一株氧化亚铁硫杆菌诱变菌株及其应用

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株氧化亚铁硫杆菌诱变菌株及其应用。


背景技术：

2.磁小体为单磁畴磁性晶体，在生理条件下具有超顺磁性、高生物活性、良好的分散性、无毒性、较高的饱和磁化强度以及温和的矫顽力等特性。与人工合成的磁性纳米颗粒相比，最大的特征在于磁小体是被称为磁小体膜的脂质双层膜所包裹。并且由于磁小体具有优异的磁性质，使其在现代生物医学、生物化学、新型纳米技术以及环境保护等高新科技领域具有潜在的应用价值，有望成为一种新型的具有广阔发展前景的微生物资源(文献：纳米磁小体在中医药学中的应用前景[j].中国中西医结合杂志，2022，42(07)：891-896.)。
[0003]
目前可产磁小体的微生物包括趋磁细菌和一些非趋磁细菌。趋磁细菌一般为专性微好氧或兼性厌氧菌，对磁小体的生长和产量培养要求严格，需控制微好氧环境，具有生长条件难以模拟、营养要求苛刻以及对氧气浓度的敏感程度等特性，阻碍了它们在实验室条件下的分离和培养，无法进行大规模培养，导致其产量低。以氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillus ferrooxidans)为代表的一类非趋磁细菌，克服了分离纯化难等缺点。与趋磁细菌相比，氧化亚铁硫杆菌具有易培养、易纯化、对培养环境要求低等特点，成为近年来在磁小体生产领域的潜力优势菌种资源，但是，氧化亚铁硫杆菌单个细胞所得到的磁小体含量不高，不能满足工业化要求。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌是目前研究最广泛的一种好氧嗜酸的硫杆菌属化能自养菌，属于革兰氏阴性菌。它的最适生长温度为28-35℃，最适生长ph为1.5-2.5，主要以co2为碳源，同时吸收氮磷等无机营养物来合成自身细胞。前期专利公开了野生株acidithiobacillus ferrooxidans bym单个细胞可获得的磁小体数量为0-3个，具有产磁小体的潜力，但是仍然无法满足工业化需求，其产磁能力仍然有较大的提升空间(专利名称为：一株高产磁小体的氧化亚铁硫杆菌及其应用，cn201811362858.7)。
[0004]
磁小体作为新型的生物源磁性纳米颗粒具有巨大的应用潜力，为了提高氧化亚铁硫杆菌的磁小体产量，已通过单因素分析等手段优化培养条件，但目前趋磁细菌生产磁小体产量仍不能满足需求，且价格昂贵。
[0005]
重离子束作为一种先进高效的物理诱变源，具有传能线密度大，相对生物效应高，损伤后修复效应小等其他常规辐射源所不具备的优势，因此重离子诱变手段在农作物及微生物育种的研究中得到了广泛的应用，但是诱变结果是随机，能否获得令人满意的结果也是难以预料的。


技术实现要素：

[0006]
鉴于现有技术所存在的问题，本发明一株磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株及其应用，以提高磁小体产量和单个细胞的磁小体数量。
[0007]
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008]
本发明提供一株嗜酸性氧化亚铁硫杆菌诱变菌株，该菌株通过重离子辐照对野生
株acidithiobacillus ferrooxidans bym进行诱变筛选获得，诱变菌株名称为氧化亚铁硫杆菌bymt-200(acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200)，保藏编号为cctcc no：m 20221974，于2022年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0009]
该菌株是一种好氧嗜酸的化能自养菌，有鞭毛，属于革兰氏阴性细菌，最适生长温度为25-33℃，最适生长ph为2.0-2.5。该菌的形态呈短杆状，长约1.0um，宽度约0.5um。该菌能够以feso4为能源物质，在液体培养基中生长，生长至对数期菌液呈酒红色。
[0010]
该菌株基于
12c6+
离子束诱变技术，对野生株acidithiobacillus ferrooxidans bym进行诱变和筛选后获得。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌诱变菌株acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200在其生长活动中，磁小体的产量是野生株的1.3倍，可达1.65mg/l，单个细胞的磁小体数量得到了显著提高，提高至12-16个，是一种极具潜力的规模化生产磁小体的生产菌种。
[0011]
上述磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株的
12c6+
重离子辐照诱变及辐照菌种的筛选方法可以包括以下步骤：
[0012]
(1)辐照诱变：
[0013]
将培养至对数期的氧化亚铁硫杆菌稀释至1
×
108ml-1
，置于无菌培养皿中。使用重离子加速器浅层终端装置进行辐照，重离子束流为
12c6+
