一种高纯vWF或vWF/F的制作方法

一种高纯vwf或vwf/f
ⅷ
复合物制品的冻干工艺及其制品
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域。具体地，本发明涉及一种高纯vwf或vwf/f
ⅷ
复合物制品的冻干方法。


背景技术：

2.血管性血友病因子(vwf，von willebrand factor)，是一种多聚体糖蛋白，单体分子量约为250千道尔顿(kd)，多聚体分子量为500～20000kd，是目前血浆中已知的分子量最大的蛋白。vwf单体分子在体内合成后，经多聚化形成一系列大小不等的多聚体，最大可包含1000个单体分子，其多聚化程度对于维持正常的生物学活性具有重要意义。vwf主要有2个功能，首先，它与人凝血因子
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(f
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)非共价结合，防止其被蛋白c和凝血因子xa激活，使f
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稳定而不易被降解，同时也是f
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的运输载体；其次，血浆vwf在原发性止血中起着重要作用，负责血小板与受损伤血管表面的黏附，并因此形成血小板栓子，有助于纤维蛋白凝固的形成。
3.vwf制剂分为两种，一种是vwf/f
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复合物，另一种是高纯的vwf制剂。欧美发达国家vwd的日常治疗中，约占75％的i型患者首选ddavp(1-脱氨基-8-d-精氨酸血管加压素)进行治疗，治疗无效的使用vwf制剂；约占25％的ⅱ型和ⅲ型患者主要使用vwf制剂。i型和ⅱ型的vwd患者(占95％)按需治疗，即只有在患者发病出血的时候才需要注射药物，通常临床使用的药物是vwf/f
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复合物。ⅲ型的vwd患者(占5％)需要进行预防治疗，即定期注射，通常临床使用的药物是高纯的vwf制剂。
4.vwf蛋白一旦离开人体的天然环境，易激活，极不稳定，容易发生水解、活性降低、变性激活、外观改变等现象。因此药品生产企业将vwf制成冻干制剂，一方面可以保证质量不发生改变，另一方面，使得成品运输、贮存、用药方便，安全性高。在临床使用前，按照规格加入一定量的灭菌注射用水，复溶后用于患者静脉给药，使用方便且质量稳定，安全性也大大的提高。
5.临床上，vwf冻干制剂的复溶时间的长短影响临床给药的便利性和患者的依从性。《欧洲药典》规定vwf制剂应在10分钟内溶解完全，中国专利cn111592591a公开的人血管性血友病因子/人凝血因子viii复合物的冻干制品可在6分钟内溶解完全。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了一种改进的高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
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复合物制品的冻干工艺，根据本发明公开的工艺获得的高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
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复合物制品的复溶时间，临床用药便利性得到改善。
7.本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
8.发明人意外发现，冻干工艺预冻阶段的工艺参数对于缩短高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
ⅷ
复合物冻干制品的复溶时间是重要的。进一步试
验发现，与现有技术相比，本发明将待冻干样品预冻至-45℃～-50℃前，增加一步-25℃～-35℃的工艺步骤，显著缩短冻干制品的复溶时间。
9.本发明的第一个方面，本发明提出了一种高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
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复合物制品的冻干工艺，所述冻干工艺的预冻阶段在步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃前，还包括步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃。
10.需要说明的是，本发明所述的板层温度是冻干机的板层或隔板温度。本发明所述的空气温度是冻干机待冻干样品室的温度。本发明所述的样品温度指待冻干样品的温度。通常情况下，在蛋白样品的冻干过程中，上述板层温度、空气温度和样品温度可能存在不一致的情况，但达到一致所需要的时间不会太长。
11.进一步地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-27℃～-35℃。
12.进一步地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-29～32℃。
13.进一步地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-30℃。
14.根据本发明的实施例，可以根据不同的样品特性以及冻干设备性能，选择合适的样品冷冻速度。
15.进一步地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度在60分钟内降低至-30℃。
16.进一步地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度在45分钟内降低至-30℃。
17.进一步地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度在30分钟内降低至-30℃。
18.发明人进一步试验发现，待冻干样品预冻至-45℃～-50℃前增加的-25℃～-35℃的步骤，其保温时间对于缩短最终冻干制品的复溶时间也是必要的。根据本发明的实施例，可以根据不同的样品特性以及冻干设备性能，选择合适的保温时间。
