一种水稻GAT转化事件GATV3-96-1的侧翼序列及其检测引物与应用的制作方法

一种水稻gat转化事件gatv3-96-1的侧翼序列及其检测引物与应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及转基因水稻的安全评估和检测，具体地说，涉及一种水稻遗传智能化育种技术(gat)转化事件外源插入片段的侧翼序列及其特异性性引物与应用。


背景技术：

2.近年来，大豆、玉米、棉花和油菜等转基因作物已在很多国家获准种植和生产，转基因作物可加工成食品、饲料或食品添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全目前仍备受争议，需对转基因产品进行严格的监管。进行转基因作物的生物安全评价是转基因产品监管中的重要环节，包括鉴定转化事件在宿主基因组中的具体插入位点、根据插入位点判断宿主基因组插入失活或缺失的情况，进一步推测该转化事件对宿主的影响和可能导致的安全性问题。
3.由于外源插入片段在宿主植物基因组中的整合位置是随机的，每个外源插入片段左右端序列与宿主基因组序列拼接而成的插入位点侧翼序列是唯一的。因此，插入位点侧翼序列是区别不同转化事件的唯一性标识，是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。转化事件的特异性检测具有高度特异性，可准确识别不同的转基因作物品系。目前分离外源插入片段的侧翼序列主要以pcr技术为基础，建立的特异性检测方法包括反向pcr、外源接头介导pcr、半随机引物pcr、全基因组重测序技术等，其中半随机引物pcr中的热不对称交错pcr(tail-pcr)、高效热不对称pcr(hitail-pcr)或染色体步移法(genome walking)是当前常见的使用方法。
4.遗传智能化育种技术(genetic automation technology，gat)是一种新型的杂交种子育制种技术，该技术可成功利用隐性核雄性不育系。gat的核心思路是利用现代生物技术，将农作物花粉育性恢复基因、花粉败育基因、除草剂敏感基因、筛选标记基因等按特定顺序和方向紧密连锁地构建在gat载体上，通过高通量基因转化技术导入到隐性核雄性不育系中，获得大量转化事件。
5.本发明基于已获得的具遗传稳定性且农艺性状优良的水稻gat转化事件gatv3-96-1。明确了水稻gat转化事件gatv3-96-1的分子特征、推进了gatv3-96-1的生物安全性评价工作。本发明以gatv3-96-1的t0代植株的dna为模板，利用hitail-pcr分离其t-dna侧翼序列，并根据t-dna左右端序列和左右侧翼序列设计检测引物，建立了特异性检测水稻gat转化事件gatv3-96-1的方法，同时检验该方法的特异性与灵敏度，为水稻gat转化事件gatv3-96-1及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供水稻gat转化事件gatv3-96-1的插入位点及其侧翼序列，同时提供相应的检测引物。
10所示的引物对扩增出621bp目的片段，则说明样品中含有水稻gat转化事件gatv3-96-1来源的成分。
21.在本发明提供的方法中，pcr扩增程序为：93-95℃1-2.5min；93-95℃20-40s；50-60℃20-40s；70-73℃1-1.5min；70-73℃5-6min；23-27℃1.5-2.5min，30-35个循环；优选地：94℃2min；94℃30s；60℃30s；72℃1min；72℃5min；25℃2min，30-35个循环。
22.本发明的有益效果是：
23.(1)本发明首次公布水稻遗传智能化育种技术(gat)转化事件gatv3-96-1外源基因在水稻基因组中插入位点的侧翼序列；
24.(2)本发明首次确认水稻遗传智能化育种技术(gat)转化事件gatv3-96-1外源基因在水稻基因组中插入位点的侧翼序列中不同碱基的来源，并确定外源载体插入水稻基因组序列的接合位点序列；
25.(3)利用本发明发现的侧翼序列，首次建立水稻遗传智能化育种技术(gat)转化事件gatv3-96-1的特异性定性检测方法；
26.(4)本发明适用于对水稻遗传智能化育种技术(gat)转化事件gatv3-96-1世代及其衍生系实施检测、监测和安全管理。
附图说明
27.图1是本发明实施例1中，水稻gat转化事件gatv3-96-1喷施5x咪唑乙烟酸表型图；其中0d为未喷药之前，14d为喷药14d，wt为野生型，ck+为阳性对照(咪唑乙烟酸抗性植株)，96-1为gatv3-96-1。
28.图2是本发明实施例1中，水稻gat转化事件gatv3-96-1喷施3g/l苯达松表型图；其中0d为未喷药之前，7d为喷药7d，14d为喷药14d，wt为野生型，ck+为阳性对照(苯达松敏感突变体)，96-1为gatv3-96-1。
29.图3是发明实施例1中，水稻gat转化事件gatv3-96-1花粉育性与种子荧光图；其中zh11为中花11，96-1(t0)为gatv3-96-1的t0代，96-1(t1)为gatv3-96-1的t1代。