离子束。离子束能量和剂量分别为80-100mev/u和40-60gy/min。靶源距110-130cm。辐照剂量范围为10-200gy，具体的，辐照剂量分别为10gy、20gy、40gy、80gy、120gy、160gy、200gy，每份样品设置3个重复。
[0014]
(2)筛选突变菌株：
[0015]
将辐照后的样品培养至对数期，进行传代3-4次，通过重铬酸钾滴定法测定亚铁氧化率和氧化速率，筛选出生长速率较快的菌株，通过邻菲罗啉法测定细胞内总铁含量，初步筛选磁小体高产菌株，根据优化的提取磁小体的实验方法提取磁小体，筛选出磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株。
[0016]
本发明还提供一种菌剂，包括上述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株。该菌剂具有趋磁性更强、磁小体产量高、磁小体数量多等优点。菌剂中除了氧化亚铁硫杆菌诱变菌株还可以包括其他成分。菌剂可以为固体也可以为液体，或者其他形态。
[0017]
本发明提供上述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株的发酵方法，包括以下步骤：将上述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株接种发酵培养基发酵培养。
[0018]
进一步，接种量可以为8-12％，培养的初始ph可以为2.0，初始fe
2+
的浓度可以为40g/l，发酵培养温度可以为25-33℃，转速可以为90-120rpm，培养时间可以为0-36h。
[0019]
进一步，所述发酵培养基为液体发酵培养基。
[0020]
本发明提供上述磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株的培育方法，可以包括以下步骤：将磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株接种于液体培养基，进行发酵培养。具体的，可以包括以下步骤：将筛选出的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株bymt-200按照接菌量8-12％(v/v)接种至液体培养基，培养的初始ph为2.0，初始fe
2+
的浓度为40g/l，于温度为25-33℃、转速为90-120rpm的摇床中震荡发酵培养0-36h。
[0021]
优选地，一株磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株bymt-200液体培养基包括以下组分：(nh4)so40.24-2.4g/l，kcl0.1-1.0g/l，k2hpo40.5-5.0g/l，mgso4·
7h2o0.5-5.0g/
l，ca(no3)20.01-0.1g/l；feso4·
7h2o10-40g/l，c6h
12
o72.94g/l；加蒸馏水溶解，ph调节为1.8-2.2。
[0022]
本发明提供上述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株在生产磁小体中的应用。
[0023]
本发明提供上述菌剂在生产磁小体中的应用。
[0024]
本发明提供一种生产磁小体方法，包括以下步骤：收集上述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株或菌剂的菌体，破碎菌体，磁收集磁小体。
[0025]
进一步，包括以下步骤：将收集后的菌体分散至缓冲液中，水浴，冷却，在超声功率为350-450w条件下冰浴超声破碎45-90min后，静置沉淀过夜，磁收集45-90min，得到沉淀，洗涤沉淀，得到磁小体。
[0026]
进一步，在收集菌体前，还包括将上述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株或上述菌剂发酵培养的步骤。具体的，可以采用上述发酵方法进行发酵培养。
[0027]
本发明提供一种生产磁小体的方法，可以包括以下步骤：
[0028]
(1)大批量发酵培养上述高产磁小体的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株；
[0029]
(2)收集步骤(1)中培养所获得的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株的菌体，加入缓冲液后，冰浴超声破碎，利用磁收集等手段获得磁小体。
[0030]
具体的，步骤(2)中，获得磁小体可以包括以下步骤：将收集得到的菌体分散至20ml tris-hcl缓冲液中，于37℃水浴，然后在超声功率为350-450w条件下冰浴超声破碎45-90min后，静置沉淀过夜，磁收集45-90min倾出废液得到沉淀，然后用hepes缓冲液反复吹洗聚集在试管底部的磁小体颗粒以去除静电吸附的杂质，最后用hepes缓冲液清洗磁小体4-10次，得到磁小体。
[0031]
与现有技术相比，本发明包括以下优点：
[0032]
(1)利用重离子束进行诱变，其稳定、可靠、迅速，可以大大缩短育种周期，同时还容易控制，方法简便易行；