19.进一步地，根据本发明实施例，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于10分钟。
20.进一步地，根据本发明实施例，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于15分钟。
21.进一步地，根据本发明实施例，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于20分钟。
22.进一步地，根据本发明实施例，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于25分钟。
23.进一步地，根据本发明实施例，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于30分钟。
24.进一步地，根据本发明实施例，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于60分钟。
25.进一步地，根据本发明实施例，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于120分钟。
26.相应地，发明人长期研究冻干工艺发现，高纯人血管性血友病因子或人血管性血
友病因子/人凝血因子
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复合物样品冻干入柜后的第一次降温对于最终制品的复溶时间也有影响。
27.较优地，所述预冻阶段还包括步骤(c)板层温度或空气温度或样品温度降至-5℃～-9℃，保温时间不低于60分钟。
28.进一步地，根据本发明实施例，所述步骤(c)板层温度或空气温度或样品温度降低至-6℃～-8℃。
29.进一步地，根据本发明实施例，所述板层温度或空气温度或样品温度降低至-6℃。
30.在一种具体实施方式中，所述保温时间不低于90分钟。
31.在一种具体实施方式中，所述保温时间不低于120分钟。
32.发明人进一步试验验证，上述步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃后，不同的保温时间对最终制品的复溶时间有影响。
33.进一步地，根据本发明实施例，步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃，保温时间不低于240分钟。
34.进一步地，根据本发明实施例，步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃，保温时间不低于300分钟。
35.进一步地，根据本发明实施例，步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃，保温时间不低于360分钟。
36.进一步地，根据本发明实施例，步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃，保温时间不低于420分钟。
37.进一步地，根据本发明实施例，步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃，保温时间不低于480分钟。
38.在本发明的一种更具体的实施方式中，上述冻干工艺还包括以下步骤：
39.(1)所述制品的半成品灌装分装至容器，室温入柜；
40.(2)权利要求4所述的步骤(c)；
41.(3)权利要求1至5任一项所述的步骤(b)；
42.(4)权利要求1至5任一项所述的步骤(a)；
43.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
44.(6)将板层温度在450分钟内升至-30℃，保温时间不低于600分钟；
45.(7)将板层在1020分钟内升至0℃，保温时间不低于780分钟；
46.(8)将板层在180分钟内升至10℃，保温时间不低于120分钟；
47.(9)将板层在240分钟内升至30℃，保温时间不低于480分钟；
48.(10)抽极限真空，保持30℃至真空合格。
49.本发明的第二个方面，本发明提出了由上述方法制备得到的高纯人血管性血友病因子冻干制品。
50.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于1分钟。
51.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于45秒。
52.根据本发明实施例，所述高纯人血管性血友病因子冻干制品的复溶时间不高于30秒。
53.本发明的第三个方面，本发明提出了由上述方法制备得到的人血管性血友病因
子/人凝血因子viii复合物冻干制品。
54.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于3分钟。
55.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于2.5分钟。
56.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于2分钟。
57.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于1.5分钟。
58.根据本发明实施例，所述人血管性血友病因子/人凝血因子viii复合物制品的复溶时间不高于1分钟。
59.本发明的第四方面，本发明提供一种高纯人血管性血友病因子冻干制品，所述制品复溶时间不高于1分钟。
60.根据本发明实施例，所述高纯人血管性血友病因子冻干制品的复溶时间不高于30秒。
61.本发明的第五方面，本发明提供一种人血管性血友病因子/人凝血因子viii复合物冻干制品，所述制品的复溶时间不高于3分钟。
62.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于2.5分钟。
63.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于2分钟。
64.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于1.5分钟。
65.根据本发明实施例，所述制品的复溶时间不高于1分钟。
66.与现有技术相比，本发明取得的有益效果是：
67.1、通过本发明公开的冻干工艺制得的高纯vwf冻干制品的复溶时间不高于1分钟，且其他质量标准符合《欧洲药典》。在较优的冻干条件下，复溶时间最短可控制在30秒以内。
