病的诊断用组合物、用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物及其筛选方法；(b)本发明的zkscan 8可以有效用作能够获得有关肌肉骨骼系统疾病，具体地，有关肌腱疾病或韧带疾病的发病与否及发展阶段的正确的信息的生物标记物；(c)本发明的组合物还可以通过zkscan 8的过表达来有效用作用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物。
附图说明
92.图1a示出有关zscan家族(family)的结构的模型。
93.图1b为pscaav-zkscan 8的图谱。
94.图1c为示出pscaav-gfp载体和pscaav-zkscan 8载体的结构的示意图。
95.图2为在胚胎发育的不同阶段(e9.5至e15.5)中整理数据集(dataset)的分布的表。
96.图3a为通过分析根据胚胎发育的不同阶段的表达类型的肌腱生成标记物和zkscan 8的表达状态来示出的柱状图。
97.图3b为通过测量在人类正常肌腱(normal)和患有肩袖疾病的患者的肌腱(肌腱损伤(tendinopathy))中肌腱生成标记物和zkscan 8的表达状态来示出的柱状图。
98.图4a为通过显微镜观察zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)的图像。
99.图4b为通过测量zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)的增殖能力来以定量的方式示出的柱状图。
100.图4c为通过实时逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)测量有关zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)的zkscan 8基因表达与否来示出的柱状图。
101.图4d为通过免疫印迹法(western blotting)分析在zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)中zkscan 8蛋白表达与否的结果。
102.图4e为通过免疫印迹法分析在zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)中zkscan 8蛋白的表达与否来定量化的柱状图。
103.图5a至图5d为评估zkscan 8的过表达是否给肌腱的分化带来影响的图。图5a为在肌腱分化培养基中培养脐带来源间充质干细胞(ucmsc)2周后，通过实时逆转录聚合酶链式反应分析各不同培养天数的zkscan 8表达水平来定量化的柱状图。
104.图5b为培养zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)7天后，通过定量实时逆转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)分析各不同培养天数的肌腱发生转录因子(scx、mkx、egr-1、egr-2)的表达水平的柱状图。
105.图5c为在肌腱分化培养基中通过三次培养法培养zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)3天后，通过定量实时逆转录聚合酶链式反应分析肌腱相关标记物(scx、egr-1、egr-2、thbs4)的表达水平的柱状图。
106.图5d为在肌腱分化培养基中通过三次培养法培养zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)3天时，分析肌腱分化诱导的组织学特性的结果。
107.图6为在zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)中分析脂肪、骨、软骨、肌腱、肌肉、神经细胞的相关标记物的表达状态的结果。
108.图7a为在开始有关正常组(normal group)、生理盐水组(saline group)、脐带来源间充质干细胞(msc group)及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组(msc-zk8 group)的实验第2周及第4周时的冈上肌腱的宏观状态。
109.图7b为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析有关冈上肌腱的宏观总分(the total macroscopic score)结果。所有定量数据以平均数
±
标准误(s.e.m)来表示(*p＜0.05)。
110.图8a为在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入
脐带来源间充质干细胞组的实验的第2周及第4周时对冈上肌腱进行苏木精伊红(h&e)染色的照片(倍率：
×
100)。
111.图8b为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析冈上肌腱的退行性总分(the total degeneration score)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
112.图9a为在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时使用psr染色冈上肌腱的照片(倍率：
×
100)。
113.图9b为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析冈上肌腱的胶原纤维的排列(collage fiber coherence)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
114.图10a为在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时使用saf-o染色冈上肌腱的照片(倍率：
×
100)。
115.图10b为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析冈上肌腱的糖胺聚糖丰富区域(gag-rich area)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
116.图11为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析冈上肌腱的异位骨化区域(area of ossification)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
117.图12为拍摄从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的标本和生物力学实验过程的照片。
118.图13a为示出分析从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的再生的肌腱的最大断裂负荷(the ultimate failure load)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
119.图13b为示出分析从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的再生的肌腱的刚性(the stiffness)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
120.图13c为示出分析从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的再生的肌腱的最大应力(ultimate stress)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
121.图13d为示出分析从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的再生的肌腱的横截面积(cross-sectional area)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
