一种实现高效碱基颠换的迷你基因编辑系统及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种实现高效碱基颠换的迷你基因编辑系统及其应用。


背景技术：

2.人类遗传病发生的本质是由于基因突变，60％左右的遗传疾病由单个碱基突变引起，传统的利用基因组编辑技术介导的同源重组进行纠正这类遗传病非常低效(0.1％-5％)
[1,2]
。基于crispr系统衍生出来的单碱基编辑器是近年来新兴的高效碱基编辑技术，因不产生dna双链断裂、无须重组模板、高效编辑等优势使其在基础研究和临床疾病治疗中展示了巨大的应用前景。
[0003]
经典的碱基编辑器主要分为胞嘧啶碱基编辑器cbe和腺嘌呤碱基编辑器abe，前者由活性受损的来源于酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)spcas9n、大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶rapobec1和尿嘧啶糖苷酶抑制剂组成，其中cas9蛋白以ngg作为pam识别并特异结合dna，紧接着在脱氨酶以及dna修复的作用下，最终在ngg(21-23位)上游靶向序列20bp范围实现c
·
g-t
·
a的替换，编辑窗口主要位于4-8位
[2]
；后者则是将细菌来源的tada与spcas9融合，在定向进化和蛋白质工程化改造技术的辅助下，经历7轮进化最终获得可作用于单链dna的腺嘌呤碱基编辑器abe7.10，活性编辑区域主要位于4-7位，该系统在人类细胞中引起a
·
t-g
·
c的平均编辑效率约为53％，远高于利用同源重组介导碱基突变的效率，其产物纯度高达99.9％以及极低的indels(插入和缺失)发生
[3]
。在cbe开发过程中，科学家发现尿嘧啶糖苷酶ung影响c到g产物发生
[4]
，因此，科学家在cbe的基础上再融合尿嘧啶糖苷酶ung
[5,6]
/ung变体/碱基切除修复蛋白xrcc1等修复因子
[7]
，开发出cgbe系列，在dna特定区域引起c-g到g-c的碱基颠换。然而，现有的cgbe系列由于多个融合蛋白的掺入，形成较大体积且复杂的构建体系为后期基因治疗带来阻碍，并且融合修复因子的cgbe其碱基编辑范围可覆盖3-9位，也无法兼容精准靶向和高效编辑
[7,8]
。此外，cgbe衍生于cbe，cbe相对于abe在基因组上产生较高的脱靶编辑，因此其安全性问题值得关注。与此同时，多个课题组报道abe除高效介导a到g的编辑外，也会引起低频的胞嘧啶编辑
[5,9-11]
。


技术实现要素：

[0004]
本发明解决的技术问题：
[0005]
为克服上述现有技术中的碱基编辑器存在的缺点和不足，本发明以腺嘌呤脱氨酶tada-8e(仅167个氨基酸)作为切入点，通过对tada-8e晶体结构分析和理性设计，鉴定出诱导abe转换为cgbe的“分子开关”(图1)，即完全废除abe本身的腺嘌呤编辑能力，极大增加对底物胞嘧啶的编辑特性，经多轮筛选改造开发出abe驱动的ads-be1(目前体积最小的cgbe)，可在5-7位引起精准的c-g到g-c碱基颠换编辑，相对于传统胞嘧啶脱氨酶衍生而来的cgbe系列，ads-be1展示出较高的编辑活性和较低的脱靶事件，因此具备极高的安全性。
[0006]
本发明的技术方案如下：
[0007]
本发明提供的技术方案之一为：一种腺嘌呤脱氨酶，所述腺嘌呤脱氨酶相比于如seq id no:2所示的氨基酸序列具有氨基酸差异，所述氨基酸差异位于第28位、第30位和第46位中的一位或多位；优选位于第46位。
[0008]
在一些优选的实施方案中，所述的腺嘌呤脱氨酶为第28位氨基酸残基v替换为a或g；第30位氨基酸残基v替换为f；第46位氨基酸残基n替换为a、g、l或p，优选l或p；
[0009]
较佳地，所述腺嘌呤脱氨酶包括核定位信号序列，所述核定位信号的氨基酸序列优选如seq id no:1所示；
[0010]
更佳地，所述腺嘌呤脱氨酶包括连接子序列，所述连接子的氨基酸序列优选如seq id no:3所示。
[0011]
本发明提供的技术方案之二为：一种实现高效碱基颠换的基因编辑器，所述实现高效碱基颠换的基因编辑器在单碱基编辑工具的基础上引入技术方案之一所述的腺嘌呤脱氨酶；和/或，引入其他突变或其他改造，例如改变连接子的长度、融合新的功能蛋白等。
[0012]
作为一种优选的方案，所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器，其包括：启动子元件、核酸酶、多聚腺苷酸a和如技术方案之一所述的腺嘌呤脱氨酶；其中：
[0013]
所述启动子元件优选光谱启动子、组织特异型启动子或肝脏特异性启动子，更优选cmv启动子；