68.2、通过本发明公开的冻干工艺制得的人血管性血友病因子/人凝血因子viii复合物冻干制品的复溶时间不高于3分钟，且其他质量标准符合《欧洲药典》，优于现有技术公开的vwf冻干制剂6分钟内溶解完全、f
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制剂10分钟内溶解完全的行业平均水平，显著优于vwf冻干制剂10分钟内溶解完全(《欧洲药典》)、f
ⅷ
制剂30分钟内溶解完全(《中国药典》)的强制规定。
69.3、通过本发明公开的冻干工艺制得的高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
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复合物制品活性回收明显提高。相对于现有技术，高纯人血管性血友病因子冻干制品活性回收率提高近20％，vwf冻干制品活性回收率提高约20％以上，fviii冻干制品活性回收率提高约10％。
70.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
71.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
72.本领域对于高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子viii复合物冻干制品复溶时间的优化，主要方向集中在冻干保护剂配方方向，比如《不同配方的冻干保护剂对人血管性血友病因子制品的冻干及干热工艺的影响》文献(中南药学.2020年06期第974-977页)公开冻干保护剂配方g(10mmol/l枸橼酸钠+40mmol/l氯化钠+3％甘氨酸+
0.3％赖氨酸)制得的人血管性血友病因子制品冻干后复溶时间为6min 52s，干热后复溶时间为7min 05s。发明人意外发现，冻干工艺预冻阶段的工艺参数对于缩短高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
ⅷ
复合物冻干制品的复溶时间是重要的。进一步试验发现，与现有一步预冻至-45℃～-50℃的冻干工艺相比，待冻干样品预冻至-45℃～-50℃前，增加一步-25℃～-35℃的预冻阶段，可显著缩短冻干制品的复溶时间。根据本发明的实施例，可以根据不同的样品特性，比如高纯血管性血友病因子、人血管性血友病因子复合物或凝血因子
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复合物的样品特性，以及冻干设备本身的性能，选择合适的预冻速度。
73.进一步地，-25℃～-35℃预冻阶段的保温时间对于缩短最终冻干制品的复溶时间也是必要的。根据本发明的实施例，可以根据不同的样品特性，比如高纯血管性血友病因子、人血管性血友病因子复合物或凝血因子
ⅷ
复合物的样品特性，以及冻干设备性能，选择合适的保温时间。
74.进一步地，高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
ⅷ
复合物样品冻干，入柜后的第一次降温对于最终制品的复溶时间也有影响。
75.本发明所述的“高纯人血管性血友病因子”等同于“高纯vwf”，通常指vwf和fviii活性比大于等于5:1的vwf制剂。
76.本发明所述的“vwf复合物”等同于“vwf/f
ⅷ
复合物”，通常指vwf和fviii活性比大于等于2:1的vwf制剂。
77.本发明所述的“fviii复合物”等同于“fviii/vwf复合物”，通常指vwf和fviii活性比约等于1:1的vwf制剂。
78.本发明的一些具体的制备高纯人血管性血友病因子冻干制品的工艺，其冻干工艺实施方式包括以下步骤：
79.(1)药品室温(10-30℃)入柜；
80.(2)板层温度降至-7℃，保温时间不低于60min；
81.(3)将板层温度在45min内降至-35℃，保温时间不低于30min；
82.(4)将板层温度在45min内降至-50℃，保温时间不低于240min；
83.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
84.(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
85.(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
86.(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
87.(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
88.(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
89.本发明的一些具体的制备高纯人血管性血友病因子冻干制品的工艺，其冻干工艺实施方式包括以下步骤：
90.(1)药品室温(10-30℃)入柜；
91.(2)板层温度降至-6℃，保温时间不低于60min；
92.(3)将板层温度在45min内降至-30℃，保温时间不低于20min；
93.(4)将板层温度在45min内降至-50℃，保温时间不低于300min；
94.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
95.(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
96.(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
97.(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
98.(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
99.(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
100.本发明的一些具体的制备vwf复合物冻干制品的工艺，其冻干工艺实施方式包括以下步骤：
101.(1)药品室温(10-30℃)入柜；
102.(2)板层温度降至-6℃，保温时间不低于120min；
103.(3)将板层温度在45min内降至-25℃，保温时间不低于30min；
104.(4)将板层温度在45min内降至-45℃，保温时间不低于360min；
105.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
106.(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
