抗CMLC-1的单克隆抗体8A3及其应用的制作方法

抗cmlc-1的单克隆抗体8a3及其应用
技术领域
1.本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及抗人心肌球蛋白轻链1的单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.心血管疾病已成为21世纪人类健康的头号杀手，统计资料显示，全球每年有1700万人死于心血管疾病，其中一半以上死于心肌梗塞。近十年来，我国心肌梗塞的发病率已接近国际上的平均水平，而且年轻患者(40岁以下)的发病率在逐步增高。心肌梗塞起病突然，急性期死亡率约为30％。ami临床上检测手段多种多样，但在心电图不明确或临床症状不典型时，常常被误诊。所以早期和晚期诊断标志物的生化检测尤其重要。找到一种简便快速、灵敏、特异度强、早预报、持续时间长的检测检测指标，对临床判定、预后评估以及监测复发都具有重要意义。
3.目前研究较多的ami标志物，血液生化检查中主要有心肌酶学：ck、ck-mb、ldh、ast等，心肌蛋白学：mb、ck-mb、cmlc、ctni等。研究表明，ami患者发病后3h时，mb、cmlc、ctni的含量均显著增高，而ck、ldh、ast与对照组无明显差异。且。虽然cmlc-1早期诊断ami的灵敏性与ck-mb类似，但其窗口期时间可长达两周左右，对那些延迟就诊的ami诊断患者来说其检测灵敏度显著高于ck-mb。
4.心肌球蛋白轻链(cardiac myosin light chain，cmlc)是心肌球蛋白(ms)的轻链，ms是心肌细胞的重要结构和收缩蛋白，由2条重链(mhc)和2条轻链(cmlc-1)和(cmlc-2)组成，分子量分别为27kda，20kda。cmlc-1在心肌细胞主要以二种方式存在：小部分游离于肌浆内；大部分是以结构蛋白的形式固定于肌球蛋白上。正常时血液中并不能被检测到，在心肌组织受损、心肌细胞膜破坏后释放到血液中，心肌细胞损伤越严重，血清cmlc水平越高。心肌梗塞时，cmlc-1的释放具有双相性的特点：发病后4-6h很快上升，逐渐到达峰值平台并持续超过1周。其早期升高是由于包浆池中游离cmlc-1的释放，其后的峰值平台(4d-7d)则是肌原纤维裂解、固定形式存放的cmlc-1持续释放入血所致。在肾功能正常情况下cmlc-1经肾很快清除，故心梗后cmlc-1的持续升高是因为梗死心肌纤维中的cmlc-1的持续释放造成，而非血液中的cmlc-1的积聚。且cmlc-1的主要氨基酸序列与其他横纹肌及平滑肌的肌球蛋白轻链不同，故利用其单克隆抗体测定血中cmlc-1具有较高的特异性和灵敏性，与肌动蛋白、骨骼肌无交叉反应。因此血清cmlc-1的测定用于ami的诊断，较心电图和其他血清酶更敏感和特异，可作为aim早期和晚期标志物，且可作为观察病情、判断预后的临床监测指标，指导临床治疗。


技术实现要素：

5.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型的抗人cmlc-1单克隆抗体、包含所述单克隆抗体的组合物及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.在本发明第一方面，提供了一种分离的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段，所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段与cmlc-1特异性地结合。
8.进一步，所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段包括轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3、重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3。
9.进一步，所述重链cdr1含有seq id no:1所示的氨基酸序列或与seq idno:1具有至少70％同一性的氨基酸序列。
10.进一步，所述重链cdr2含有seq id no:2所示的氨基酸序列或与seq idno:2具有至少70％同一性的氨基酸序列。
11.进一步，所述重链cdr3含有seq id no:3所示的氨基酸序列或与seq idno:3具有至少70％同一性的氨基酸序列。
12.进一步，所述轻链cdr1含有seq id no:4所示的氨基酸序列或与seq idno:4具有至少70％同一性的氨基酸序列。
13.进一步，所述轻链cdr2含有seq id no:5所示的氨基酸序列或与seq idno:5具有至少70％同一性的氨基酸序列。
14.进一步，所述轻链cdr3含有seq id no:6所示的氨基酸序列或与seq idno:6具有至少70％同一性的氨基酸序列。
15.进一步，所述单克隆抗体8a3的重链可变区具有seq id no:7所示的氨基酸序列。
16.进一步，所述单克隆抗体8a3的轻链可变区具有seq id no:8所示的氨基酸序列。
17.在本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸分子或包含其的重组载体，所述多核苷酸分子包括前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3的核苷酸序列、前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3的核苷酸序列、前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的重链可变区的核苷酸序列、前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的轻链可变区的核苷酸序列。
18.进一步，所述重链cdr1的核苷酸序列如seq id no:9所示。
19.进一步，所述重链cdr2的核苷酸序列如seq id no:10所示。
20.进一步，所述重链cdr3的核苷酸序列如seq id no:11所示。
21.进一步，所述轻链cdr1的核苷酸序列如seq id no:12所示。
22.进一步，所述轻链cdr2的核苷酸序列如seq id no:13所示。
23.进一步，所述轻链cdr3的核苷酸序列如seq id no:14所示。
24.进一步，所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的重链可变区的核苷酸序列如seq id no:15所示。
25.进一步，所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:16所示。
26.进一步，所述载体包括但不限于线性多核苷酸、质粒和病毒载体。
27.进一步，所述病毒载体包括但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
28.在本发明第三方面，提供了一种经过改造宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，所述改造宿主细胞包含前面所述的多核苷酸分子或包含其的重组载体、前面所述的单克隆抗
体8a3或其抗原结合片段。
29.进一步，所述宿主细胞群体还包含所述改造宿主细胞之外的宿主细胞。