[0033]
(2)利用重离子束诱变筛选的获得的磁小体高产突变株bymt-200，其对人工磁场的趋磁性强于野生株，磁小体产量更是野生株的1.3倍，可达1.65mg/l。其单个细胞的磁小体数量是野生株的1.59倍，可达13.85个。由此可见，利用重离子束对氧化亚铁硫杆菌进行诱变，可使其磁小体产量提高，本发明获得的磁小体高产突变株bymt-200具有巨大的应用价值。
附图说明
[0034]
图1为氧化亚铁硫杆菌突变株acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200透射电镜照片(注：图1中，黑色箭头指向a.ferrooxidans bymt-200菌体，白色箭头指向磁小体)。
[0035]
图2为氧化亚铁硫杆菌突变株acidithiobacillus fefrooxidans bymt-200菌液的照片(注：图2中，左侧为未加菌液的空白对照，右侧为培养至对数期的acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200)。
具体实施方式
[0036]
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并
非用于限定本发明的范围。
[0037]
本发明提供了一株磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株及其应用。该菌株名称为氧化亚铁硫杆菌bymt-200(acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200，a.ferrooxidans bymt-200)，该菌株保藏编号为cctcc no：m 20221974，该菌株于2022年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0038]
该菌株是一种好氧嗜酸的化能自养菌，有鞭毛，属于革兰氏阴性细菌。利用型号为hitachi h-7650的透射电镜观察该菌的形态呈短杆状，长度约1.0um，宽度约0.5um。图1为氧化亚铁硫杆菌突变株acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200透射电镜照片，图1中，黑色箭头指向a.ferrooxidans bymt-200菌体，白色箭头指向磁小体，从图1中可以看出，氧化亚铁硫杆菌突变株bymt-200具有较多的磁小体。
[0039]
图2为氧化亚铁硫杆菌突变株acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200菌液的照片，图2中，左侧为未加菌液的空白对照，右侧为培养至对数期的acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200)。从图2中可以看出，左侧图片中培养基未发生颜色变化，右侧图片中培养基变为酒红色，这是由于该菌能够以feso4为能源物质在液体培养基中生长，生长至对数期菌液呈酒红色。
[0040]
为了方便使用，上述菌株还可以制作成菌剂。
[0041]
本发明提供上述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株和/或菌剂在生产磁小体中的应用。
[0042]
本发明提供上述高产磁小体的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株的培育方法，包括以下步骤：以野生型氧化亚铁硫杆菌作为出发菌株培养至对数期，利用重离子加速器对对数期菌株进行诱变，获得高产磁小体的氧化亚铁硫杆菌acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200突变株，将高产磁小体的氧化亚铁硫杆菌bymt-200突变株接种于培养基中，发酵培养。
[0043]
本发明提供一种生产磁小体菌株的发酵方法，包括以下步骤：采用上所述氧化亚铁硫杆菌acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200作为发酵菌发酵。
[0044]
本发明提供一种生产磁小体的方法，包括以下步骤：
[0045]
(1)发酵上述高产磁小体的氧化亚铁硫杆菌；
[0046]
(2)收集步骤(1)获得的菌体，加入缓冲液后，超声破碎，磁收集，得到磁小体。
[0047]
进一步，步骤(2)中，使用冰浴超声缓冲液提取磁小体，将收集到的菌体分散到tris-hcl缓冲液350w-450w冰浴超声破碎45-90min后，磁收集45-90min倾倒废液得到沉淀，洗涤沉淀4-10次，得到磁小体。
[0048]
本发明提供一种筛选上述高产磁小体的氧化亚铁硫杆菌的方法，包括以下步骤：使用重离子束
12c6+
对生长至对数期的氧化亚铁硫杆菌进行不同剂量的辐射，对不同辐照剂量下的菌株进行活化，逐级传代培养，选取在传代培养中磁小体产量稳定提高的突变菌株，最终筛选得到acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200。
[0049]