107.(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
108.(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
109.(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
110.(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
111.本发明的一些具体的制备vwf复合物冻干制品的工艺，其冻干工艺实施方式包括以下步骤：
112.(1)药品室温(10-30℃)入柜；
113.(2)板层温度降至-8℃，保温时间不低于120min；
114.(3)将板层温度在45min内降至-30℃，保温时间不低于20min；
115.(4)将板层温度在45min内降至-45℃，保温时间不低于480min；
116.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
117.(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
118.(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
119.(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
120.(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
121.(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
122.本发明的一些具体的制备fviii冻干制品的工艺，其冻干工艺的实施方式包括以下步骤：
123.(1)药品室温(10-30℃)入柜；
124.(2)板层温度降至-8℃，保温时间不低于60min；
125.(3)将板层温度在45min内降至-27℃，保温时间不低于30min；
126.(4)将板层温度在45min内降至-45℃，保温时间不低于480min；
127.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
128.(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
129.(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
130.(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
131.(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
132.(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
133.发明人进一步考察高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
ⅷ
复合物冻干制品的关键质量指标，意外地发现，本发明还可以提高对应冻干制品的活性回收率。相对于对比例，本发明的高纯人血管性血友病因子冻干制品活性回收率提高近20％，vwf冻干制品活性回收率提高约20％以上，fviii冻干制品活性回收率提高约10％。
134.本发明所称“血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀”通常来源于健康人血浆的血浆冷沉淀，将其用中性ph缓冲液或注射用水溶解后，加al(oh)3凝胶或a50凝胶比如deae sephadex a-50凝胶吸附，得到粘稠浆糊状物。血浆冷沉淀凝胶吸附沉淀可进一步用于制备fviii制品或vwf制品。
135.本发明所使用的术语“s/d病毒灭活方法”指用有机溶剂/去污剂混合物(s/d)破坏包膜病毒的脂膜的方法。一旦破坏脂膜的病毒不可能再与感染细胞结合。该法能有效的灭活脂包膜病毒，但不能灭活非包膜病毒。通常s/d的工作液浓度是tnbp 0.3％、tween-80 1.0％。
136.本发明所使用的术语“cohn
′
s低温乙醇反应系统”指cohn低温乙醇法级分血浆蛋白的方法，是血液制品可工业化生产的方法。经典cohn低温乙醇法有cohn 6法、cohn 9法、cohn 10法。对应分馏得到的包含特定种类和数量血浆蛋白组分即“血浆级分组分”有fi、fii、fiii、fiv、fv和fvi等。
137.本发明所使用的术语“nk低温乙醇改良反应系统”也是一种低温乙醇级分血浆蛋白的方法，有时也称为“nk变法”、“nk法”，与cohn原法主要不同在于：1、沉淀相当于cohn fii+iii的沉淀a时降低了ph和乙醇的浓度；2、从相当于cohn s
2,3
中直接沉淀白蛋白，省略了分离fiv1的步骤；3、参考cohn10法，从沉淀a中萃取丙球蛋白，而不是将沉淀溶后再沉淀。nk变法比cohn原法减少40％的乙醇消耗，缩短了工作体积22％，工艺周期缩短了2天，回收率提高(白蛋白可达90％，丙球可达89％)，纯度与原法相当。
138.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
139.实施例1高纯vwf冻干制品制备
140.参考cn202011004346.0，以f
ⅷ
生产废料为原料，制备高纯vwf冻干制剂。
141.制备f
ⅷ
生产废料：以血浆冷沉淀为原料，用缓冲液溶解后，经2％al(oh)3吸附，调节ph至6.5-6.6，离心，取上清液进行s/d灭活，deae阴离子交换层析吸附经病毒灭活后的样品，洗涤色谱柱，所得洗涤液即为f
ⅷ
生产废料，可进一步用于纯化vwf。
142.中间品制备：在f
ⅷ
生产废料上样之前，依次用3.5倍柱体积的注射用水，5倍柱体积的平衡液平衡capto core 700层析柱；f
ⅷ
生产废料上capto core 700层析柱，然后再用4倍柱体积的平衡液冲洗，收集上样及冲洗过程中的层析流穿液得到纯化后的vwf中间品。平衡液配方：20mm柠檬酸钠、0.15m nacl、126mmα-氨基乙酸、5.0mm cacl2，ph 6.8-7.2。
143.半成品制备：制得的vwf中间品，经过超滤，加入稳定剂，再经过除菌过滤、灌装，得到高纯vwf半成品。稳定剂为10mm枸橼酸钠、2％盐酸精氨酸、0.02％聚山梨酯80，ph 6.9。
144.成品制备：高纯vwf半成品真空冷冻干燥，99-100℃、30min干热病毒灭活，即得最终制品。
145.实施例1冻干工艺(组)：