30.进一步，所述改造宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
31.进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
32.进一步，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌。
33.进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
34.在本发明第四方面，提供了一种单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物，所述抗体衍生物包括前面所述的抗cmlc-1的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段直接或间接偶联至可检测标记物形成的复合物。
35.进一步，所述可检测标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素、酶标记物。
36.进一步，所述荧光色素包括荧光素、罗丹明、texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白。
37.进一步，所述亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素。
38.进一步，所述放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴。
39.进一步，所述酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
40.在本发明第五方面，提供了一种单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的偶联物，所述偶联物包括前面所述的抗cmlc-1的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段与治疗剂偶联形成的偶联物。
41.进一步，所述治疗剂包括细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂。
42.在本发明第六方面，提供了一种检测cmlc-1的产品，所述产品包括前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段或前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物。
43.进一步，所述产品包括试剂盒、芯片或高通量测序平台。
44.进一步，所述试剂盒包括带有cmlc-1的微孔板。
45.进一步，所述试剂盒包括化学发光液。
46.进一步，所述化学发光液包括酶促反应发光剂、直接化学发光剂、电化学发光剂。
47.进一步，酶促反应发光剂包括酶促反应酶和酶促反应酶的发光底物。
48.进一步，酶促反应酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
49.进一步，酶促反应酶的发光底物包括辣根过氧化物酶的发光底物、碱性磷酸酶的发光底物、葡萄糖氧化酶的发光底物、β-半乳糖苷酶的发光底物、溶菌酶的发光底物、苹果酸脱氢酶的发光底物。
50.进一步，所述辣根过氧化物酶的发光底物包括鲁米诺或其衍生物、对-羟基苯乙酸。
51.进一步，所述碱性磷酸酶的发光底物包括amppd、4-甲基伞形酮磷酸盐。
52.进一步，所述直接化学发光剂包括不需要酶的催化作用，只需要改变溶液的ph条件就能发光的试剂。
53.进一步，所述电化学发光剂包括在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。
54.进一步，所述可检测标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素、酶标记物。
55.进一步，所述荧光色素包括荧光素、罗丹明、texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白。
56.进一步，所述亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素。
57.进一步，所述放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴。
58.进一步，所述酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
59.在本发明第七方面，提供了4种方法，所述方法包括：
60.(1)一种生产前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的方法，所述方法包括如下步骤：培养前面所述的改造宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，从培养物中分离出前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段。
61.(2)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中cmlc-1或其片段的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段接触或将待测样品与前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物接触，检测所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段或单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物与cmlc-1或片段的复合物的形成。
62.(3)一种制备前面所述的改造宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的多核苷酸分子或包含其的重组载体导入到宿主细胞中。
63.进一步，所述导入的方式包括磷酸钙转染、deae、右旋糖介导的转染、电穿孔、噬菌体感染。
64.(4)一种特异性地抑制cmlc-1的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的重组载体导入到生物体细胞中，通过表达前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段抑制cmlc-1的活性。
65.进一步，所述生物体细胞是体外培养的细胞。
66.在本发明第八方面，提供了一种治疗心血管疾病的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段，或前面所述的偶联物。
67.进一步，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
68.进一步，所述赋形剂包括黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、软膏剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。