[0014]
所述核酸酶优选cas蛋白及其变体，所述cas蛋白优选酿酒酵母来源的spcas9、金黄色葡萄球菌来源的sacas9、毛螺菌科细菌来源的lbcas12a或酸胺球菌属细菌来源的enascas12a；所述cas蛋白变体优选vqr-spcas9、vrer-spcas9、spry、spng、sacas9-kkh或sacas9-ng；较佳地，所述核酸酶的氨基酸序列如seq id no:4所示；
[0015]
所述多聚腺苷酸a优选牛生长激素多腺苷酸化信号或其他物种多腺苷酸化信号，更优选牛生长激素多腺苷酸化信号bghpolya。
[0016]
本发明提供的技术方案之三为：一种实现高效碱基颠换的基因编辑系统，其包括：sgrna和如技术方案之二所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器；
[0017]
较佳地，所述sgrna的靶序列如seq id no:5-21的核苷酸序列所示。
[0018]
本发明提供的技术方案之四为：一种药物组合物，所述药物组合物包括如技术方案之一所述的腺嘌呤脱氨酶、如技术方案之二所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、或如技术方案之三所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统。
[0019]
本发明提供的技术方案之五为：一种非治疗目的的基因编辑方法，所述基因编辑方法包括：在靶细胞中表达如技术方案之一所述的腺嘌呤脱氨酶、如技术方案之二所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、如技术方案之三所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统，使所述靶细胞发生碱基颠换的基因编辑；
[0020]
较佳地，所述靶细胞的来源为分离的细胞系；
[0021]
更佳地，所述分离的细胞系为293t细胞、hela细胞、u2os细胞、nih3t3细胞或n2a细胞。
[0022]
本发明提供的技术方案之六为：如技术方案之一所述的腺嘌呤脱氨酶、如技术方案之二所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、如技术方案之三所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统在制备基因编辑的药物或制备基因治疗的药物中的应用。
[0023]
本发明提供的技术方案之七为：如技术方案之一所述的腺嘌呤脱氨酶、如技术方
案之二所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、如技术方案之三所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统在构建动物模型和农作物育种中的应用。
[0024]
本发明提供的技术方案之八为：如技术方案之一所述的腺嘌呤脱氨酶、如技术方案之二所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、如技术方案之三所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统在制备碱基编辑工具中的应用。
[0025]
本发明所用tad8e单点突变和组合突变，但不限于本技术提到的30种单点突变，也包括来源其他物种，以及其他原核生物来源的。本发明所用的单碱基编辑工具为abe8e，也包括其他类似能实现a到g突变单碱基工具及突变体。本发明所使用的细胞为真核细胞基因编辑，也包括非真核细胞，如原核、古生物等。本发明中所用的ads-be1系列，组成为cmv-tad8e突变-cas9n-bghpolya，也包括能行使相对于abe8e有更精准高效的c到g的活性的排列组合，也包括tad蛋白嵌入cas9中间等其他位置变换。
[0026]
本发明的关键创新点：
[0027]
本发明以腺嘌呤脱氨酶tada-8e(仅167个氨基酸)作为切入点，通过对tada-8e晶体结构分析和理性设计，鉴定出诱导abe转换为cgbe的“分子开关”，即完全废除abe本身的腺嘌呤编辑能力，极大增加对底物胞嘧啶的编辑特性，(adenine base editors，腺嘌呤碱基编辑器，背景：abe由腺苷脱氨酶tada和cas9蛋白融合，tada-8e是tada最新进化版本)，多轮筛选改造开发出abe驱动的ads-be1(目前体积最小的cgbe)，可在5-7位引起精准的c-g到g-c碱基颠换编辑。传统cgbe由cbe改造而来，而cbe自身存在较高的脱靶事件。本发明的ads-be1改造于abe，abe体积小于cbe，且ads-be1没有融合其他因子，其体积更小。此外，abe相对于cbe自身的脱靶事件更低，因此，ads-be1展示出较高的编辑活性和较低的脱靶事件，具备极高的安全性。总的来说，本发明的ads-be1碱基编辑器为单碱基基因编辑技术领域较大的一个技术改进，将极大促进其在基因编辑、精准医疗、疾病模型制作、作物遗传育种等方面的应用。