146.(1)药品室温(10-30℃)入柜；
147.(2)板层温度降至-7℃，保温时间不低于60min；
148.(3)将板层温度在45min内降至-35℃，保温时间不低于30min；
149.(4)将板层温度在45min内降至-50℃，保温时间不低于240min；
150.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
151.(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
152.(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
153.(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
154.(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
155.(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
156.实施例2高纯vwf冻干制品制备
157.半成品制备方法同实施例1。
158.实施例2冻干工艺(组)：
159.(1)药品室温(10-30℃)入柜；
160.(2)板层温度降至-6℃，保温时间不低于90min；
161.(3)将板层温度在45min内降至-32℃，保温时间不低于15min；
162.(4)将板层温度在30min内降至-50℃，保温时间不低于300min；
163.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
164.(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
165.(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
166.(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
167.(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
168.(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
169.实施例1、实施例2对比冻干工艺(组)：
170.(1)药品室温(10-30℃)入柜；
171.(2)板层温度降至-9℃，保温时间不低于120min；
172.(4)将板层温度在45min内降至-45℃，保温时间不低于480min；
173.(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
174.(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
175.(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
176.(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
177.(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
178.(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
179.实施例1、实施例2冻干工艺(组)、实施例1对比冻干工艺(组)冻干前样品按成品规格配制。实施例1、实施例2冻干工艺(组)、实施例1与实施例2的对比冻干工艺(组)每组取10瓶冻干后的高纯vwf制品进行干热病毒灭活(100℃
×
30min或80℃
×
72h)，得干热后制品，
并检测关键质量指标。其中，活性回收率按如下公式计算：配置品vwf:act效价/干热后样品vwf:act效价iu/ml*100％。
180.实施例1、实施例2制品与《欧洲药典》中收录的vwf关键质量指标对比见表1。
181.表1高纯vwf关键质量指标对比表
[0182][0183]
实施例3vwf/fviii冻干制品制备
[0184]
参照专利cn111592591a实施例1制备vwf/fviii冻干工艺用半成品，真空冷冻干燥，99-100℃、30min干热病毒灭活，即得最终制品。
[0185]
实施例3冻干工艺(组)
[0186]
(1)药品室温(10-30℃)入柜；
[0187]
(2)板层温度降至-6℃，保温时间不低于120min；
[0188]
(3)将板层温度在45min内降至-25℃，保温时间不低于30min；
[0189]
(4)将板层温度在45min内降至-45℃，保温时间不低于360min；
[0190]
(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
[0191]
(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
[0192]
(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
[0193]
(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
[0194]
(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
[0195]
(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
[0196]
实施例4 vwf/fviii冻干制品制备
[0197]
参照专利cn111592591a实施例1制备vwf/fviii冻干工艺用半成品，真空冷冻干燥，99-100℃、30min干热病毒灭活，即得最终制品。
[0198]
实施例4冻干工艺(组)
[0199]
(1)药品室温(10-30℃)入柜；
[0200]
(2)板层温度降至-8℃，保温时间不低于120min；
[0201]
(3)将板层温度在60min内降至-30℃，保温时间不低于20min；
[0202]
(4)将板层温度在45min内降至-45℃，保温时间不低于480min；
[0203]
(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
[0204]
(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
[0205]
(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