69.进一步，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、缺血性心脏疾病、冠状动脉心脏疾病、高血压、心功能不全、心律不齐、心肌病、心内膜炎、末梢动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、动脉炎、心肌炎、心血管炎、不稳定型心绞痛、不稳定型难治愈性心绞痛、稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞。
70.进一步，所述心肌梗塞包括一次或复发型心肌梗塞、无q波型心肌梗塞、非st段抬高型心肌梗塞、st段抬高型心肌梗塞。
71.在本发明第九方面，提供了前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的重组载体或前面所述的改造宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的应用，所述应用包括以下任一项：
72.(1)在制备检测cmlc-1或其片段的产品中的应用。
73.(2)在制备治疗心血管疾病的药物组合物中的应用。
74.进一步，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、缺血性心脏疾病、冠状动脉心脏疾病、高血压、心功能不全、心律不齐、心肌病、心内膜炎、末梢动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、动脉炎、心肌炎、心血管炎、不稳定型心绞痛、不稳定型难治愈性心绞痛、稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞。
75.进一步，所述心肌梗塞包括一次或复发型心肌梗塞、无q波型心肌梗塞、非st段抬高型心肌梗塞、st段抬高型心肌梗塞。
76.(3)在制备调节cmlc-1活性或水平的药物中的应用。
77.在本发明第十方面，提供了前面所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物在制备用于检测待测样品中的cmlc-1或其片段，或诊断受试者是否患有心血管疾病的产品中的应用。
78.进一步，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、缺血性心脏疾病、冠状动脉心脏疾病、高血压、心功能不全、心律不齐、心肌病、心内膜炎、末梢动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、动脉炎、心肌炎、心血管炎、不稳定型心绞痛、不稳定型难治愈性心绞痛、稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞。
79.进一步，所述心肌梗塞包括一次或复发型心肌梗塞、无q波型心肌梗塞、非st段抬高型心肌梗塞、st段抬高型心肌梗塞。
80.定义
81.术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于holliger和hudson(2005)nat.biotechnol.23:1126-1136中。
82.术语“可检测标记物”是指一种例如通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的试剂。有用的可检测标记物包括但不限于，荧光染料、化学发光化合物、放射性同位素、电子密集试剂、酶、有色颗粒、生物素或地高辛(dioxigenin)。可检测标记物往往会产生可测量的信号，如放射性、荧光、颜色或酶活性。与可检测试剂偶联的抗体可用于诊断或治疗目的。可检测试剂的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属、和非放射性顺磁金属离子。可检测物质可以采用本领域已知技术直接地与抗体、或间接地通过中间体如本领域已知的接头，连接或偶联。参见，美国专利第4,741,900号，记载了金属离子与抗体的偶联用于诊断。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯
酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；发光材料的一个实例包括发光氨；生物发光材料的实例包括虫荧光素和发光蛋白质。
83.术语“赋形剂”是指在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。对赋形剂的一般要求是性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。
84.术语“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个dna分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数
×
100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。“优化”指保持或改善了所述抗体与抗原结合的突变，在本发明中，指保持、维持或改善了与sirpα的结合的突变。
85.术语“重组载体”是指包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
86.术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，或者如纤维原细胞、cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞、hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。
87.术语“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
88.术语“交叉反应原”是指与待测物质具有较高的同源性、序列相似或者具有相似检测意义的蛋白。
89.术语“治疗剂”是指包含细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂中的一种或多种。
附图说明
90.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
91.图1是pcr反应扩增cmlc-1目的基因的琼脂糖凝胶电泳结果图；
92.图2是含有cmlc-1质粒的大肠杆菌阳性检测琼脂糖凝胶电泳结果图；
93.图3是pet-28-cmlc-1原核表达质粒bamhi与xhoi双酶切验证的琼脂糖凝胶电泳结果图；
94.图4是pet-28-cmlc-1重组抗原sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
具体实施方式
95.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
96.实施例1重组人心肌球蛋白轻链1蛋白的制备与纯化
97.1.按如下反应体系与反应条件进行pcr反应扩增cmlc-1目的基因：
98.1)pcr反应体系的配制
99.cdna 4μl、cmlc-1上游引物2μl、cmlc-2下游引物2μl、2
×
反应混合溶液25μl、ddh2o 17μl、总共50μl。
100.2)pcr反应条件
101.首先94℃预变性5min，之后进行30个循环的反应，反应包括94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。