[0028]
本发明的积极进步效果在于：
[0029]
1.本发明通过对tada-8e晶体结构分析和理性设计，鉴定出诱导abe转换为cgbe的“分子开关”，即完全废除abe本身的腺嘌呤编辑能力，极大增加对底物胞嘧啶的编辑特性；
[0030]
2.本发明开发出abe驱动的ads-be1，为目前体积最小的cgbe；
[0031]
3.本发明的ads-be1碱基编辑器相对于传统胞嘧啶脱氨酶衍生而来的cgbe系列，展示出较高的编辑活性和较低的脱靶事件，因此具备极高的安全性；
[0032]
4.本发明的ads-be1碱基编辑器可在5-7位引起精准的c-g到g-c碱基颠换编辑；
[0033]
5.本发明的ads-be1碱基编辑器为单碱基基因编辑技术领域较大的一个技术改进，将极大促进其在基因编辑、精准医疗、疾病模型制作、作物遗传育种等方面的应用。
附图说明
[0034]
图1：根据tad-8e晶体结构设计构建体(pdb:6vpc)。
[0035]
图2：30个abe8e突变体构建在293t上fancf site 1位点实现的a3、a4和c6碱基编辑对比。
[0036]
图3：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1在293t上12个内源位点展现的c》g碱基编辑对比。
[0037]
图4：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1不同位置平均c》g碱基编辑对比(统计12个内源位点)。
[0038]
图5：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1、abe8e产生的indels对比(统计12个内源位点)。
[0039]
图6a、图6b和图6c：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1、abe8e在abe site 23位点产生的非依赖性脱靶对比。
[0040]
图7：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1、abe8e在目标位点abe site 23位点产生的c到g效率对比。
[0041]
图8：nsacas9-r-loop图谱。
具体实施方式
[0042]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0043]
实施例1：abe8e单点突变abe8e-n46l和abe8e-n46p可消除编辑a到g的编辑和产生高效c到g编辑
[0044]
1.1质粒设计及构建
[0045]
1.1.1根据abe8e与底物dna结合的晶体结构，设计了30个abe8e的单点突变，同时设计了1个来自于人的内源性靶点fancf site1(表2)；
[0046]
1.1.2 30个abe8e单点突变序列按表1中进行合成，以abe8e为载体(addgene#138489)，之后进行无缝克隆组装(试剂盒购于：vazyme clonexpress multis one step cloning kit，c113-01)，靶点即按表2进行合成两条oligo，正链加cacc，反链加上aaac，连接至已经用bbsi酶切好的u6-sgrna-ef1α-gfp上；质粒u6-sgrna-ef1α-gfp的核苷酸序列如seq id no:56所示，其中，靶向靶序列的sgrna的编码序列用连续的n表示。
[0047]
1.1.3将1.1.1与1.1.2中构建的质粒经sanger测序，确保完全正确。
[0048]
表1：tada-8e单点突变序列
[0049]
[0050][0051]
abe8e的各个功能嵌段排列次序为：bnls+tada8e+linker+spcas9n(d10a)+bnls。
[0052]
ads-be1的各个功能嵌段排列次序为：bnls+tada8e(n46l)+linker+spcas9n(d10a)+bnls。
[0053]
构建体中bnls的氨基酸序列为seq id no:1的2-19位，省略第一位的m。
[0054]
seq id no:1:mkrtadgsefespkkkrkv；
[0055]