具体实施方式
122.以下，通过实施例更为详细地说明本发明。本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例。
123.实施例
124.实验方法
125.筛选及选择基因
126.为了探索与肌肉骨骼系统疾病相关的生物标记物，为了筛选肌腱再生候补基因，从美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information(ncbi))的高通量基因表达(gene expression omnibus(geo))数据库(database)(http://www.ncbi.nlm.gov/geo/)中下载有关小鼠腿(limb)的肌腱发生的全转录组表达谱微阵列数据集(whole transcriptome expression profiling microarray dataset)gse30138和gse54207以及核糖核酸测序数据集(rna sequencing dataset)gse65180来分析。
127.gse30138和gse54207的平台使用gpl1261(affymetrix mouse genome 430 2.0array)，gse65180使用gpl13112(illumina hiseq 2000(mus musculus))，一次筛选与肌腱生成标记物(tenogenesis markers；tgf-β2、scx、mkx、egr1、tnmd、thbs4、col1、gag、tnc)、肌肉生成标记物(myogenesis markers；pax3、pax7、myf5、des、myod、myogenin、mrf4、myostatin、mhc2)、骨生成标记物(osteogenesis markers；runx2、osterix、alp、ocn、opn)及软骨生成标记物(chondrogenesis markers；comp、sox9、chad、acan、col2a1)在不同胚胎发育阶段(embryonic stage)的表达程度相似的基因。
128.为了掌握蛋白质-蛋白质相互作用(ppi，protein-protein interaction)网络构建和基因间的相互作用，利用线上数据库cytoscape software(http://www.cytoscape.org/)的ticone和cluego plugin来分析(图2)。然后，为了在上述基因中筛选核心基因(hub genes)，使用分子复合物检测(molecular complex detection(mcode；degree cutoff＝2.1，node score cutoff＝0.2，k-core＝2，max.depth＝100)和马尔科夫聚类(markov clustering)作为在蛋白质-蛋白质相互作用网络中紧密连接的重要模块(module)。通过基因本体(gene ontology，go)分析筛选的集(cluster)与肌腱再生的相关性来筛选候补基因。
129.核糖核酸测序(rna-seq)分析
130.利用rneasy plus universal kit(cat.73404，qiagen公司，美国(usa))根据生产公司的说明书提取正常肌腱(n＝5)与肩袖(n＝6)的总核糖核酸。使用agilent 2100bioanalyzer(agilent technologies公司，圣克拉拉(santa clara)，加利福尼亚州(ca)，美国)确认总核糖核酸的完整性(integrity)，互补脱氧核糖核酸(cdna)文库的(library)使用truseq stranded mrna library prep kit(cat.20020594；illumina公司，美国)根据生产公司的说明书进行。以2nm的浓度将完整的文库上样到hiseq 2000上，通过v3 sbs chemistry、76cycle和双端测序(paired-end)进行测序。
131.培养人类脐带来源干细胞及肌腱细胞
132.本研究中使用的所有组织都是在患者的同意下采集并使用的。为了去除血液等杂质，使用添加有抗生素(100u/ml的青霉素(penicillin)、100μg/ml的硫酸链霉素(streptomycin sulfate)以及0.25μg/ml的两性霉素b(amphotericin b)(抗生素-抗真菌溶液(antibiotic-antimycotic solution)；welgene公司，大邱(daegu)，韩国(korea)))的不含钙及镁的dulbecco磷酸盐缓冲溶液(ca2+,mg2+-free dubecco'sphosphate-buffered saline；dpbs，gibco公司，纽约(ny)，美国)洗涤脐带和肌腱组织2次至3次。
corning公司，米德兰(midland)、密歇根州(mi)，美国)来涂敷1周至2周后，在sylgard上固定两个5mm大小的蚕丝缝合线(suture)。在干净的工作台上使用100％的乙醇和紫外线(uv)对培养容器和缝合线进行灭菌后干燥2小时，在37℃、co2培养器中预先盛放dmem培养基1小时。将以3∶1的比例混合2.25
×
105个基因导入msc与0.75
×
105个ucmsc的细胞与凝血酶混合溶液(thrombin mixture；包含10％的胎牛血清、1％的抗生素溶液、1u/ml的凝血酶(thrombin)、200μm的氨基己酸(aminohexanoic acid)及10mg/ml的抑肽酶(aprotinin)的dmem)混合后，加入10mg/ml的纤维蛋白原(fibrinogen)溶液。在涂有sylgard的培养皿的表面快速展开上述混合液后，在37℃的温度下培养3小时。在dmem-hg中包含250μm的抗坏血酸、50μm的l-脯氨酸(l-proline)的肌腱细胞分化培养液中培养3天。为了确认分化为肌腱细胞的程度，进行苏木精伊红(h&e)、天狼星红(picrosirius red)及免疫组织化学染色。并且，通过肌腱细胞标记物基因表达确认分化程度。细胞在4％的多聚甲醛溶液中固定细胞24小时后，包埋在石蜡中制备6μm的切片标本，对其进行苏木精伊红染色和天狼星红染色。免疫组织化学染色为将anti-col i(ab34710，abcam公司)与anti-colⅲ(ab7778，abcam公司)以1∶200的比例稀释来在冷藏的条件下反应一天后，使结合有辣根过氧化物酶(hrp)的二抗在室温下反应30分钟后进行观察。
143.从zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)中分离核糖核酸
144.为了确认导入zkscan8时多种基因的表达，使用hiyield total rna mini kit(real biotech corporation公司，中国台湾)提取总核糖核酸，利用分光光度计(nanodrop公司，特拉华州，美国)在260nm和280nm波长中测量吸光度后，定量流出液内的总核糖核酸。使用super scriptⅱ阴性逆转录酶(superscript ii reverse transcriptase)(invitrogen公司，加利福尼亚州，美国)利用1μg的各总核糖核酸合成互补脱氧核糖核酸。
145.实时逆转录聚合酶链式反应
146.为了进行实时逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，rt-pcr)，使用了maximetm pcr premix(i-startaq)(intron公司，城南市(sungnam)，韩国)。在总容积20μl中加入16μl的无核糖核酸酶(rnase-free)蒸馏水、2μl的互补脱氧核糖核酸以及1μl的各引物，以如下的反应条件进行。首先，在95℃的温度下预变性(pre-denaturation)30分钟，在95℃的温度下变性(denaturation)30秒钟，在55℃的温度下退火(annealing)30秒钟，在72℃的温度下延伸(extension)1分钟。重复上述过程32次之后，在72℃的温度下冷却(cooling)5分钟。通过上述过程获得的聚合酶链式反应(pcr)产物在1％的琼脂糖凝胶上确认条带。