102.其中2
×
反应混合溶液为北京全式金生物技术有限公司生产的2
×
transtaq-tpcr supermix(货号as122)，主要成分包含dna聚合酶、dntp与反应缓冲液。cmlc-1上游引物、cmlc-2下游引物是根据genbank中登录人cmlc的基因编码区序列(登陆号bc009790)，选取基因部分片段59-646bp(序列如seq idno:17所示)进行克隆重组。利用primer-primer 5.0引物设计软件进行引物设计，并分在上游引物与下游引物5’端分别加入bamhi和xhoi限制性酶切位点，并交由北京博迈德基因技术有限公司合成cmlc-1上游引物序列如seq id no:18所示，cmlc-1下游引物序列如seq id no:19所示。
103.2.对pcr扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。扩增的dna条带大小位于500-1000bp之间，与cmlc-1目的基因片段588bp位置相符。使用北京全式金生物技术有限公司生产的琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号h41118)，根据制造商使用说明书实施操作，对pcr扩增产物进行回收。
104.3.使用北京全式金生物技术有限公司t载体连接试剂盒(货号h20724)，根据使用说明书，dna回收产物与peasy-t1 simple载体于25℃下连接15min。将10μl连接产物转化加入至50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上孵育30min，42℃热应激90s后，立即放置冰上2min，加入500μl lb液体培养基，37℃下200-250rpm振荡培养45min后，将菌液涂在具有氨苄抗性筛选培养板上，平板正向放置10min后，晾干残余菌液，倒置平皿，37℃培养过夜。
105.4.随机挑取步骤3中6个单菌落于3ml lb培养基中，进行37℃过夜扩大培养。以菌液为cdna模板，进行菌液pcr鉴定，并进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。从图2中可见，以1号至6号克隆为模板扩增dna位置均在600bp之间，与目的基因cmlc-1(588bp)大小位置相符。选取1号、2号、3号克隆送至北京博迈德基因技术有限公司进行dna测序。反馈的测序报告与genbank中登录人心肌球蛋白轻链1的基因编码区序列(登录号bc009790)进行blast对比，其中3号克隆测序基因序列与目的基因序列完全一致。
106.5.使用纽英伦生物技术(北京)有限公司生产的限制性内切酶bamhi(货号#r0136v)与xhoi(货号#r0146v)，根据制造商使用说明，对cmlc-1-peasy-t1质粒与原核表达载体pet-28a质粒进行双酶切，使其具有互补粘性末端。使用北京全式金生物技术有限公司
生产的琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号h41118)，根据制造商使用说明书实施操作，将具有互补粘性末端的目的基因产物与酶切载体片段分别进行dna回收。使用大连takara公司生产的t4 dna ligase试剂盒(货号d2011a)，根据制造商使用说明，将具有互补粘性末端的目的基因产物与酶切载体片段进行16℃水浴连接12小时。将连接产物全部加入至50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上孵育30min；42℃热应激90s后，立即放置冰上2min；加入500μl lb液体培养基，37℃200-250rpm振荡培养45min；将菌液涂在具有硫酸卡那霉素抗性筛选培养板上，平板正向放置10min后，晾干残余菌液；倒置平皿，37℃培养过夜。随机挑取2个pet-28a-cmlc-1单菌落于3ml lb培养基中，进行37℃过夜扩大培养。使用北京全式金生物技术有限公司生产的小量提取质粒dna试剂盒(货号h41105)，根据试剂盒使用说明书实施操作，对pet-28a-cmlc-1小提质粒dna。对提取的dna使用纽英伦生物技术(北京)有限公司生产的限制性内切酶bamhi(货号#r0136v)与xhoi(货号#r0146v)进行双酶切验证，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图3。酶切片段，大小在600bp之间，与目的基因cmlc-1(588bp)大小相符。
107.6.对于步骤5构建好的原核表达质粒pet-28-cmlc-1转化bl21(de3)感受态细胞，挑取单克隆菌落于5ml的lb液体培养基(含卡那霉素)中220rpm，37℃培养过夜培养。过夜培养菌按1:100转接到新鲜的lb液体培养基中，220rpm，37℃培养，待菌液浓度od600≈0.6时加入iptg开始诱导(iptg终浓度为0.25mm)；28℃220rpm诱导4h收菌；9500rpm，4℃离心2min，收集菌体。加入预冷的上样缓冲液20ml(300mm nacl、50mm nah2po4、10mm咪唑、10mm tris碱，ph 8.0)，重悬菌体，超声破碎菌体：每处理3秒间隔7秒，超声20min，输出功率50％。9500rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀。上样前将上清用孔径0.22μm的滤膜进行过滤。制好ni
2+-nta亲和层析柱，用去离子水进行缓慢洗脱，用10倍柱床体积的上样缓冲液进行预平衡；将过滤后的样本过柱并收集流出液；用20倍柱床体积的冲洗缓冲液(300mm nacl、50mm nah2po4、20mm咪唑、10mm tris碱，ph 8.0)进行漂洗，收集滤过液。用5倍柱床体积的洗脱缓冲液(300mm nacl、50mm nah2po4、300mm咪唑、10mm tris碱，ph 8.0)进行洗脱，收集目的蛋白，将目的蛋白透析至0.01m pbs缓冲体系。使用北京博迈德基因技术有限公司生产的bca蛋白定量试剂盒(货号pp0102)，根据制造商产品使用说明书实施操作，对pet-28-cmlc-1重组抗原进行定量，蛋白浓度约为2.5mg/ml，最终得到5.5mg。对pet-28-cmlc-1重组抗原sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果见图4，箭头位置为目的蛋白位置，大小在25kd之间，与目的蛋白cmlc-1大小(21kd)位置一致，蛋白纯度大于90％，纯化的蛋白应用于实施例2的免疫原与实施例3中的产品校准品。
108.实施例2抗人cmlc-1鼠单克隆抗体的制备
109.1.选取6周龄、体重约20g的雌性balb/c 3只小鼠。取实施例1中制备的重组蛋白进行免疫。初次免疫，取100μg蛋白加0.01m pbs至500μl，与等体积福氏完全佐剂进行乳化，乳化充分后进行皮下多点注射。分别在第14和35天分别进行第二次和第三次免疫剂量同初次免疫，与福氏不完全佐剂进行乳化，乳化充分后进行皮下多点注射。三次免疫后1周取小鼠尾静脉血，包被重组抗原使用间接elisa法进行血清效价检测，结果如表1所示，选取效价最高的小鼠(b鼠)的脾进行细胞融合。融合前3天加强免疫，取剂量20μg重组蛋白稀释至100μl 0.01m pbs中尾静脉注射小鼠；3天后，取脾进行细胞融合。