构建体中tada-8e的氨基酸序列为seq id no:2的2-167位，省略第一位的m。
[0056]
seq id no:2:msevefsheywmrhaltlakrarderevpvgavlvlnnrvigegwnraiglhdptahaeimalrqgglvmqnyrlidatlyvtfepcvmcagamihsrigrvvfgvrnskrgaagslmnvlnypgmnhrveitegiladecaallcdfyrmprqvfnaqkkaqssin；
[0057]
linker的氨基酸序列如seq id no:3所示，
[0058]
seq id no:3:sggssggssgsetpgtsesatpessggssggs；
[0059]
构建体中spcas9n(d10a)的氨基酸序列为seq id no:4的2-1368位，省略第一位的m。
[0060]
seq id no:4:mdkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkli
arkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd。
[0061]
表2：实施例中使用的靶点及其序列
[0062]
[0063][0064]
1.2细胞转染
[0065]
第1天用hek293t(hek293t细胞为atcc crl-3216细胞系)细胞铺种24孔板：
[0066]
(1)消化hek293t细胞，按照2
×
105个/孔接种24孔板；
[0067]
注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验；
[0068]
第2天转染：
[0069]
(2)观察各孔细胞状态；
[0070]
注：要求转染前细胞密度应为70％-90％，且状态正常；
[0071]
(3)质粒转染；
[0072]
使用上述步骤1中新构建的各个abe8e突变体质粒：u6-sgrna-ef1α-gfp＝750ng:250ng的质粒用量，转染试剂为pei(每1μg质粒加3μl pei)，共转染hek293t宿主，以abe8e作为对照；设置n＝3孔/组。
[0073]
1.3基因组提取及扩增子文库的准备
[0074]
转染后72h，用天根细胞基因组提取试剂盒(dp304)提取细胞基因组dna。之后用hi-tom gene editing detection kit(诺禾致源)操作流程，设计相对应的鉴定引物(如表3所示)，即在正向鉴定引物5’端加上搭桥序列5
’‑
ggagtgagtacggtgtgc-3’(seq id no:57)，反向鉴定引物5’端加上搭桥序列5
’‑
gagttggatgctggatgg-3’(seq id no:58)，即得到一轮pcr产物，之后利用一轮pcr产物作为模板，进行二轮pcr产物，然后混在一起进行切胶
回收纯化后送公司进行测序(测序公司：苏州金唯智生物科技有限公司)。
[0075]
表3：所用靶点的鉴定引物
[0076]
[0077]
[0078][0079]
1.4深度测序结果分析与统计
[0080]
利用be-analyzer网站(http://www.rgenome.net/be-analyzer/#！)分析深度测序结果，即统计a到g、c到t、c到g、c到a的比率，并用graphpad prism 9.1.0进行统计作图，如表4和图2所示。
[0081]
表4：靶点fancf site 1的编辑效率结果(单位：％)
[0082]
[0083]
[0084][0085]
根据二代测序结果发现，相对于abe8e，abe8e-n46a、abe8e-n46g、abe8e-n46l、abe8e-n46p和abe8e-n46r均完全废除a到g的编辑(图2和表4)，其中abe8e-n46l和abe8e-n46p同时展现出高效的胞嘧啶c6编辑(c到g+c+a)，并且产物更多以c到g为主，产生c到g编辑分别为43.93％和43.87％；而3’端的c7和c8几乎不产生编辑(表4)，展现出较高的精准性，故选择abe8e-n46l命名为ads-be1(abe derived single base editor)，作为一种不依赖于胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶、dna修复因子等多种融合物的新型迷你cgbe。
[0086]
实施例2：ads-be1工作特性描述
[0087]
2.1质粒设计及构建
[0088]
2.1.1设计12个来自于人的内源性靶点ssh2 sg10、tim3-sg4、abe site 8、egfr-sg4、hbg-sg14、ppp1r12c site 5、fancf-sg15、abe site 23、ppp1r12c site 7、fancf-sg17、hp53-sg1和ox40-sg1进行工作特性描述(表2)，构建方法同1.1.2；