147.表1
[0148][0149]
[0150]
定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative rt-pcr)
[0151]
定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative rt-pcr；qrt-pcr)为利用go taq
tm
probe qpcr and rt-qpcr systems(promega公司、威斯康辛州(wi)，美国wi)、taqman
tm
gene expression assays(applied biosystems公司，福斯特城(foster city)，加利福尼亚州，美国)及lightcycler 480(roche applied science公司，曼海姆(mannheim)，德国(germany))来实时确认如下基因的表达：scx(hs03054634_g1)、mkx(hs00543190_m1)、egr-1(hs00152928_m1)、egr-2(hs00166165_m1)、thbs4(hs00170261_m1)、gapdh(hs99999905_m1)。聚合酶链式反应以在95℃的温度下预变性10分钟，在95℃的温度下变性15秒钟，在60℃的温度下退火1分钟，在72℃的温度下延伸4秒钟为一个循环(cycle)，重复50个循环后，在40℃的温度下冷却30秒钟。熔解曲线(melting curve)分析使用2-δct计算法，以gapdh的表达为参考值(reference)来分析定量实时逆转录聚合酶链式反应的结果[livak kj,schmittgen td.analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the2-δδct method.methods.2001,25:402-408]。
[0152]
蛋白质分离及免疫印迹法
[0153]
为了从肌腱细胞中获得肌腱细胞裂解物(lysate)，进行了如下实验。向肌腱细胞的颗粒(pellet)加入裂解液(lysis)(pro-preptm)(intron公司，城南市，韩国)后，在10秒钟内使用10次以上的强涡流(vortex)进行破碎。在4℃的温度下以13000rpm的转速离心分离上述溶液20分钟后，回收上清液来获得肌腱细胞裂解物。为了定量肌腱细胞裂解物的蛋白质含量，使用了bca。将相同浓度的肌腱细胞裂解物(10μg)上样在10％的丙烯酰胺凝胶上，通过电泳(sds-page)根据蛋白质大小进行分离。在1x转移缓冲液(transfer buffer)(20％的甲醇、0.025m的tris盐(tris base)及0.19m的甘氨酸(glycine))中使分离的蛋白质充分湿润后，在100v的电压下使电流通过90分钟来转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。在添加有5％的脱脂奶粉的1xtbs-t溶液(10mm的tris ph7.5、100mm的nacl、0.1％的吐温(tween)20)中封闭(blocking)上述聚偏二氟乙烯膜1小时。然后，以1∶1000的比例在1x tbs-t溶液中稀释一抗后，在4℃的温度下搅拌来反应。使用的一抗如下：zkscan8抗体(antibody)(stj26239，st john'slaboratory公司)、β肌动蛋白抗体(β-actin antibody)(ab170325，abcam公司)。使用1x tbs-t充分洗涤与一抗反应的聚偏二氟乙烯膜10分钟以上共3次后，向1x tbs-t溶液中加入二抗(1∶20000稀释)后在室温下边搅拌边反应一小时。使用的二抗如下：抗鼠免疫球蛋白-hrp(goat anti mouse lgg-hrp；sa001-500，gendepot公司)和抗兔免疫球蛋白-hrp(goat anti rabbit lgg-hrp；7074s，cell signaling公司)。使用1x tbs-t溶液洗涤10分钟共3次后，处理ecl后，使用imagequant las4000 mini(ge healthcare life sciences公司，小查尔方顿(little chalfont)，英国(uk))一起进行拍摄。
[0154]
设计动物实验
[0155]
得到机构的实验动物研究委员会的认可并根据认可的步骤进行(iacuc_2019_0044)。将88只雄性sprague-dawley大鼠(12周，340g～360g)分为4个组(1)正常组(normal group)；2)生理盐水组(saline group)；3)脐带来源间充质干细胞组(msc group)；4)zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组)来制备。
[0156]
使用替来他明与唑拉西泮的复合物(30mg/kg)及隆朋(10mg/kg)诱导麻醉后，在所
有实验中均使用大鼠的左肩。首先用指甲轻按大鼠的足底来确认是否麻醉后进行手术。然后，在触摸到左肩肩峰除切开前面的皮肤2cm。切开附着于肩峰的斜方肌和三角肌露出冈上肌的肌腱后，在冈上肌的肌腱和与肱骨头部位距离1mm处使用具有2mm直径(肌腱宽度的约50％以上)的活检穿孔器(biopsy punch)(bp-20f，kai medical europe gmbh公司，不莱梅(bremen)，德国)形成圆形的全层断裂肌腱损伤。然后，使用30g针头的注射器分两次向断裂的部位两侧剩余的肌腱注射如下物质：2)10μl的生理盐水；3)脐带来源间充质干细胞(1
×
106cells/10μl生理盐水)；以及4)zkscan8导入脐带来源间充质干细胞(1
×
106cells/10μl生理盐水)。使用4-0vicryl的缝合线(w9074，ethicon公司，辛辛那提(cincinnati)，俄亥俄州(oh)，美国)缝合斜方肌和三角肌，使用黑丝线(black silk)(sk439，ailee公司，釜山(busan)，韩国)缝合皮肤后，消毒伤口部位。手术结束后，允许大鼠进行自由的笼内活动。
[0157]
在各组手术后过2周和过4周时使大鼠安乐死，回收冈上肌的肌腱在宏观、组织学以及生物力学评估中使用。
[0158]
对动物实验的各组的宏观评估
[0159]
各组的大鼠在手术后过2周、过4周时二氧化碳腔室中安乐死。在不去除肱骨的头部和冈上肌的情况下，以保持大鼠的冈上肌肌腱的原有状态的方式获得。为了宏观评估肌腱的再生，利用了stoll修正的半定量评估法[stoll c,john t,conrad c et al.healing parameters in arabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation.biomaterials 2011；32(21):4806-4815]。上述评估方法共有12个参数：肌腱的断裂(tendon rupture；缺损部位肌腱断开的状态)、炎症(inflammation；肌腱粘连或变为红色的发生炎症的状态)、肌腱的表面(tendon surface；肌腱的表面变为不光滑、粗糙、凹凸不平的状态)、周围肌腱的变化(neighboring tendon；缺损部分周围的肌腱的颜色、厚度、外表面变为异常的状态)、缺损部位的厚度(level of the defect；缺损部位分泌的反倒比周围肌腱突出的状态)、缺损大小(defect size；缺损的大小扩大3mm以上的缺损大小变大的状态)、肌腱的肿胀/发红(swelling/redness of tendon；损伤的肌腱变红或触摸时有肿胀感的状态)、与周围组织的粘连(connection surrounding tissue and slidability；损伤的肌腱与周围组织不顺滑地滑动(不分离)的粘连的形态)、肌腱的厚度(tendon thickness；肌腱的厚度比原来的厚度厚的状态)、肌腱的颜色(color of tendon；发亮的白色肌腱变为不透明且浑浊的红色的状态)、连接在一处肌肉(single strains of muscle；冈上肌的肌腱不是指连接在冈上肌上，而是混在周围肌肉和组织中来连接的状态)以及与周围健康组织的连接性(transition of the construct to the surrounding healthy tissue；缺损部位与周围健康肌腱的连接不顺滑的状态，缺损开始的部位明显区分的状态)。每个参数打0分或1分，肌腱的肿胀/发红打0分～2分，肌腱的厚度打0分～3分。宏观总分(total macroscopic score)在接近正常时为0分，在损伤最严重时为15分。