[0206]
(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
[0207]
(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
[0208]
(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
[0209]
实施例3、实施例4对比冻干工艺(组)：
[0210]
(1)药品室温(10-30℃)入柜；
[0211]
(2)板层温度降至-9℃，保温时间不低于60min；
[0212]
(4)将板层温度在2min内降至-45℃以下，保温时间不低于120min；
[0213]
(5)开始抽真空，使真空度达到20pa；
[0214]
(6)将板层温度在450min内升至-25℃，保温时间不低于540min；
[0215]
(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于600min；
[0216]
(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
[0217]
(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于360min；
[0218]
(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
[0219]
实施例3、实施例4冻干工艺(组)、实施例3与实施例4的冻干前样品按成品规格配制。实施例3、实施例4冻干工艺(组)、实施例3与实施例4的对比冻干工艺(组)每组取10瓶冻干后的vwf/fviii复合物进行干热病毒灭活(100℃
×
30min或80℃
×
72h)，得干热后制品，并检测关键质量指标。其中，活性回收率按如下公式计算：配置品vwf:act效价/干热后样品vwf:act效价iu/ml*100％。
[0220]
实施例3、实施例4制品与《欧洲药典》中收录的vwf/fviii关键质量指标对比见表2。
[0221]
表2 vwf/fviii复合物关键质量指标对比表
[0222]
[0223][0224]
实施例5 fviii/vwf复合物冻干制品制备
[0225]
冷沉淀溶解：取血浆冷沉淀用2倍体积的含有的2u/ml肝素钠注射用水溶解，0.1m醋酸调节冷沉淀溶解液ph至7.1，持续搅拌30min。
[0226]
铝凝胶吸附并深层过滤：按每kg血浆冷沉淀108g 2％(wt％)al(oh)3凝胶的量加al(oh)3凝胶至血浆冷沉淀溶解液中，充分搅拌，然后用0.1m醋酸调节ph至6.0-6.6，获得血浆冷沉淀铝凝胶吸附沉淀。然后经supradur50p滤板+微晶纤维素串联0.8μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0227]
s/d病毒灭活并深层过滤：加入tween80至1.0％(wt％)，tnbp(磷酸三丁酯)至0.3％(wt％)，搅匀后升温至24-26℃，保温6小时。然后经supradur50p滤板+微晶纤维素串联0.45μm滤膜16～26℃过滤，收集澄清滤液。
[0228]
阴离子交换层析：上述澄清滤液上fractogel tmae 650m阴离子交换层析，层析柱凝胶高度不高于柱子的直径。装填阴离子凝胶的层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡(120mm氯化钠，10mm柠檬酸钠
·
5h2o，120mm甘氨酸，1mm氯化钙
·
2h2o，ph 6.5-7.5)然后上样。上样结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，然后用洗涤缓冲液(120-200mm的氯化钠，10mm柠檬酸钠
·
5h2o，120mm甘氨酸，1mm氯化钙
·
2h2o，ph 6.9-7.0)洗涤柱子，再用洗脱缓冲液(400mm氯化钠，20mm柠檬酸钠
·
5h2o，200mm甘氨酸，1.0mm氯化钙
·
2h2o，ph值6.8至7.4)洗脱，收集纯化的fviii溶液。
[0229]
阴离子层析纯化洗脱液进一步经过滤、超滤、除菌过滤。超滤透析液含：20mm枸橼酸钠，10g/l白蛋白，35g/l盐酸精氨酸；ph 7.2。
[0230]
除菌过滤后按成品规格配制，并加入稳定剂200mm的甘氨酸，分装，真空冷冻干燥，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃
×
30min或80℃
×
72h)后即得fviii成品。
[0231]
实施例5冻干工艺(组)：
[0232]
(1)药品室温(10-30℃)入柜；
[0233]
(2)板层温度降至-8℃，保温时间不低于60min；
[0234]
(3)将板层温度在45min内降至-27℃，保温时间不低于120min；
[0235]
(4)将板层温度在45min内降至-45℃，保温时间不低于480min；
[0236]
(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；
[0237]
(6)将板层温度在450min内升至-30℃，保温时间不低于600min；
[0238]
(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于780min；
[0239]
(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
[0240]
(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于480min；
[0241]
(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
[0242]
实施例5对比冻干工艺(组)：
[0243]
(1)药品室温(10-30℃)入柜；
[0244]
(2)板层温度降至-9℃，保温时间不低于60min；
[0245]
(4)将板层温度在2min内降至-45℃以下，保温时间不低于120min；
[0246]
(5)开始抽真空，使真空度达到20pa；
[0247]
(6)将板层温度在450min内升至-25℃，保温时间不低于540min；
[0248]
(7)将板层在1020min内升至0℃，保温时间不低于600min；
[0249]
(8)将板层在180min内升至10℃，保温时间不低于120min；
[0250]
(9)将板层在240min内升至30℃，保温时间不低于360min；