30.图4是本发明实施例2中，水稻gat转化事件gatv3-96-1右边界侧翼序列的hitail-pcriii电泳图；其中，m为marker；ddh2o为双蒸水；zh11为非转基因粳稻中花11；9311为非转基因籼稻9311；p为gatv3载体质粒；96-1为水稻gat转化事件gatv3-96-1。
31.图5是本发明实施例3中，水稻gat转化事件gatv3-96-1在水稻基因组中的整合位点示意图；其中，水稻gat转化事件gatv3-96-1的t-dna插入水稻基因组2号染色体表达蛋白os02g0125700的第一外显子第1344745-1344777碱基处。
32.图6是本发明实施例5中，水稻gat转化事件gatv3-96-1特异性定性pcr扩增图；其中：wt为非转基因水稻基因dna模板；96-1为水稻gat转化事件gatv3-96-1基因组dna模板。
具体实施方式
33.以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
34.若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
35.实施例1获得水稻gat转化事件gatv3-96-1
36.本实施例中，基于遗传智能化育种技术gat，使用花粉育性恢复基因、花粉败育基因、除草剂敏感基因、筛选标记基因等按特定顺序和方向紧密连锁地构建在载体pc0309-khvmaaumcmk5400(gat)上(载体序列如seq id no.16所示，本发明中称为gatv3载体)。载体pc0309-khvmaaumcmk5400具体载体构建方式，参照申请号为202010379287.9的中国专利《一种用于农作物杂交育种制种的遗传智能化育制种系统及其应用》，成功导入水稻植株中花11(zh11，携带纯合隐性雄性不育基因oscyp704b2-3)中。gatv3-96-1是其中一个转化事件，已在会议摘要中公开(the 8th international conference on botany,dec.4-6,2021,progress of genetic automation technology breeding system based on recessive genic male sterility,xiongxia jin)，其中96-1为本转化事件。
37.根据gat载体的各个元件，对转化事件gatv3-96-1进行除草剂表型、花粉育性、种子荧光检测，结果为：(1)根据正向/负向除草剂筛选显示，转化事件gatv3-96-1在喷施5x咪唑乙烟酸溶液时，表型为高抗，说明了保持系筛选元件表达盒高效工作，可用于gat保持系除杂提纯，见图1；喷施3g/l苯达松溶液时，表型为高敏，说明了除草剂敏感元件表达盒高效灵敏，可用于gat不育系除杂提纯，见图2。(2)利用碘化钾染色法，对转化事件gatv3-96-1花粉进行育性检测，败育花粉：可育花粉＝1:1，说明了恢复基因元件和花粉败育基因元件的工作效率高，使得保持系保持杂合状态，见图3。(3)按花粉育性鉴定结果，在560-595nm激发光显微镜下观察，其自交结实的种子也将呈现1:1分离，即其中50％为包含gat载体的种子，则呈现深红色荧光；50％为不包含gat载体的种子则无荧光，说明了荧光蛋白表达能正常工作，可用于种子机械分选，见图3。同时在t1、t2具备上述功能，证明能在世代中稳定遗传。
38.综上所述，单拷贝的转化事件gatv3-96-1各元件均发挥正常功能的优良初始保持系，具有遗传稳定性。其中保持系自交实现不育系和保持系的繁殖，可广泛应用于杂交稻，提高了杂交稻育种效率。
39.实施例2水稻gat转化事件gatv3-96-1右边界侧翼序列的扩增
40.(1)tps法抽提水稻基因组dna
41.①
磨样：取实施例1中获得的转基因水稻gat转化事件gatv3-96-1嫩叶3-4cm长的叶片(老叶片取1-2cm)，放入2ml的离心管中，加800μl的tps抽提液，加入钢珠，用细胞破碎仪(磨样机)研磨120秒；
42.②
研磨结束，放入75℃的水浴锅中温育30min；
43.③
13000rpm离心10min，取上清液(约500μl)于另一个1.5ml离心管中；
44.④
加入二倍体积预冷的无水乙醇或等体积的异丙醇，轻轻混匀，于-30℃冰箱放置2-3小时(或者置于4℃冰箱静置过夜；或者放在-80℃冰箱放置1-2h)，直到dna析出；
45.⑤
13000rpm离心5min，倒去上清液，将离心管倒置于台面上风干；
46.⑥
风干后加200μl 1
×
te溶液或灭菌ddh2o中溶解；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用微量紫外分光光度计测定dna浓度，置于4℃冰箱备用。
47.(2)利用hitail-pcr分离t-dna右侧翼序列