[0160]
有关动物实验各组的组织学评估
[0161]
通过肉眼评估后，立刻把获得的组织放入4％(w/v)的多聚甲醛(paraformaldehyde，pfa；merck公司，德国)中固定24小时后，放入10％的二乙氨四乙酸(sigma-aldrich公司，圣路易斯(st louis)，密苏里州，美国)两天来去除钙质。然后，利用逐渐增加浓度的乙醇进行脱水过程，利用三氯甲烷进行脱脂过程。将固定完毕的组织包埋入石蜡块中，利用切片机(microtome)小心切开至肌腱的中心部位后，在中心部以4cm的厚
度连续切割后将组织附着在载玻片上。
[0162]
为了分析组织，随机选择载玻片使用苏木精伊红(hematoxylin and eosin,h&e)，利用显微镜(u-tvo 63xc；olympus corp.公司，日本(japan))来分析。利用修正的astrom和movin的半定量评估方法评估各载玻片的肌腱的退行性程度[jo ch,shin wh,park jw et al.degree of tendon degeneration and stage of rotator cuff disease[in english].knee surg sport tr a 2017；25(7):2100-2108]。上述肌腱的退行性程度分析法共有7个参数：纤维的结构(fiber structure；长纤维形状的胶原变为碎裂变短的状态)、纤维的排列(fiber arrangement；原本平行排列的胶原纤维变为不规则排列的状态)、细胞核的圆形形状(rounding of the nuclei；平时飞机或状态下扁平的成纤维细胞的细胞核在损伤或激活时变为圆形形状的状态)、细胞的多样性(variations in cellularity；肌腱中存在的细胞数量增加且一处一处聚集为群落的状态)、增加的血管(increased vascularity；肌腱中存在的血管的数量大幅增加的状态)、减少的染色性(decreased stainability；构成肌腱的纤维因损伤而减少，因减少的纤维的密度而降低染色性的状态)以及玻璃样变(hyalinization；原本由纤维形态的胶原形成的肌腱组织变为玻璃质的状态)。退行性总分退行性总分(total degeneration score)在接近正常是为0分，发生最严重的退行性变化时为21分。
[0163]
为了分析胶原纤维的排列(collagen fiber coherence；形成肌腱的胶原纤维一贯平行的排列)，使用天狼星红(picrosirius red)染色载玻片后，使用圆形偏光光学显微镜来获取图像。胶原纤维的排列使用称为orientation j plug-in for image j的计算机程序分析肌腱的主轴中有多少胶原纤维(collagen fiber)拧在一起。每个载玻片分析五个区域，将得出的平均值乘以100来用作最终值[degen rm,carbone a,carballo c et al.the effect of purified human bone marrow-derived mesenchymal stem cells on rotator cuff tendon healing in an athymic rat[in english].arthroscopy 2016；32(12):2435-2443]。
[0164]
为了评估与异位软骨形成相关的糖胺聚糖丰富区域[glycoaminoglycan(gag)-rich area；纪检组织内发生非特异性软骨组织的状态]，使用番红o/固绿(safranin-o/fast green，saf-o)染色载玻片染色，利用光学显微镜获取图像。使用image j分析获得的图像，在整体肌腱中评估作为糖胺聚糖丰富区域的染成红色的区域的面积。
[0165]
评估异位骨化(heterotopic ossification，在肌腱组织中发生非特异性骨组织的状态)的发生。当利用苏木精伊红染色的载玻片观察到整体肌腱结构中有分离、群聚及杆状的病灶(foci)时，评估为发生异位骨化，利用image j分析发生异位骨化的区域来获得区域的面积。
[0166]
有关动物实验的各组的生物力学评估
[0167]
各组的大鼠在手术后过2周、过4周时在二氧化碳腔室中安乐死。在保持冈上肌附着在肱骨的状态下获得肌腱，小心地去除肌肉只留下肌腱。将获得的组织包裹在用生理盐水沾湿的纱布中，在-80℃的冷冻库中保管，在实验24小时前，以包裹在生理盐水沾湿的纱布中的状态缓缓解冻。在所有实验过程中，利用生理盐水沾湿的纱布保持组织的状态。将肱骨的远端部垂直固定在订做的试验系统的下部夹具中装满聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，pmma)的铝管中。肌腱的近端部固定在上端夹具，压迫砂纸、计
量器及橡胶来防滑并使试片的损伤最小化。利用材料测试系统(h5k5，tinus olsen公司，英格兰(england)，英国)进行本实验，将组织与拉伸的力固定为90
°
来进行(图13)。所有试片以0.1mm/s的规定的速度进行。通过肉眼确认肌腱有无滑动来进行。在断裂区域的中心测量肌腱的横截面积(cross-sectional area)，利用公式
‘
公式面积(formula area)＝abπ/4’来计算，最大断裂负荷(ultimate failure load；能够坚持到肌腱断裂的最大的力)、刚性(stiffness；能够坚持不伸展而保持原有形态的最大的力)以及最大应力(ultimate stress；最大断裂负荷/横截面积，能够坚持到每横截面积的肌腱断裂的最大的力)通过荷重-变位曲线来计算[galatz l,silva m,rothermich s et al.nicotine delays tendon-to-bone healing in a rat shoulder model.jbjs 2006；88(9):2027-2034.]。
[0168]
统计分析
[0169]
所有数据以平均值
±
sd来鄙视。使用一元方差分析(one-way analysis of variance，anova)分析，事后分析使用bonferroni多重比较检验(bonferroni multiple comparison test)，比较两个组时使用t检验(t-test)。所有统计分析使用spss软件版本23(ibm公司)来进行。当出现p＜0.05以下的显著值时，看做在统计学上具有显著性。
[0170]
实验结果
[0171]
总的全转录组分析(whole transcriptome profiling)
[0172]
为了分析肌腱、肌肉、软骨、骨生成标记物在不同胚胎发育阶段(embryonic stages)的表达状态，在全转录组表达谱数据集(whole transcriptome expression profiling dataset)gse30138、gse54207、gse65180中利用共25070个表达的基因(total union of expressed genes)来分析胚胎发育阶段e9.5～e15.5的表达状态。图2为在胚胎发育的不同阶段(e9.5至e15.5)中整理数据集的分布的表。
[0173]
根据图2，胚胎发育不同阶段的表达基因(deg，differentially expressed gene)共确认到9163个，其中确认到28个与肌腱生成(tenogenesis)、肌肉生成(myogenesis)、骨生成(bone genesis)及软骨生成(chondrogenesis)相关的基因，以及149个表达状态相似的基因。
[0174]
胚胎发育不同阶段的基因表达状态分析及蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)网络分析