110.表1：间接elisa法血清效价检测结果
[0111][0112][0113]
2.取提前3天，加强免疫的小鼠，拉颈处死，无菌取脾脏。用10ml北京钮因泰克生物技术有限公司生产的rmpi-1640(1802-e)无血清培养液洗一次。脾脏研碎，过200目细胞筛。将脾细胞转移至10ml离心管中，800rpm离心10min。细胞用10ml培养液洗2次，用5ml无血清培养重悬细胞，并显微镜下细胞计数，共获得约1
×
108个脾淋巴细胞悬液备用。收获处于对数生长期的小鼠骨髓瘤sp2/0细胞，用10ml无血清培养液洗2次，用5ml无血清培养重悬细胞，并显微镜下细胞计数，共获得约5
×
107个sp2/0细胞悬液备用。
[0114]
3.细胞融合：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：2的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm，8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(peg)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。加入37℃预温的1ml 50％(0.5g/1ml)peg聚乙二醇(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。加37℃预温的不完全培养液以终止peg作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心，800rpm,6min，弃上清，并用含20％(v/v)特级胎牛血清与1
×
hat培养基添加剂hybri-max(sigma货号h0262)选择培养液重悬，将细胞悬液铺至96孔细胞培养板内，每孔加200μl。将培养板置37℃、5％ co2培养箱中培养。
[0115]
4.细胞融合10天后，显微镜下观察，待杂交瘤细胞克隆布满孔底1/5面积时，即可采用间接elisa法检测培养上清，筛选具分泌抗性阳性细胞克隆。用0.05m碳酸盐缓冲液稀释重组蛋白至5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜，将酶标板孔中的液体倒尽，加入pbst，重复洗涤三次；加入保温液(0.5％ bsa，pbst稀释)200μl/孔进行封闭，置于37℃，1小时，拍干备用。加入100μl细胞培养上清，阳性对照加入1:1000保温液稀释的融合小鼠免疫血清，阴性对照为sp2/0培养上清，空白为洗涤液，于37℃静置45min。200μl/孔pbst洗板，重复洗涤三次。加入1:5000稀释hrp标记羊抗鼠二抗100μl/孔，于37℃静置45分钟。200μl/孔pbst洗板，重复洗涤三次。加入底物反应液100μl/孔，37℃置暗处反应10min。加入h2so4(2mol/l)50μl/孔，终止反应。酶标仪检测450nm吸光度值，对比阳性对照od值，选择大于等于阳性对照od值的克隆孔进行克隆化。
[0116]
5.筛选得到的阳性克隆，采用有限稀释法对杂交瘤克隆化，将待克隆的杂交瘤细
胞用用含20％(v/v)特级胎牛血清与1
×
ht培养基添加剂(sigma h0137)选择培养液从培养孔内轻轻吹干，细胞计数，并调整细胞为5个细胞/ml；每孔加入稀释细胞200μl，37℃、5％ co2培养箱中培养。10天可见细胞克隆形成，取单克隆细胞孔培养上清进行间接elisa法检测，并将最强的阳性单克隆再次克隆化，直至单克隆细胞阳性率达100％，即可定株扩大培养并进行细胞冻存。经过3轮克隆化，共保留了3株细胞株，其克隆号为7h3、5e8、8a3。
[0117]
6.腹腔注射500μl/只石蜡油于balb/c小鼠。7天后再将步骤5中获得3株杂交瘤细胞按1
×
106的细胞浓度进行腹腔注射，10天后收集腹水。使用ge医疗中国生产制造的protein g sepharose 4fast flow，根据产品使用说明书，对腹水进行亲和层析纯化。
[0118]
7.用0.05m碳酸盐缓冲液稀释cmlc-1蛋白至0.5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜，将酶标板孔中的液体倒尽，加入pbst，重复洗涤三次；加入保温液(pbst中0.5％ bsa)200μl/孔进行封闭，置于37℃，1小时，拍干备用。使用hrp对3株抗cmlc-1小鼠单克隆抗体进行标记。竞争法对心肌梗塞样本进行检测，结果如表2所示，初步确定的抗体为8a3。
[0119]
表2：心肌梗塞样本检测结果
[0120][0121]
实施例3cmlc-1单克隆抗体化学发光试剂盒的制备
[0122]
1.制备包被有cmlc-1的微孔板：
[0123]
a)包被：采用0.05m、ph值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的实施例2制备的人心肌球蛋白轻链1蛋白，包被浓度0.5μg/ml，并将包被溶液加载于微孔板上120μl/孔，4℃包被12h；
[0124]
碳酸盐缓冲液标准配方：
[0125][0126]
b)洗板：稀释20倍浓缩洗液至1倍浓度，使用1倍浓度洗液洗板2次；20倍浓缩洗液标准配方：
[0127]
[0128]
c)封闭：将封闭液(磷酸氢二钠5.8g、磷酸二氢钠0.593g、氯化钠8.0g、山羊血清100ml、proclin-300 0.5ml，纯化水定容至1000ml)加载于微孔板上，室温2小时，甩干，干燥过夜。
[0129]
2.酶标记抗体的制备：
[0130]
a)称取1mg辣根过氧化物酶(hrp，购自sigma)溶解于300μl蒸馏水中。
[0131]
b)于上液中加入0.6μl新配的0.1m naio4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
[0132]
c)将上述溶液装入透析袋中，使用1mm ph4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
[0133]
d)加20μl 1m ph9.5碳酸盐缓冲液，使hrp的ph升高到9.0至9.5，然后立即加入5mg cmlc-1单克隆抗体8a3(在1ml 0.01m碳酸盐缓冲液中)，室温避光轻轻搅拌2小时。
[0134]
e)加0.05ml新配的4mg/ml nabh4液，混匀，再置4℃2小时。
[0135]
f)将上述液装入透析袋中，对0.15m ph7.4 pbs透析，4℃过夜。
[0136]
g)加入等体积的甘油，-20℃保存，最终辣根过氧化物酶标抗体浓度为1mg/ml。3.样本稀释液的制备：
[0137]
1000ml样本稀释液包括30.0g氯化钠、25.0ml山羊血清、5.0ml吐温-20、0.5ml proclin-300。
[0138]
4.化学发光液a含鲁米诺和发光增强剂，化学发光液b含有过氧化物和发光增强剂。
[0139]
5.酶工作液的配制：将2步骤中制备的辣根过氧化物酶的单克隆抗体，以1：1000的比例溶于：5.8g/l磷酸氢二钠、0.59g/l磷酸二氢钠、9.0g/l氯化钠、1.0％牛血清白蛋白、1.0％酪蛋白、1.0g/l酶稳定剂和1ml/l proclin-300。辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体的终浓度为1mg/l。