48.参照liu等(2007)的高效热不对称pcr(hitail-pcr)方法，并利用liu在右边界(right border，rb)序列设计3条特异性引物(gatv3-rb-f1～f3)，与简并引物lad1-1，lad1-3和ac1组合，进行t-dna右侧翼序列的分离，具体引物序列见表1。
49.表1 hitail-pcr引物表
[0050][0051]
b为(g/c/a)，b为g或c或a。
[0052]
利用hitail-pcr技术分3级扩增水稻gat转化事件gatv3-96-1外源载体插入位点右侧翼序列。hitail-pcr第1级反应使用2条长随机引物(lad1-1和lad1-3等比例混合)与特异性引物gatv3-rb-f1组合，以水稻gat转化事件gatv3-96-1基因组dna为模板进行pcr扩增，以ddh2o、非转基因水稻中花11和9311和gatv3质粒作为对照。第1级pcr扩增反应产物稀释40倍用作第2级tail-pcr反应的模板，第2级反应的引物组合为ac1/gatv3-rb-f2。将第2级反应产物稀释10倍用作第3级反应的模板，引物组合为ac1/gatv3-rb-f3。第二级和第三级反应的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，选择特异性条带542bp测序(如图4)。pcr反应体系及程序如表2和表3：
[0053]
表2 hitail-pcr反应体系
[0054]
[0055][0056]
表3 hitail-pcr反应程序
[0057][0058][0059]
实施例3水稻gat转化事件gatv3-96-1的t-dna在水稻基因组中整合位点
[0060]
将hitail-pcr扩增的特异性条带pcr产物测序，得到542bp的右边界融合序列，序列如seq id no.13所示。经ncbi网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)与水稻基因组比对，及与gatv3载体序列比对，分析该序列的特征为：第1至29位与载体右边界序列完全匹配，第30至第69位为未知插入序列(seq id no.14)，第70至第542位于水稻基因组序列，与已公布的水稻chr2号染色体上序列【ap014958.1(1344777 to 1345249)】完全匹配。即水稻gat转化事件gatv3-96-1的t-dna的3’端插入水稻基因组2号染色体表达蛋白os02g0125700的第一外显子第1344777碱基处(如图5)。
[0061]
实施例4水稻gat转化事件gatv3-96-1左边界侧翼序列的扩增
[0062]
根据实施例3获得插入位点信息，在已公布的水稻第2号染色体上的序列设计正向引物g2f1(96-1)，序列如seq id no.9所示(5'-ctgccattcgatactgcacact-3')，以及载体gatv3部分序列设计反向引物lb-r2，序列如seq id no.10所示(5'-gcaatgaatatgctgccatcc-3')，用该对引物对扩增获得水稻gat转化事件gatv3-96-1的左侧翼序列，将该扩增产物送样测序，获得序列如seq id no.2所示，长度为621bp。通过分析seq id no.2发现，获得的序列第1至第333位于水稻基因组序列，与已公布的水稻chr2号染色体上序列(ap014958.1(1344413 to 1344745))完全匹配；第334至第621位与载体gatv3的部分序列完全相同。即水稻gat转化事件gatv3-96-1的t-dna的5’端插入水稻基因组2号染色体第1344745碱基处(如图5)。水稻gat转化事件gatv3-96-1的t-dna在插入水稻基因组2号染色体表达蛋白os02g0125700的第一外显子第1344745-1344777碱基处，同时导致水稻chr2号染色体缺失31bp(ap014958.1(1344746-1344776))，序列如seq id no.15所示。其中，1344746-1344748为表达蛋白os02g0125700的5'utr，1344749-1344776为os02g0125700的第一外显子。
[0063]
实施例5水稻gat转化事件gatv3-96-1特异性pcr检测方法
[0064]
根据实施例3和4获得水稻gat转化事件gatv3-96-1的右侧翼序列和左侧翼序列，分别在水稻chr2号染色体上和外源载体部分设计特异性引物，具体引物序列见表4。以水稻gat转化事件gatv3-96-1后代基因组dna为模板，野生型(wt)为对照，进行pcr扩增，具体pcr反应体系见表5。扩增程序为：94℃2min；94℃30s；60℃30s；72℃1min；72℃5min；25℃2min，30-35个循环。利用1.0％琼脂糖凝胶进行pcr产物检测(见图6)。
[0065]
表4水稻gat转化事件gatv3-96-1特异性检测引物
[0066][0067]
表5反应体系
[0068][0069][0070]
结果表明：
[0071]
(1)g2f1(96-1)/g2r1(96-1)组合：水稻gat转化事件gatv3-96-1模板和野生型(wt)均能扩出661bp目的条带(如图6)符合预期，并说明水稻gat转化事件gatv3-96-1为杂合株系；