[0175]
由于使用三个数据集进行分析，因此，若与各胚胎发育阶段的标记物基因的表达状态一致，则差距分数为0，若在表达状态增加的时间点有一处不同，则差距分数为0.33，若两处不同，则差距分数为0.67分，若在表达状态减少的时间点有一处不同，则差距分数为-0.33分，若两处不同，则差距分数为-0.67，使用各基因的差距分数总分比较与标记物基因表达状态的相似度来分析。在共9163个deg中，一次筛选差距总分为
±
0.33以下的，即，在全部胚胎发育阶段中只在一个胚胎发育阶段中的表达状态不一致的149个基因。在对一次筛选的1候补基因调节临界分数(degree cut-off)的情况下进行蛋白质-蛋白质相互作用网络(ppi network)、功能富集(functional enrichment)、模块(module)分析。
[0176]
根据蛋白质-蛋白质相互作用分析的结果，确认到由3个子集(sub-cluster)构成，从其中去除已知的基因，二次筛选出99个基因。然后，通过基因本体(go)三次筛选出在功能上与肌腱再生具有相关性的42个基因。为了筛选与肌腱再生相关的最终基因，将三次筛选的42个基因用于筛选实验。
[0177]
比较胚胎发育不同阶段的肌腱生成标记物与zkscan8的表达状态
[0178]
图3a为通过分析根据胚胎发育的不同阶段的表达类型的肌腱生成标记物和zkscan 8的表达状态来示出的柱状图。
[0179]
比较各胚胎发育阶段的zkscan8基因与肌腱生成标记物的表达状态来分析与哪些标记物相似，结果如图3a所示，scx和tgif1从e9.5开始持续增加，在e13.5中减少，mkx持续增加至e13.5，tgf-β2从e9.5至e13.5持续显出高水平的表达量。确认到egr1和thbs4在e10.5～e11.5中比在e9.5中的表达量减少，从e12.5开始再次提供增加，epha4从e10.5开始大幅增加，观察胚胎发育不同阶段的zkscan8的表达状态，示出在e10.5中增加后保持的图形，可知整体上显出与肌腱标记物相似的表达量。
[0180]
分析人类正常的肌腱与肩袖疾病肌腱中的zkscan8的表达状态
[0181]
确认了从正常人中获得的正常的肌腱与从患有肩袖疾病的患者中获得的肌腱中的肌腱生成标记物和zkscan8基因显出怎样的表达状态。
[0182]
图3b为通过测量在人类正常肌腱和患有肩袖疾病的患者的肌腱(肌腱损伤)中肌腱生成标记物和zkscan 8的表达状态的来示出的柱状图。
[0183]
如图3b所示，确认到已知为肌腱生成标记物的tnmd和thbs4的表达程度在肩袖疾病的肌腱中分别显著减少5.4倍及2倍左右。与整成肌腱相比，肩袖疾病中的col3a1的表达程度显著增加3.2倍。并且，在肩袖疾病的肌腱中，mmp-9的表达程度也比正常肌腱增加11.8倍。但确认到肩袖疾病的肌腱中只有zkscan8基因较正常肌腱特异地减少。通过此确认到zkscan8为能够预防或治疗肩袖疾病的优选基因。从而，最终选择zkscan8。
[0184]
分析zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的特性
[0185]
作为对照组载体的pscaav-gfp和插入zkscan8的pscaav载体的示意图如图1c所示。通过如上所述的方式制备分别导入pscaav-gfp与pscaav-zkscan 8的脐带来源间充质干细胞，比较zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)的特性。为此，分析了它们各自的细胞形状和增殖能力。
[0186]
图4a至图4e为分析zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)的特性(细胞形状和增殖能力)的结果，图4a为通过显微镜拍摄zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)的图像，图4b为通过检测zkscan8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)的增殖能力来以定量的方式示出的柱状图，图4c为通过实时逆转录聚合酶链式反应检测有关zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)的zkscan 8基因表达与否来示出的柱状图，图4d及图4e为通过免疫印迹法在zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)中分析zkscan 8蛋白表达水平的结果。
[0187]
如图4a及图4b所示，在zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)和对照组(msc-gfp)中观察到特定干细胞形状的成纤维细胞形态。即，确认到两种细胞的增殖能力没有差异。
[0188]
如图4c至图4e所示，从zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)和对照组(msc-gfp)中提取总核糖核酸和蛋白质来分析不同时间的zkscan8的表达水平。
[0189]
根据实时逆转录聚合酶链式反应的结果，可知zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)和对照组(msc-gfp)在导入基因后经过两天的时间点开始过表达，经过3天后
表达开始减少。
[0190]
根据免疫印迹法的结果，确认到与对照组(msc-gfp)相比，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的zkscan 8蛋白的表达增加1.5倍以上。从而确认到通过本发明成功制备了过表达zkscan 8蛋白的人脐带来源间充质干细胞。
[0191]
有关zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的肌腱分化能力的评估
[0192]
为了确认zkscan 8基因和肌腱分化的阶段，将脐带来源间充质干细胞(ucmsc)在包含结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，ctgf)及抗坏血酸的肌腱分化培养基中培养2周来诱导分化为肌腱细胞，在培养的第3天、第7天、第14天通过实时逆转录聚合酶链式反应确认各细胞中的zkscan 8的表达。而且，在单轴拉伸的情况下三次培养zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)和对照组(msc-gfp)3天来诱导肌腱分化，在此情况下，通过定量实时逆转录聚合酶链式反应和组织学分析确认相关基因(scx、egr-1、egr-2、thbs4)的表达。
[0193]
图5a至图5d为评估zkscan 8的过表达给肌腱的分化带来影响的图。图5a为在肌腱分化培养基中培养脐带来源间充质干细胞2周后，通过实时逆转录聚合酶链式反应分析各不同培养天数的zkscan 8表达水平来定量化的柱状图。
[0194]
如图5a所示，可知脐带来源间充质干细胞(ucmsc)的zkscan 8的表达在肌腱分化诱导的第14天显著增加1.5倍以上。该结果表示肌腱分化与zkscan 8的表达具有相关性。
[0195]
迄今已知scx、mkx及egr-1/2等几种转录因子与肌腱发育相关，在肢体(limb)中，scx和sox9起到用来开始肌腱前体细胞的首个信号的作用。与此相反，已知mkx和egr-1/2起到用于肌腱分化和成熟的第二信号的作用。尤其，egr-1/2已知为肌腱分化所需的要素，查明其为通过调节1型胶原的生成来与脊柱动物的肌腱分化相关的新型脱氧核糖核酸结合蛋白。通过定量实时逆转录聚合酶链式反应确认了zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)和对照组(msc-gfp)中与肌腱发育相关的转录因子(scleraxis；scx、mohawk；mkx、early growth response-1/2；egr-1/2)在不同时间的表达状态。
[0196]