[0140]
实施例4cmlc-1单克隆抗体化学发光试剂盒的使用方法
[0141]
1.实验前准备
[0142]
1.1自4℃冰箱中取出试剂盒，均应平衡到室温(18-25℃)。
[0143]
1.2 20倍浓缩洗涤液用纯化水或蒸馏水稀释20倍后使用。
[0144]
2.试验方法
[0145]
2.1加样温育：
[0146]
取足够数量的包被板条，固定于框架上，分别设置校准品孔、质控品孔和待测样本孔，记录各孔位置。在待测样本孔中加入90μl样本稀释，按顺序在样本孔中分别加入10μl的待测样本，等同于样本进行了10倍稀释。在校准品孔中加入校准品100μl，在20min内完成此步操作。震荡混匀，加盖封板膜，室温温育60min。
[0147]
2.2洗板：
[0148]
手工洗板：每孔加入350μl洗涤液，静置5-10s后弃尽，重复冲洗5次后，拍干；洗板机洗板：每孔加入350μl洗涤液，每次洗涤间隔5-10s，重复冲洗5次后，拍干。
[0149]
2.3加辣根过氧化物酶标记抗cmlc-1抗体100μl，震荡混匀，加盖封板膜，室温温育30min。
[0150]
2.4洗板：
[0151]
手工洗板：每孔加入350μl洗涤液，静置5-10s后弃尽，重复冲洗5次后，拍干；
[0152]
洗板机洗板：每孔加入350μl洗涤液，每次洗涤间隔5-10s，重复冲洗5次后，拍干。
[0153]
2.7发光：每孔加入50μl化学发光液a和50μl化学发光液b，充分混匀后读数。
[0154]
2.8测定：立即置化学发光仪下测定rlu值。
[0155]
2.9计算：根据校准品的浓度及对应的光子数。使用双对数线性拟合方式(log(x)-log(y))计算结果(s0不参与计算)，结果乘以稀释倍数(10倍)，即为样本最终浓度。
[0156]
线性方程为log(rlu)＝6.36
ꢀ‑
1.16log(浓度)；r＝0.998。cmlc-1化学发光试剂盒标准曲线检测rlu值如表3所示。
[0157]
表3：cmlc-1化学发光试剂盒标准曲线检测rlu值
[0158]
浓度rlu值10118917970.552364981231571953859531015438120617524036325
[0159]
实施例5cmlc-1单克隆抗体化学发光试剂盒的方法学指标
[0160]
cmlc-1单克隆抗体化学发光试剂盒准确度、系统线性、重复性、批间差、特异性、稳定性、干扰物质分析，具体指标如下：
[0161]
1.准确度：回收率应在85％至115％之间，结果见表4；
[0162]
2.测量系统的线性：在0.5ng/ml至40ng/ml范围内线性相关系数r≥0.9900，结果见表4；
[0163]
3.重复性：批内变异系数cv批内应不超过10％，结果见表4；
[0164]
4.批间差：批间变异系数cv批间应不超过15％，结果见表4；
[0165]
表4：准确性、系统线性、重复性、批间差检测结果
[0166][0167][0168]
5.特异性分析：
[0169]
分别检测人cmlc-1阴性样本n1、阳性样本p1。在n1、p1样本中分别添加三个浓度梯度的交叉反应原，检测交叉反应原对cmlc-1检测的交叉反应情况：
[0170]
球状肌动蛋白浓度(25ng/ml、12.5ng/ml、0ng/ml)；
[0171]
肌球蛋白重链(浓度40ng/ml、20ng/ml、0ng/ml)；
[0172]
心肌肌钙蛋白ⅰ浓度(80ng/ml、40ng/ml、0ng/ml)；
[0173]
心肌肌钙蛋白t浓度(10ng/ml、5ng/ml、0ng/ml)。
[0174]
从表5可见，当人球状肌动蛋白不大于25ng/ml、人肌球蛋白重链不大于40ng/ml、人心肌肌钙蛋白ⅰ不大于80ng/ml时，人心肌肌钙蛋白t不大于10ng/ml时，对人cmlc-1的检测结果没有明显影响，展示出本公开试剂盒优良的抗交叉反应性。
[0175]
表5：特异性分析结果
[0176][0177][0178]
7.稳定性
[0179]
7.1常温37℃条件下试剂盒稳定性检测
[0180]
将试剂盒各组份在37℃条件下存放3天、6天、9天、12天后，对试剂盒各组分进行检测，检测参数结果如表6所示。
[0181]
表6：37℃存放稳定性实验结果
[0182][0183]
7.2低温冷藏4℃条件下试剂盒稳定性检测
[0184]
将试剂盒各组份在4℃条件下存放六个月、九个月、十二个月后，对试剂盒各组分进行检测，检测参数结果如表7所示。
[0185]
表7：4℃存放稳定性实验结果
[0186][0187]
根据试剂盒在常温37℃和低温冷藏4℃条件下的稳定性检测结果，试剂盒保存稳定性良好，保质期在37℃条件下不低于12天，在4℃条件下不低于12个月。
[0188]
8.干扰物质分析
[0189]
8.1不同浓度血红蛋白对试剂盒干扰程度分析
[0190]
分别检测人cmlc-1阴性样本n1、阳性样本p1。
[0191]
在n1、p1样本中分别添加不同浓度血红蛋白，检测分析试剂盒对cmlc-1检测受血红蛋白干扰的具体情况，结果如表8所示，根据结果，当血红蛋白≤100mg/dl内，对人cmlc-1抗原检测结果无明显影响。
[0192]
表8：不同浓度血红蛋白对试剂盒干扰程度检测分析结果
[0193]
[0194][0195]
8.2不同浓度胆红素对试剂盒干扰程度分析
[0196]
分别检测人cmlc-1阴性样本n1、阳性样本p1。
[0197]
在n1、p1样本中分别添加不同浓度胆红素，检测分析试剂盒对cmlc-1检测受胆红素干扰的具体情况，结果如表9所示，当白蛋白浓度在≤10mg/dl内，对人cmlc-1抗原检测结果没有显著性影响。
[0198]
表9：不同浓度胆红素对试剂盒干扰程度检测分析结果
[0199]
[0200]
8.3不同浓度甘油三酯对试剂盒干扰程度分析
[0201]
分别检测人cmlc-1阴性样本n1、阳性样本p1。
[0202]
在n1、p1样本中分别添加不同浓度甘油三酯，检测分析试剂盒对cmlc-1检测受甘油三酯干扰的具体情况，结果如表10所示，当尿酸浓度≤200mg/dl时，对人cmlc-1抗原检测结果无明显影响。
[0203]
表10：不同浓度甘油三酯对试剂盒干扰程度检测分析结果
[0204][0205]
实施例6cmlc-1单克隆抗体化学发光试剂盒与心肌梗塞诊断金标准对比结果
[0206]
心肌梗塞诊断“金标准”(ctni、临床症状及心电图典型特征性变化)确诊为心肌梗塞的患者的样本；阴性样本为试验机构确诊为非心肌梗塞患者的样本(包括在医院体检且结果正常的健康人的样本以及确诊为非心肌梗塞患者的其他疾病的患者的样本)。前期在北京市垂杨柳医院收集了共300例样本，其中50例为经金标准确诊的心肌梗塞样本，其余250例确诊为非心肌梗塞样本。
[0207]
在金标准检出的50例阳性样本中，本公开试剂盒能够检出46例阳性样本；在非心肌梗塞患者的样本的250例，本公开试剂盒能够检出243例检测为阴性。
[0208]
以金标准检测结果为标准：
[0209]
本公开试剂盒阳性符合率：46/(46+4)
×
100％＝92.0％
[0210]
本公开试剂盒阴性符合率：243/(243+7)
×
100％＝97.2％
[0211]
总符合率为：(46+243)/(46+243+4+7)
×
100％＝96.3％
[0212]
kappa系数＝0.871》0.85。
[0213]
如上述，本公开试剂盒检测结果与金标准对比具有较好的阳阴性符合率。本实验中使用的相关序列如表11所示：
[0214]
表11：本实验相关序列