本发明利用重离子束辐照对氧化亚铁硫杆菌进行诱变，筛选出一株磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌a.ferrooxidans bymt-200，该菌株具有易培养、趋磁性强、磁小体产量稳定等优点。单个细胞的磁小体数量可达12-14个，是野生株的1.59倍。因此，即便在实验室也可用该磁小体高产的菌株a.ferrooxidans bymt-200作为生物工厂生产大量磁小体。
[0050]
若未经特殊说明，本发明涉及的实验材料均为本领域的常规的实验材料，可以通过市购获得或通过常规方法进行配制。若未经特殊说明，本发明采用的实验方法均为本领
域的常规实验方法。
[0051]
下面通过具体实施例来介绍。
[0052]
实施例1
[0053]
采用重离子加速器提供的
12c6+
离子束对氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillus ferrooxidans bym)进行辐照诱变，并经过筛选传代获得磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株。
[0054]
以氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillus ferrooxidans bym)为出发菌株，该菌株已于专利申请号为201811362858.7(申请公布号为cn109251878a)的中国发明专利公开，专利名称为：一株高产磁小体的氧化亚铁硫杆菌及其应用，并于2020年8月18日获得专利授权，在该专利中氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillus ferrooxidans bym)的保藏号为cctcc no：m2018630。
[0055]
采用中国科学院近代物理研究所中国材料辐照装置重离子加速器浅层终端装置(china material lrradiation facility，cmlf)进行辐照，重离子束流为
12c6+
离子束。设计不同辐照剂量分别为10-200gy，具体的，辐照剂量可以分别设置为10gy、20gy、40gy、80gy、120gy、160gy、200gy，每份样品设置3个重复；离子束能量和剂量分别为80-100mev/u和40-60gy/min。靶源距110-130cm。
[0056]
将经不同诱变剂量处理后的氧化亚铁硫杆菌分别接种于96孔板中，每个样品设置3个重复，每个孔中含有200ul液体培养基。并置于温度为25-33℃的恒温培养箱中培养。
[0057]
液体培养基的配制方法包括以下步骤：配制a液和b液，将a液和b液混合。以配制1000ml液体培养基为例(溶剂为蒸馏水)，a液中的成分在液体培养基中的含量分别为：(nh4)so40.24-2.4g，kcl0.1-1.0g，k2hpo40.5-5.0g，mgso4·
7h2o0.5-5.0g，ca(no3)20.01-0.1g。b液中的成分在液体培养基中的含量分别为：feso4·
7h2o10-40g，c6h
12
o71.94-2.94g；将ph调节为1.8-2.2。
[0058]
观察氧化亚铁硫杆菌诱变株存活情况，将诱变后的成功活化的22株菌按照8-12％的接种量分别接入液体培养基(配制方法同上)中，进行扩大培养，每个样品设置3个重复，于温度为25-33℃，转速为90-120rpm的摇床中震荡培养，培养24-48h至对数期备用。
[0059]
实施例2
[0060]
通过重铬酸钾滴定法测定亚铁氧化率和氧化速率，取实施例1中培养至对数期的氧化亚铁硫杆菌突变株的菌液1ml，加入1ml的硫磷混合酸。
[0061]
硫磷混酸的配制方法包括以下步骤：先将120-160ml的浓h2so4(w/v，98％)缓慢加入600-800ml水中，冷却至室温再加入120-160ml磷酸(w/v，85％)，浓h2so4与磷酸的体积比为1：1，混匀后使用。
[0062]
菌液与硫磷混酸摇匀后加入100-200ul的5g/l二苯胺磺酸钠溶液，以紫色为滴定终点，采用0.05-0.005mmol/l的重铬酸钾进行滴定，记录使用重铬酸钾的质量，根据公式计算亚铁氧化率和氧化速率，筛选出生长速率较快的菌株，结果表明，生长速率较快的菌株分别来自40gy、80gy以及200gy辐照剂量处理的诱变菌株。
[0063]
实施例3
[0064]
通过邻菲罗啉法测定细胞内总铁含量，取实施例1中培养至对数期的氧化亚铁硫杆菌突变株的菌液，利用孔径为0.22um的微孔滤膜进行过滤，得到菌体。将收集的菌体样品
置于玻璃管中，50-80℃烘干至恒重，然后向玻璃管中各加入0.5-0.8ml硝酸(hno3)和0.5-0.8ml盐酸(hcl)，在36-45℃条件下溶解菌体，最后再采用80-120℃水浴消化菌体至液体无色澄清，消化完的菌体样品用邻菲罗啉比色法检测总铁含量，然后计算每毫克干菌体所含总铁的量。
[0065]
邻菲罗啉比色法可以参照以下文献记载的方法操作：张悦君，何旭伦，黎喜云，等.《邻菲罗啉分光光度法测定水中微量铁》实训改进研究[j].绿色科技，2020(21)：271-272+274.dol：10.16663/j.cnki.lskj.2020.21.107.