图5b为培养zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)7天后，通过定量实时逆转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)分析各不同培养天数的肌腱发生转录因子(scx、mkx、egr-1、egr-2)的表达水平的定量化的柱状图。在此情况下，以对照组(msc-gfp)的第2天为基准在柱状图中示出相对表达值。
[0197]
如图5b所示，从第3天开始zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的scx的表达增加1.61倍，在第2天，egr-1、egr-2的表达分别显著增加2.93倍、4倍以上。与此相反，可知对照组(msc-gfp)与培养初期没有差异。
[0198]
接着，在单轴拉伸下通过三次培养细胞来利用模仿肌腱和韧带的分化方法的情况下，确认了zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的组织学形状、肌腱分化标记物的表达变化。
[0199]
图5c及图5d为在肌腱分化培养基中通过三次培养法培养zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)3天后，通过定量实时逆转录聚合酶链式反应分析肌腱相关标记物(scx、egr-1、egr-2、thbs4)的表达水平的定量化的柱状图。
[0200]
如图5c及图5d所示，确认到在三次培养的第3天，zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的scx(1.7倍)、egr-1(2.7倍)、egr-2(2.8倍)、thbs4(1.5倍)的表达都增加。
[0201]
图5e为在肌腱分化培养基中通过三次培养法培养zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)3天时，分析肌腱分化诱导的组织学特性的结果。
[0202]
如图5e所示，确认到zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)为薄且长的形状的细胞整齐排列为一列的状态。并且，通过天狼星红染色确认到zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的基质染色为黄色的1型胶原。并且，利用1型胶原抗体及3型胶原抗体进行免疫组织学染色的结果，确认到1型胶原及3型胶原的表达。尤其，在zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)中确认到1型胶原的表达显著更多。综合上述结果可知，zkscan8与肌腱细胞分化诱导直接相关。
[0203]
分析有关zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的脂肪、骨、软骨、肌腱、肌肉及神经相关标记物的表达状态
[0204]
肌腱组织与骨、软骨及肌肉由很多相似点。因此，确认zkscan 8是否不仅是肌腱组织，也给与构成肌肉骨骼系统的脂肪、骨、软骨、肌腱、肌肉及神经细胞相关的标记物带来影响。具体地，在制备zkscan8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)2天及3天后，分析包括肌肉骨骼系统相关标记物在内的多种基因的表达状态。
[0205]
图6为在zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)与对照组(msc-gfp)中分析脂肪、骨、软骨、肌腱、肌肉、神经细胞的相关标记物的表达状态的结果，据此，在zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)中，脂肪、骨、软骨、肌肉及神经相关基因的表达整体上增加。尤其可知，与对照组(msc-gfp)相比，zkscan 8导入脐带来源间充质干细胞(msc-zk8)的碱性磷酸酶(alp，alkaline phosphatase)、sry-box转录因子6(sox6，sry-box transcription factor 6)、egr-2、col1a1、desmin、神经丝轻多肽(nefl，neurofilament light polypeptide)的表达在第3天大幅增加。这表示zkscan8的过表达给包括骨、软骨、肌肉及神经在内的肌肉骨骼系统带来影响。
[0206]
对动物实验各组的宏观评估
[0207]
图7a为在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时的冈上肌腱的宏观状态。在此情况下，为了明确观察肌腱的缺损状态，去除了缺损周围的周边组织。
[0208]
图7b为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析有关冈上肌腱的宏观总分结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
[0209]
如图7a及图7b所示，比较了各组在外形评估严重损伤的宏观总分。第2周时，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组为4.75
±
0.46，而生理盐水组和脐带来源间充质干细胞组分别为10.75
±
1.28(p＜0.000)，7.25
±
0.89(p＜0.000)，可知损伤程度严重。尤其，确认到与其他组相比，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组在炎症、与周围组织的粘连、肌腱的厚度参数中示出低的分数(低的损伤)。
[0210]
第4周时，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的宏观总分为2.75
±
0.46。与此相反，确认到生理盐水组的脐带来源间充质干细胞组分别为9.00
±
0.00(p＜0.000)以及4.25
±
0.89(p＜0.000)，损伤程度比msc-zk8显著高。确认到与其他组相比，msc-zk8组的肿胀及发红参数具有低的损伤程度。
[0211]
通过上述实验可知，在zkscan8过表达的情况下，脐带来源间充质干细胞的组织损
伤恢复能力显著提高。
[0212]
并且，在肩袖受损的情况下，肩袖与周围组织发生粘连而使肌腱损伤恶化，限制患者的运动并诱发极严重的疼痛。然而，可知zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组可以通过抑制肩袖与周围组织的粘连来预防或治疗可能因肌腱损伤引起的患者的疼痛和症状。
[0213]
有关动物实验各组的组织学评估
[0214]
图8a为在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验的第2周及第4周时对冈上肌腱进行苏木精伊红染色的照片(倍率：
×
100)，图8b为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析冈上肌腱的退行性总分的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
[0215]
如图8a及图8b所示，在实验进行的第2周，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的退行性总分为13.00
±
1.20。与此相反，确认到生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组分别为17.75
±
0.46(p＜0.001)、16.00
±
0.93(p＜0.001)。即，可知与其他组相比，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的肌腱退行性变化显著低。尤其，确认到与脐带来源间充质干细胞组相比，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组在损伤的纤维排列和增加的血管参数中以显著差异得到恢复。