[0089]
2.1.2将2.1.1中构建的质粒经sanger测序，确保完全正确。
[0090]
2.2细胞转染
[0091]
第1天用hek293t(hek293t细胞为atcc crl-3216细胞系)细胞铺种24孔板：
[0092]
(1)消化hek293t细胞，按照2
×
105个/孔接种24孔板；
[0093]
注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验；
[0094]
第2天转染：
[0095]
(2)观察各孔细胞状态；
[0096]
注：要求转染前细胞密度应为70％-90％，且状态正常；
[0097]
(3)质粒转染量如下：
[0098]
2.1中新构建的质粒：u6-sgrna-ef1α-gfp＝750ng:250ng的质粒用量，转染试剂为pei(每1μg质粒加3μl pei)，共转染hek293t宿主，以abe8e、cgbe1(addgene#140252)和apo1
–
ncas9
–
xrcc1(addgene#165444)作为对照；设置n＝3孔/组。
[0099]
2.3基因组提取及扩增子文库的准备
[0100]
转染后72h，用天根细胞基因组提取试剂盒(dp304)提取细胞基因组dna。之后用hi-tom gene editing detection kit(诺禾致源)操作流程，设计相对应的鉴定引物(如表3所示)，即在正向鉴定引物5’端加上如seq id no:57所示的搭桥序列，反向鉴定引物5’端加上如seq id no:58所示的搭桥序列，即得到一轮pcr产物，之后利用一轮pcr产物作为模板，进行二轮pcr产物，然后混在一起进行切胶回收纯化后送公司进行测序(测序公司：苏州金唯智生物科技有限公司)。
[0101]
2.4深度测序结果分析与统计
[0102]
利用be-analyzer网站进分析深度测序结果，即统计a到g、c到t、c到g、c到a的比率，并用graphpad prism 9.1.0进行统计作图。
[0103]
表5：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1、abe8e在293t上12个内源位点展现的c》g碱基编辑效率对比(单位：％)
[0104]
[0105][0106][0107][0108]
[0109][0110][0111]
[0112][0113][0114]
[0115][0116][0117][0118]
表6：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1、abe8e不同位置平均c》g碱基编辑对比(统计12个内源位点)(单位：％)
[0119][0120]
结果表明(图3和表5)，以cgbe1、apo-ncas9-xrcc1(两个传统cgbe)和abe8e为对照，对于fancf-sg15、ppp1r12c site7、hp53-sg1和ox40-sg1靶点，ads-be1展现精准编辑特性，更偏好编辑c5/c6，根据12个靶点不同位置的平均c到g效率统计(图4和表6)，对于c5位置，ads-be1、cgbe1和apo-ncas9-xrcc1三种cgbe平均效率分别为27.87％、17.96％和7.72％；对于c6位置，三者平均效率分别为32.23％、41.36％和26.26％，而对于旁观者c7、c8、c4,cgbe1产生c到g平均效率为11.04％、11.39％和9.55％；apo-ncas9-xrcc1产生c到g平均效率为6.29％、6.1％和4.45％，ads-be1产生c到g平均效率仅为2.15％、0.7％和0.5％；说明ads-be1对c5/c6之外的位置不会产生有效编辑，此外，ads-be1对于motif(目标c的背景序列)也有偏好，对于c5和c6位置的tc序列靶点，ads-be1与传统cgbe1和apo-ncas9-xrcc1效率持平，但是对于gc和cc序列靶点，ads-be1编辑效率要高于传统cgbe1和apo-ncas9-xrcc1；但是对ac序列靶点，ads-be1极其不敏感，编辑效率远远低于传统cgbe1和apo-ncas9-xrcc1。由上述结果得出：c5/c6极窄窗口和motif序列偏好赋予ads-be1高精度编辑性能。
[0121]
实施例3：ads-be1安全性评价
[0122]
3.1质粒设计及构建
[0123]
3.1.1为了进一步描述ads-be1的安全性，再次以abe8e为对照，目标位点为abe site 23，设计4个cas9非依赖性脱靶检测靶点(表2)，合成两条oligo，正链加cacc，反链加上aaac，连接至已经用bbsi酶切好的nsacas9-r-loop载体上(图8)；