[0215]
[0216][0217]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种分离的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段与cmlc-1特异性地结合；优选地，所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段包括轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3、重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3；优选地，所述重链cdr1含有seq id no:1所示的氨基酸序列或与seq idno:1具有至少70％同一性的氨基酸序列；优选地，所述重链cdr2含有seq id no:2所示的氨基酸序列或与seq idno:2具有至少70％同一性的氨基酸序列；优选地，所述重链cdr3含有seq id no:3所示的氨基酸序列或与seq idno:3具有至少70％同一性的氨基酸序列；优选地，所述轻链cdr1含有seq id no:4所示的氨基酸序列或与seq idno:4具有至少70％同一性的氨基酸序列；优选地，所述轻链cdr2含有seq id no:5所示的氨基酸序列或与seq idno:5具有至少70％同一性的氨基酸序列；优选地，所述轻链cdr3含有seq id no:6所示的氨基酸序列或与seq idno:6具有至少70％同一性的氨基酸序列；优选地，所述单克隆抗体8a3的重链可变区具有seq id no:7所示的氨基酸序列；优选地，所述单克隆抗体8a3的轻链可变区具有seq id no:8所示的氨基酸序列。2.一种分离的多核苷酸分子或包含其的重组载体，其特征在于，所述多核苷酸分子包括权利要求1所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3的核苷酸序列、权利要求1所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3的核苷酸序列、权利要求1所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的重链可变区的核苷酸序列、权利要求1所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的轻链可变区的核苷酸序列；优选地，所述重链cdr1的核苷酸序列如seq id no:9所示；优选地，所述重链cdr2的核苷酸序列如seq id no:10所示；优选地，所述重链cdr3的核苷酸序列如seq id no:11所示；优选地，所述轻链cdr1的核苷酸序列如seq id no:12所示；优选地，所述轻链cdr2的核苷酸序列如seq id no:13所示；优选地，所述轻链cdr3的核苷酸序列如seq id no:14所示；优选地，所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的重链可变区的核苷酸序列如seq id no:15所示；优选地，所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:16所示；优选地，所述载体包括但不限于线性多核苷酸、质粒和病毒载体；优选地，所述病毒载体包括但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。3.一种经过改造宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，其特征在于，所述改造宿主细胞包含权利要求2所述的多核苷酸分子或包含其的重组载体、权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段；
优选地，所述宿主细胞群体还包含所述改造宿主细胞之外的宿主细胞；优选地，所述改造宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌；优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。4.一种单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物，其特征在于，所述抗体衍生物包括权利要求1所述的抗cmlc-1的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段直接或间接偶联至可检测标记物形成的复合物；优选地，所述可检测标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素、酶标记物；优选地，所述荧光色素包括荧光素、罗丹明、texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；优选地，所述亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素；优选地，所述放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴；优选地，所述酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。5.一种单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的偶联物，其特征在于，所述偶联物包括权利要求1所述的抗cmlc-1的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段与治疗剂偶联形成的偶联物；优选地，所述治疗剂包括细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂。6.一种检测cmlc-1的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段或权利要求4所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物；优选地，所述产品包括试剂盒、芯片或高通量测序平台；优选地，所述试剂盒包括带有cmlc-1的微孔板；优选地，所述试剂盒包括化学发光液；优选地，所述化学发光液包括酶促反应发光剂、直接化学发光剂、电化学发光剂；优选地，酶促反应发光剂包括酶促反应酶和酶促反应酶的发光底物；优选地，酶促反应酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶；优选地，酶促反应酶的发光底物包括辣根过氧化物酶的发光底物、碱性磷酸酶的发光底物、葡萄糖氧化酶的发光底物、β-半乳糖苷酶的发光底物、溶菌酶的发光底物、苹果酸脱氢酶的发光底物；优选地，所述辣根过氧化物酶的发光底物包括鲁米诺或其衍生物、对-羟基苯乙酸；优选地，所述碱性磷酸酶的发光底物包括amppd、4-甲基伞形酮磷酸盐；优选地，所述直接化学发光剂包括不需要酶的催化作用，只需要改变溶液的ph条件就能发光的试剂；优选地，所述电化学发光剂包括在电极表面进行电化学反应而发出光的物质；