[0251]
(10)抽极限真空，压塞、出柜、轧盖。
[0252]
实施例5fviii制品与《中国药典》中收录的fviii制品关键质量指标对比见表3。其中，活性回收率按如下公式计算：成品规格配置品fviii:c效价/干热后样品fviii:c效价iu/ml*100％。
[0253]
表3 fviii制品主要质量比表对比
[0254][0255][0256]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技
术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0257]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子
ⅷ
复合物制品的冻干工艺，其特征在于，所述冻干工艺的预冻阶段在步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃前，还包括步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃。2.根据权利要求1所述的冻干工艺，其特征在于，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-27℃～-35℃；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-29～-32℃；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-30℃；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度在60分钟内降低至-30℃；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度在45分钟内降低至-30℃；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度在30分钟内降低至-30℃。3.根据权利要求1所述的冻干工艺，其特征在于，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于10分钟；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于15分钟；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于20分钟；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于25分钟；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于30分钟；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于60分钟；优选地，所述步骤(b)板层温度或空气温度或样品温度降低至-25℃～-35℃后保温时间不低于120分钟。4.根据权利要求1所述的冻干工艺，其特征在于，所述预冻阶段还包括步骤(c)板层温度或空气温度或样品温度降至-5℃～-9℃，保温时间不低于60分钟；优选地，所述步骤(c)板层温度或空气温度或样品温度降低至-6℃～-8℃；优选地，所述步骤(c)板层温度或空气温度或样品温度降低至-6℃；优选地，所述保温时间不低于90分钟；优选地，所述保温时间不低于120分钟。5.根据权利要求1所述的冻干工艺，其特征在于，所述步骤(a)板层温度或空气温度或样品温度降低至-45℃～-50℃，保温时间不低于240分钟；优选地，所述保温时间不低于300分钟；优选地，所述保温时间不低于360分钟；优选地，所述保温时间不低于420分钟；优选地，所述保温时间不低于480分钟。6.根据权利要求1至5任一项所述的冻干工艺，其特征在于，所述冻干工艺还包括以下步骤：
(1)所述制品的半成品灌装分装至容器，室温入柜；(2)权利要求4所述的步骤(c)；(3)权利要求1至5任一项所述的步骤(b)；(4)权利要求1至5任一项所述的步骤(a)；(5)开始抽真空度至10pa，保持真空度低于50pa；(6)将板层温度在450分钟内升至-30℃，保温时间不低于600分钟；(7)将板层在1020分钟内升至0℃，保温时间不低于780分钟；(8)将板层在180分钟内升至10℃，保温时间不低于120分钟；(9)将板层在240分钟内升至30℃，保温时间不低于480分钟；(10)抽极限真空，保持30℃至真空合格。7.根据权利要求1至6任一项所述冻干工艺制备得到的高纯人血管性血友病因子冻干制品；优选地，所述制品的复溶时间不高于1分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于45秒；优选地，所述制品的复溶时间不高于30秒。8.根据权利要求1至6任一项所述冻干工艺制备得到的人血管性血友病因子/人凝血因子viii复合物冻干制品；优选地，所述制品的复溶时间不高于3分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于2分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于1.5分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于1分钟。9.一种高纯人血管性血友病因子冻干制品，其特征在于，所述制品复溶时间不高于1分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于45秒；优选地，所述制品的复溶时间不高于30秒。10.一种人血管性血友病因子/人凝血因子viii复合物冻干制品，其特征在于，所述制品的复溶时间不高于3分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于2.5分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于2分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于1.5分钟；优选地，所述制品的复溶时间不高于1分钟。

技术总结
本发明提出了一种高纯人血管性血友病因子或人血管性血友病因子/人凝血因子


技术研发人员：陈娇 王超 尚超 郑理 周建均 何炫 高玲 王强 蒋德席
受保护的技术使用者：四川远大蜀阳药业有限责任公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2023/7/13