[0216]
在第4周，确认到zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的退行性总分为7.00
±
1.07，生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组分别为16.25
±
0.89(p＜0.01)、8.75
±
1.83(p＝0.05)。可知zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的退行性程度比其他组显著低。
[0217]
图9a为在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时使用psr染色冈上肌腱的照片(倍率：
×
100)，图9b为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析冈上肌腱的胶原纤维的排列(collage fiber coherence)的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误(s.e.m)来表示(*p＜0.05)。
[0218]
如图9a及图9b所示，在实验进行的第2周，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的胶原纤维的排列值为43.35
±
8.35。与此相反，确认到生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组分别为20.69
±
4.88(p＝0.003)、27.61
±
6.97(p＝0.042)。可知zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的胶原纤维排列比其他组显著提高。
[0219]
在实验进行的第4周，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的胶原纤维排列值为47.76
±
5.77，也比其他组显著高。具体地，生理盐水组的胶原纤维排列值为19.86
±
2.97(p＜0.000)。
[0220]
图10a为在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时使用saf-o染色冈上肌腱的照片(倍率：
×
100)，图10b为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析冈上肌腱的糖胺聚糖丰富区域的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。.
[0221]
如图10a及图10b所示，在实验进行的第2周，确认到糖胺聚糖丰富区域的发生程度的差异低。即，各组间没有差异。然而，在实验进行的第4周，zkscan8导入脐带来源间充质干
细胞组为39.17
±
28.34mm2。确认到生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组分别为643.39
±
156.99mm2(p＜0.000)、255.33
±
107.01mm2(p＝0.013)。即，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的异位软骨形成程度比其他组显著低。尤其可知，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的分数为与正常组无显著差异的水平。
[0222]
图11为示出在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时分析冈上肌腱的异位骨化区域的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
[0223]
如图11所示，可知在包括zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组在内的所有组中都没有发生非特异性的骨形成。
[0224]
通过上述实验结果可知，强化zkscan8的脐带来源间充质干细胞不仅在临床应用上没有不利之处，反而促进肌腱组织的再生，有助于肌腱组织的恢复，从而可以在肌肉骨骼系统疾病的预防或治疗中使用。
[0225]
包括肌腱在内的肌肉骨骼系统的治疗之所以失败，大部分原因是因为损伤后肌腱未恢复为原有正常组织，而是发生以由不规则的胶原纤维和大量血管形成的瘢痕组织(scar tissue)替代的现象。然而，在处理过表达zkscan8的脐带来源间充质干细胞的情况下，确认到与只处理脐带来源间充质干细胞的情况相比，提高胶原纤维的整齐排列，使肌腱的缺损部位不被瘢痕组织取代，而是可以恢复为正常的肌腱组织。并且，在肌肉骨骼系统的治疗中应用干细胞时，诱导异位软骨形成及固化，具有提高肩部疼痛、再次断裂及发生并发症的频度的问题，因此在临床应用上受到限制。然而，确认到过表达zkscan8的脐带来源间充质干细胞反倒抑制异位软骨形成，保持与正常组相同的水平。即，zkscan8克服了脐带来源间充质干细胞具有的副作用，使临床应用成为可能，此外，还具有预防、缓解、治疗肌腱组织损伤的效果，有助于肌腱组织的恢复，从而可以在肌肉骨骼系统疾病的预防或治疗中使用。
[0226]
有关动物实验各组的生物力学评估
[0227]
图12及图13a至图13c涉及在开始有关正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组的实验第2周及第4周时的再生的肌腱的生物力学实验。
[0228]
图12为拍摄的从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的标本和生物力学实验过程的图像。
[0229]
图13a为示出分析从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组、及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的再生的肌腱的最大断裂负荷的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
[0230]
如图13a所示，手术后经过2周的zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组为17.54
±
2.52。生理盐水组为10.93
±
1.62(p＜0.001)，从而确认msc-zk8组具有显著更高的最大断裂负荷。脐带来源间充质干细胞组为16.68
±
3.01，与msc-zk8组没有显著差异。
[0231]
手术后经过4周的zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组为22.84
±
1.99。确认到生理盐水组为18.51
±
1.97(p＝0.016)，脐带来源间充质干细胞组为22.14
±
2.19。即，可知zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组比生理盐水组得到显著的强化及恢复。
[0232]
图13b为示出分析从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组及zkscan8导
入脐带来源间充质干细胞组中采集的再生的肌腱的刚性的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
[0233]
如图13b所示，手术后经过2周的zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组为7.50
±
0.60。确认到生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组分别为5.17
±
0.55(p＝0.001)、6.83
±
0.99。即，可知zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组比生理盐水组得到显著水平的强化。
[0234]