优选地，所述可检测标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素、酶标记物；优选地，所述荧光色素包括荧光素、罗丹明、texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；优选地，所述亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素；优选地，所述放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴；优选地，所述酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。7.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：(1)一种生产权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：培养权利要求3所述的改造宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，从培养物中分离出权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段；(2)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中cmlc-1或其片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段接触或将待测样品与权利要求4所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物接触，检测所述单克隆抗体8a3或其抗原结合片段或单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物与cmlc-1或片段的复合物的形成；(3)一种制备权利要求3所述的改造宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求2所述的多核苷酸分子或包含其的重组载体导入到宿主细胞中；优选地，所述导入的方式包括磷酸钙转染、deae、右旋糖介导的转染、电穿孔、噬菌体感染；(4)一种特异性地抑制cmlc-1的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段、权利要求2所述的多核苷酸分子或包含其的重组载体导入到生物体细胞中，通过表达权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段抑制cmlc-1的活性；优选地，所述生物体细胞是体外培养的细胞。8.一种治疗心血管疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段，或权利要求5所述的偶联物；优选地，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂；优选地，所述赋形剂包括黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、软膏剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂；优选地，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、缺血性心脏疾病、冠状动脉心脏疾病、高血压、心功能不全、心律不齐、心肌病、心内膜炎、末梢动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、动脉炎、心肌炎、心血管炎、不稳定型心绞痛、不稳定型难治愈性心绞痛、稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞；优选地，所述心肌梗塞包括一次或复发型心肌梗塞、无q波型心肌梗塞、非st段抬高型心肌梗塞、st段抬高型心肌梗塞。9.权利要求1所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段、权利要求2所述的多核苷酸分
子或包含其的重组载体或权利要求3所述的改造宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的应用，所述应用包括以下任一项：(1)在制备检测cmlc-1或其片段的产品中的应用；(2)在制备治疗心血管疾病的药物组合物中的应用；优选地，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、缺血性心脏疾病、冠状动脉心脏疾病、高血压、心功能不全、心律不齐、心肌病、心内膜炎、末梢动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、动脉炎、心肌炎、心血管炎、不稳定型心绞痛、不稳定型难治愈性心绞痛、稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞；优选地，所述心肌梗塞包括一次或复发型心肌梗塞、无q波型心肌梗塞、非st段抬高型心肌梗塞、st段抬高型心肌梗塞；(3)在制备调节cmlc-1活性或水平的药物中的应用。10.权利要求4所述的单克隆抗体8a3或其抗原结合片段的抗体衍生物在制备用于检测待测样品中的cmlc-1或其片段，或诊断受试者是否患有心血管疾病的产品中的应用；优选地，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、缺血性心脏疾病、冠状动脉心脏疾病、高血压、心功能不全、心律不齐、心肌病、心内膜炎、末梢动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、动脉炎、心肌炎、心血管炎、不稳定型心绞痛、不稳定型难治愈性心绞痛、稳定型心绞痛、慢性稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞；优选地，所述心肌梗塞包括一次或复发型心肌梗塞、无q波型心肌梗塞、非st段抬高型心肌梗塞、st段抬高型心肌梗塞。

技术总结
本发明公开了抗CMLC-1的单克隆抗体8A3及其应用，本发明的单克隆抗体8A3或其抗原结合片段能特异性与CMLC-1蛋白结合，所述单克隆抗体8A3或其抗原结合片段包含抗体重链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2、CDR3和抗体轻链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，抗体重链可变区的抗原互补决定区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；抗体轻链可变区的抗原互补决定区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，CDR2的氨基酸序列为SEQ IDNO:5、CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。本发明还公开了该单克隆抗体8A3的制备过程及该抗体重链可变区与轻链可变区氨基酸序列。链可变区与轻链可变区氨基酸序列。链可变区与轻链可变区氨基酸序列。


技术研发人员：于晖 谷明星 李鑫 陈勤慧
受保护的技术使用者：北京普恩光德生物科技开发有限公司
技术研发日：2023.02.13
技术公布日：2023/7/13