[0066]
实施例4
[0067]
通过实施例1至实施例3的方法筛选出了一株磁小体产量最高的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株，可以作为磁小体高产菌株进行应用，其磁小体产量为1.6-1.8mg/l，来源于辐照剂量为200gy的菌株。将其命名为氧化亚铁硫杆菌bymt-200(acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200，a.ferrooxidans bymt-200)。将其于2022年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20221974，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。并将其用于后续的实验。
[0068]
取培养至对数期的氧化亚铁硫杆菌突变株acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200的菌液，利用孔径为0.22um的微孔滤膜进行过滤，得到bymt-200菌体。用ph为2的h2so4溶液(w/v，98％)进行漂洗，2000-6000rpm离心5min，取上清液，8000-12000rpm离心5min，取沉淀，再次8000-12000rpm离心5min后取沉淀，得到菌体。然后进行巴斯德管收集。取若干个尖端被酒精灯融封且经过120℃15min高温灭菌的巴斯德管，将菌液加入巴斯德管末端。靠近磁铁s端，磁收集30-45min后，取尖端1-3cm，用1ml注射器将菌液吸出，注入液体培养基中，于温度为30-40℃，转速为80-120rpm的摇床中培养。培养24-48h至对数期备用。
[0069]
实施例5
[0070]
提取磁小体包括以下步骤：将收集得到的菌体悬浮于15-25ml的tris-hcl缓冲液中，于30-40℃条件下水浴45-60min，冷却至室温，然后在冰浴条件350-450w超声处理45-90min。超声结束后，将细胞悬液转入平底试管中，将试管底部置于磁铁s级，静置沉淀过夜，磁收集45-90min倾出废液得到沉淀，然后用hepes缓冲液反复吹洗聚集在试管底部的磁小体颗粒以去除静电吸附的杂质，最后用hepes缓冲液清洗磁小体4-10次，得到磁小体，加入生理盐水于4℃保存备用。
[0071]
分别将野生株acidithiobacillus ferrooxidans bym和诱变菌株bymt-200采用上述方法提取磁小体。经检测，bymt-200诱变菌株所获得的磁小体的产量1.6-1.8mg/l，是野生株bym磁小体产量的1.3倍。bymt-200诱变菌株单个细胞的磁小体数量是野生株的1.59倍，可达13.85个。因此，该诱变菌株bymt-200可以作为磁小体高产的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株进行进一步应用。
[0072]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一株氧化亚铁硫杆菌诱变菌株，其特征在于，诱变菌株名称为氧化亚铁硫杆菌bymt-200(acidithiobacillus ferrooxidans bymt-200)，保藏编号为cctcc no：m 20221974。2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株。3.权利要求1所述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株接种发酵培养基发酵培养。4.根据权利要求3所述发酵方法，其特征在于，接种量为8-12％，培养的初始ph为2.0，初始fe
2+
的浓度为40g/l，发酵培养温度为25-33℃，转速为90-120rpm，培养时间为0-36h。5.根据权利要求3或4所述发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基为液体发酵培养基。6.权利要求1所述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株在生产磁小体中的应用。7.权利要求2所述菌剂在生产磁小体中的应用。8.一种生产磁小体方法，其特征在于，包括以下步骤：收集权利要求1所述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株或权利要求2所述菌剂的菌体，破碎菌体，磁收集磁小体。9.根据权利要求8所述生产磁小体方法，其特征在于，包括以下步骤：将收集后的菌体分散至缓冲液中，水浴，冷却，在超声功率为350-450w条件下冰浴超声破碎45-90min后，静置沉淀过夜，磁收集45-90min，得到沉淀，洗涤沉淀，得到磁小体。10.根据权利要求8或9所述生产磁小体方法，其特征在于，在收集菌体前，还包括将权利要求1所述氧化亚铁硫杆菌诱变菌株或权利要求2所述菌剂发酵培养的步骤。

技术总结
本发明涉及一株氧化亚铁硫杆菌诱变菌株及其应用。诱变菌株名称为氧化亚铁硫杆菌BYMT-200(Acidithiobacillus ferrooxidans BYMT-200)，保藏编号为CCTCC NO：M 20221974。该菌株于2022年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学。相比野生株，经重离子束诱变筛选后获得的氧化亚铁硫杆菌诱变菌株对人工磁场的趋磁性更强，磁小体产量是野生株的1.3倍，可达1.65mg/L。其单个细胞的磁小体数量是野生株的1.59倍，可达13.85个。13.85个。13.85个。


技术研发人员：张爽 晏磊 邢思雨 刘涛 赵丹 孙新迪 耿丽蓉
受保护的技术使用者：黑龙江八一农垦大学
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/7/13