[0124]
3.1.2将1.1中构建的质粒经sanger测序，确保完全正确；
[0125]
3.2.细胞转染
[0126]
第1天用hek293(hek293t细胞为atcc crl-3216细胞系)细胞铺种24孔板：
[0127]
(1)消化hek293t细胞，按照2
×
105个/孔接种24孔板；
[0128]
注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验；
[0129]
第2天转染：
[0130]
(2)观察各孔细胞状态；
[0131]
注：要求转染前细胞密度应为70％-90％，且状态正常；
[0132]
(3)质粒转染量如下：
[0133]
ads-be1/cgbe1/apo-ncas9-xrcc1/abe8e：3.1中新构建的质粒：abe site 23靶点
质粒＝400ng:300ng:300ng的质粒用量，转染试剂为pei(每1μg质粒加3μl pei)，共转染hek293t宿主，设置n＝3孔/组。
[0134]
3.3基因组提取及扩增子文库的准备
[0135]
转染后72h，用天根细胞基因组提取试剂盒(dp304)提取细胞基因组dna。之后用hi-tom gene editing detection kit(诺禾致源)操作流程，设计相对应的鉴定引物(如表3所示)，即在正向鉴定引物5’端加上如seq id no:57所示的搭桥序列，反向鉴定引物5’端加上如seq id no:58所示的搭桥序列，即得到一轮pcr产物，之后利用一轮pcr产物作为模板，进行二轮pcr产物，后混在一起进行切胶回收纯化后进行送公司进行测序(测序公司：苏州金唯智生物科技有限公司)。
[0136]
3.4深度测序结果分析与统计
[0137]
利用be-analyzer网站分析深度测序结果，即统计c到t、c到g、c到a的比率和indels，并用graphpad prism 9.1.0进行统计作图。
[0138]
表7：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1、abe8e产生的indels对比(统计12个内源位点)(单位：％)
[0139][0140]
表8:ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1、abe8e产生的非依赖性脱靶对比(单位：％)
[0141][0142][0143]
表9：ads-be1、cgbe1、apo1-ncas9-xrcc1、abe8e目标位点abe site23产生的c-g效率对比(单位：％)
[0144][0145]
根据indels(插入和缺失)数据统计结果(图5和表7)表明：abe8e产生indels平均效率为5.25％，ads-be1产生indels平均效率为8.1％，cgbe1产生indels平均效率为15.88％，apo-ncas9-xrcc1产生indels平均效率为26.93％，因此，ads-be1产生的indels远远低于传统cgbe系列，与原始的abe8e持平；根据cas9非依赖性脱靶评价(图6a、图6b、图6c和表8)，在4个r-loop位点检测发现ads-be1引起极低的c的编辑(c到g，c到t，c到a)，这些微量的脱靶编辑事件展现出ads-be1较高的安全性；同时，目标位点产生高效的c到g编辑(图7和表9)。
[0146]
参考文献：
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技术特征：
1.一种腺嘌呤脱氨酶，其特征在于，所述腺嘌呤脱氨酶相比于如seq id no:2所示的氨基酸序列具有氨基酸差异，所述氨基酸差异位于第28位、第30位和第46位中的一位或多位；优选位于第46位。2.如权利要求1所述的腺嘌呤脱氨酶，其特征在于，第28位氨基酸残基v替换为a或g；第30位氨基酸残基v替换为f；第46位氨基酸残基n替换为a、g、l或p，优选l或p；较佳地，所述腺嘌呤脱氨酶包括核定位信号序列，所述核定位信号的氨基酸序列优选如seq id no:1所示；更佳地，所述腺嘌呤脱氨酶包括连接子序列，所述连接子的氨基酸序列优选如seq id no:3所示。3.一种实现高效碱基颠换的基因编辑器，其特征在于，所述实现高效碱基颠换的基因编辑器在单碱基编辑工具的基础上引入如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶；和/或，引入其他突变或其他改造，例如改变连接子的长度、融合新的功能蛋白。4.