手术后经过4周的zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组为9.04
±
1.12。确认到生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组分别为7.22
±
0.62(p＝0.013)、7.38
±
1.09(p＝0.029)。即，zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组比生理盐水组和脐带来源间充质干细胞组得到显著水平的增加。
[0235]
图13c为示出分析从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组、及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的再生的肌腱的最大应力的结果。所有定量数据以平均数
±
标准误来表示(*p＜0.05)。
[0236]
图13d为示出分析从正常组、生理盐水组、脐带来源间充质干细胞组、及zkscan8导入脐带来源间充质干细胞组中采集的再生的肌腱的横截面积(cross-sectional area)的结果。
[0237]
如图13c及图13d所示，确认到最大应力和肌腱的横截面积在第2周和第4周都没有显著差异。
[0238]
肌腱为在人体活动时起到将肌肉的力向骨传递的功能的组织。在本发明中，“最大断裂负荷”是指在向肌腱施加张力时肌腱能够坚持的最大的力，“刚性”是指在施加张力时在组织的长度不发生变化的情况下能够坚持的最大的力。
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因此，确认到与单独处理脐带来源干细胞的情况相比，处理zkscan8过表达的脐带来源间充质干细胞时的最大断裂负荷和刚性增加。这样的结果可以说是与向损伤的肌腱处理zkscan8过表达的脐带来源间充质干细胞时显出防止退行性变化、恢复胶原纤维的排列及抑制异位软骨形成等效果的前述结果相一致的。即，可知当在全层断裂损伤中应用zkscan8过表达的脐带来源间充质干细胞时，可以恢复受损肌腱的缺损组织并提高肌腱的功能。

技术特征：
1.一种肌肉骨骼系统疾病诊断用组合物，其特征在于，包含测量zkscan 8基因或由上述基因编码的蛋白质的表达水平的制剂作为有效成分。2.根据权利要求1所述的肌肉骨骼系统疾病诊断用组合物，其特征在于，上述制剂为与zkscan 8基因特异性结合的引物或探针。3.根据权利要求1所述的肌肉骨骼系统疾病诊断用组合物，其特征在于，上述制剂为与由zkscan 8基因编码的蛋白质特异性结合的抗体或适体。4.根据权利要求1所述的肌肉骨骼系统疾病诊断用组合物，其特征在于，上述肌肉骨骼系统疾病为肌腱疾病或韧带疾病。5.一种提供肌肉骨骼系统疾病的诊断所需的信息的方法，其特征在于，包括：步骤1)，在从怀疑患有肌肉骨骼系统疾病的个体中分离的生物试样中测量zkscan 8基因或由上述基因编码的蛋白质的表达水平；以及步骤2)，比较上述测量的zkscan 8基因或由上述基因编码的蛋白质的表达水平与正常对照组试样的表达水平。6.一种用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物，其特征在于，包含zkscan 8蛋白作为有效成分。7.根据权利要求6所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物，其特征在于，上述zkscan 8蛋白由序列2的氨基酸序列表示。8.根据权利要求6所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物，其特征在于，上述肌肉骨骼系统疾病为肌腱疾病或韧带疾病9.根据权利要求8所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物，其特征在于，上述肌腱疾病为选自由肌腱损伤、肌腱断裂、肌腱炎、肌腱变性及腱鞘炎组成的组中的一种以上，上述韧带疾病为选自由股四头肌韧带断裂、冠状韧带扭伤、副韧带损伤、前交叉韧带损伤、后交叉韧带损伤、踝关节韧带损伤、韧带断裂及扭伤组成的组中的一种以上。10.一种用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征在于，包含zkscan 8基因、包含上述基因的载体、包含上述载体的细胞或其培养液作为有效成分。11.根据权利要求10所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征在于，上述载体为线状脱氧核糖核酸、质粒脱氧核糖核酸或重组病毒载体。12.根据权利要求11所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征在于，上述重组病毒为选自由逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒及慢病毒组成的组中的一种以上。13.根据权利要求10所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征在于，上述细胞为选自由干细胞、树突状细胞、自体肿瘤细胞、及已建立的肿瘤细胞组成的组中的一种以上。14.根据权利要求13所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征在于，上述干细胞为间充质干细胞。15.根据权利要求14所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征在于，上述间充质干细胞为脐带来源间充质干细胞。16.根据权利要求10所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征
在于，上述肌肉骨骼系统疾病为肌腱疾病或韧带疾病。17.根据权利要求16所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征在于，上述肌腱疾病为选自由肌腱损伤、肌腱断裂、肌腱炎、肌腱变性及腱鞘炎组成的组中的一种以上，上述韧带疾病为选自由股四头肌韧带断裂、冠状韧带扭伤、副韧带损伤、前交叉韧带损伤、后交叉韧带损伤、踝关节韧带损伤、韧带断裂及扭伤组成的组中的一种以上。18.根据权利要求10所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药物组合物，其特征在于，上述组合物增加scx、mkx、egr-1、egr-2的表达或活性。19.一种用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物的筛选方法，其特征在于，包括：步骤(a)，使损伤的肌腱、韧带、肌肉、软骨或骨细胞与试验物质接触；以及步骤(b)，测量上述试样中的zkscan 8基因或蛋白的表达水平，在上述步骤(b)中，当zkscan 8的表达水平相比于正常对照组增加时，判定上述试验物质为用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物。20.根据权利要求19所述的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物的筛选方法，其特征在于，上述肌肉骨骼系统疾病为肌腱疾病或韧带疾病。

技术总结
本发明涉及肌肉骨骼系统疾病的诊断用组合物、用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物。本发明中发掘的Zkscan 8可以有效用作能够获得有关肌肉骨骼系统疾病，具体地，能够获得有关肌腱疾病或韧带疾病的发病与否及发展阶段的准确信息的优秀的生物标记物。并且，本发明的组合物可以通过Zkscan 8的过表达来有效地用作用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的组合物。合物。合物。


技术研发人员：赵显哲 黄英一 金珍姬 金珍弘 李在炯 林贤珠 李我英 李昇宴 芮知慧 金艺率
受保护的技术使用者：首尔大学校产学协力团 清州大学校产学协力团
技术研发日：2021.07.02
技术公布日：2023/7/12