[0072]
(2)rb-f2/g2r1(96-1)组合：水稻gat转化事件gatv3-96-1模板能扩出右边界的插入载体和水稻基因组的融合序列470bp目的条带，获得序列如seq id no.1所示，而野生型(wt)未能扩出目的条带(如图6)，符合预期结果，表明水稻gat转化事件gatv3-96-1中含有gat载体插入片段。
[0073]
(3)g2f1(96-1)/lb-r2组合：水稻gat转化事件gatv3-96-1模板能扩出左边界的插入载体和水稻基因组的融合序列621bp目的条带，获得序列如seq id no.2所示，而野生型(wt)未能扩出目的条带(如图6)，符合预期结果，表明水稻gat转化事件gatv3-96-1中含有gat载体插入片段；
[0074]
以上结果表明，g2f1(96-1)/lb-r2和rb-f2/g2r1(96-1)引物组合能扩增获得水稻gat转化事件gatv3-96-1及其转育株系(衍生系)左右边界序列，而在非转基因或其他转基因水稻品种均未能扩出特异性融合条带，上述引物可用于鉴定水稻gat转化事件gatv3-96-1世代及其衍生序列。
[0075]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.转基因水稻转化事件外源插入载体的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列的右侧翼序列如seq id no.1所示；所述侧翼序列的左侧翼序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列分别使用如seq id no.11-12所示和如seq id no.9-10所示的引物对扩增得到。3.检测权利要求1或2所述的侧翼序列的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no.11-12所示和如seq id no.9-10所示。4.权利要求1或2所述的侧翼序列或权利要求3所述的引物在检测或识别转基因水稻及其衍生产品中的应用；所述转基因水稻为水稻gat转化事件gatv3-96-1。5.一种pcr检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求3所述的引物。6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒中还包括水、taq dna聚合酶、dntps、pcr缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。7.一种检测转基因水稻gatv3-96-1的方法，其特征在于，检测水稻样品dna中是否同时存在seq id no.1和seq id no.2所示的序列。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用权利要求3所述的引物或权利要求5-6任一项所述的试剂或试剂盒，以待测样品的dna为模板，进行pcr扩增。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据pcr扩增产物，判断待测样品的2号染色体上表达蛋白os02g0125700的第一外显子第1344745-1344777碱基处是否插入pc0309-khvmaaumcmk5400的t-dna片段；若如seq id no.11-12所示的引物对扩增出470bp的目的片段，和如seq id no.9-10所示的引物对扩增出621bp目的片段，则说明样品中含有gatv3-96-1来源的成分。10.根据权利要求8-9任一所述的方法，其特征在于，pcr扩增程序为：93-95℃1-2.5min；93-95℃20-40s；50-60℃20-40s；70-73℃1-1.5min；70-73℃5-6min；23-27℃1.5-2.5min，30-35个循环。

技术总结
本发明涉及一种水稻GAT转化事件GATV3-96-1的侧翼序列及其检测引物与应用。本发明提供的侧翼序列包括如SEQ ID NO.1所示的右侧翼序列和如SEQ ID NO.2所示的左侧翼序列。本发明提供检测所述侧翼序列的特异性引物SEQ ID NO.9-10或SEQ ID NO.11-12。采用本发明提供的特异性引物对待测水稻的DNA样品进行PCR扩增，能够特异性地指示水稻第2号染色体表达蛋白Os02g0125700的第一外显子第1344745-1344777碱基处是否插入pC0309-KhvMaauMCMK5400的T-DNA片段。本发明成功实现了对转基因水稻及其衍生系实施检测和安全管理。衍生系实施检测和安全管理。


技术研发人员：安保光 陈思兰 金雄霞 孙彤 王健华 陈欣妍 吴永忠 黄培劲
受保护的技术使用者：海南波莲水稻基因科技有限公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2023/7/13