如权利要求3所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器，其特征在于，其包括：启动子元件、核酸酶、多聚腺苷酸a和如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶；其中：所述启动子元件优选光谱启动子、组织特异型启动子或肝脏特异性启动子，更优选cmv启动子；所述核酸酶优选cas蛋白及其变体，所述cas蛋白优选酿酒酵母来源的spcas9、金黄色葡萄球菌来源的sacas9、毛螺菌科细菌来源的lbcas12a或酸胺球菌属细菌来源的enascas12a；所述cas蛋白变体优选vqr-spcas9、vrer-spcas9、spry、spng、sacas9-kkh或sacas9-ng；较佳地，所述核酸酶的氨基酸序列如seq id no:4所示；所述多聚腺苷酸a优选牛生长激素多腺苷酸化信号或其他物种多腺苷酸化信号，更优选牛生长激素多腺苷酸化信号bghpolya。5.一种实现高效碱基颠换的基因编辑系统，其特征在于，其包括：sgrna和如权利要求3所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器；较佳地，所述sgrna的靶序列如seq id no:5-21的核苷酸序列所示。6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3或4所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、或如权利要求5所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统。7.一种非治疗目的的基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑方法包括：在靶细胞中表达如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3或4所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、如权利要求5所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统，使所述靶细胞发生碱基颠换的基因编辑；较佳地，所述靶细胞的来源为分离的细胞系；更佳地，所述分离的细胞系为293t细胞、hela细胞、u2os细胞、nih3t3细胞或n2a细胞。8.如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3或4所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、如权利要求5所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统在制备基因编辑的药物或制备基因治疗的药物中的应用。
9.如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3或4所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、如权利要求5所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统在构建动物模型和农作物育种中的应用。10.如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3或4所述的实现高效碱基颠换的基因编辑器、如权利要求5所述的实现高效碱基颠换的基因编辑系统在制备碱基编辑工具中的应用。

技术总结
本发明公开了一种实现高效碱基颠换的迷你基因编辑系统及其应用。所述基因编辑系统在单碱基编辑工具ABE8e的基础上，对腺嘌呤脱氨酶TadA-8e的催化活性位点进行氨基酸替换，获得30个单点突变体。其中ABE8e-N46L(命名为：ADS-BE1)为目前体积最小的CGBE，可在5-7位引起精准的C-G到G-C碱基颠换编辑，且完全消除了ABE的原始功能(执行对腺嘌呤A的编辑能力)；并且相对于传统的CGBE系列，其展示出较高的编辑活性和较低的脱靶事件，具备极高的安全性。本发明的ADS-BE1碱基编辑器为单碱基基因编辑技术领域较大的一个技术改进，将极大促进其在基因编辑、精准医疗、疾病模型制作、作物遗传育种等方面的应用。等方面的应用。


技术研发人员：陈亮 李大力 汝高盟 李长青 高弘毅 刘明耀
受保护的技术使用者：上海邦耀生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2023/7/13