家蚕BmGNβ1基因的应用

家蚕bmgn
β
1基因的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，具体涉及到bmgnβ1基因的应用。


背景技术：

2.家蚕(bombyxmori)是一种具有重要经济价值的驯化昆虫，也是完成全基因组测序的鳞翅目模式昆虫。由家蚕核型多角体病毒(bombyxmori nucleopolyhedrovirus,bmnpv)引发的家蚕血液型脓病是对蚕业生产危害最为严重的一类恶性传染性疾病，该病传染性极强，常呈爆发态势，难以控制，每年由此病给蚕业生产带来的损失大约占蚕病损失的70％左右，目前仍没有有效的方法和药物可以对该病进行控制。
3.寻找影响家蚕对bmnpv抗性的关键基因，通过分子辅助育种技术手段来培育抗病品种一直是蚕业科研工作者的研究重点。因此，鉴定影响家蚕抗bmnpv的关键基因，获得其全长序列，为阐明家蚕抗病毒机制以及培育抗性品种对于蚕桑产业的发展有着重要的理论和应用价值，同时也能为鳞翅目的害虫防控提供潜在的分子靶标。
4.异源三聚体gtp结合蛋白(heterotrimericgtp-bindingprotein，g蛋白)由α、β、γ三种亚基所构成，将从g蛋白耦联受体而来的信号传递给下游信号分子，调控细胞中的激酶活性、离子通道活性及细胞骨架稳定性等。昆虫中表达5种不同的gβ亚基，阐明每一种β亚基的作用对于清晰认识gβγ二聚体的生物学功能有着重要意义。但目前为止，还没有关于家蚕异源三聚体gtp结合蛋白β亚基1(bmgnβ1)相关功能的报道。


技术实现要素：

5.本发明首次发现家蚕bmgnβ1基因是一个影响家蚕抗bmnpv的关键基因，首次发现其可以应用于抗bmnpv，该应用为调控家蚕核型多角体病毒抗性提供了新方法。
6.本发明通过实验验证首次表明bmgnβ1基因的增量表达能够显著降低bmnpv侵染家蚕后的增殖复制，对阐明bmgnβ1基因的生物学功能和培育抗bmnpv家蚕品种起到积极作用，有巨大的应用价值。发明人根据家蚕基因组序列设计引物，利用家蚕品种by的中肠组织总rna，克隆了家蚕bmgnβ1基因的编码区序列，借助cdna末端快速克隆技术(race)，获得完整的3'端和5'端序列，经过拼接，最终获得所述的家蚕bmgnβ1基因的全长cdna序列。通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)方法检测了bmgnβ1基因的时期、组织表达情况，表明bmgnβ1基因在各时期、各组织中均有表达，且能被bmnpv病毒诱导性下调表达，暗示bmgnβ1基因参与了bmnpv病毒和家蚕的互作。为进一步表明其功能，通过增量表达的方式来提高bmgnβ1基因的表达量，然后感染病毒，检测病毒增殖是否受到了抑制。根据所获得的bmgnβ1基因序列，与19-t载体连接，再与pizt/v5-his-mcherry载体用kpnⅰ内切酶和xbaⅰ内切酶进行双酶切，最终构建bmgnβ1-pizt/v5-his-mcherry重组质粒。以构建好的增量表达转染载体，感染bmn细胞，然后感染bmnpv-egfp病毒，荧光观察和qrt-pcr方法检测都显示增量表达bmgnβ1基因能够显著抑制bmnpv病毒的增殖。说明bmgnβ1基因是一个影响家蚕抗bmnpv的关键基因，可以作为家蚕抗病育种的靶标基因使用。
7.本发明解决技术问题的技术方案如下：
8.在本发明的第一方面，提供了家蚕bmgnβ1基因在培育抗bmnpv家蚕品种中的应用，所述基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。所述基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
9.在本发明的第二方面，提供了一种培育抗bmnpv家蚕品种的方法，所述的方法通过在家蚕中增量表达家蚕bmgnβ1基因实现，所述家蚕bmgnβ1基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
10.在本发明的第三方面，提供了家蚕bmgnβ1基因在制备抗家蚕bmnpv药物中的应用，所述基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。所述基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
11.在本发明的第四方面，提供了如第一方面所述家蚕bmgnβ1基因的制备方法，具体步骤如下：根据家蚕基因组序列设计bmgnβ1基因编码区特异性引物，以家蚕5龄起蚕的中肠组织cdna为模板进行编码区pcr扩增；用race试剂盒对家蚕bmgnβ1基因的5’race和3’race进行扩增；将这三个片段进行胶回收并克隆到pmd19-t载体，转化到大肠杆菌dh10b中，涂布平板并过夜培养，挑取阳性克隆，并进行菌液pcr进行鉴定。
12.进一步地，所述bmgnβ1基因编码区特异性引物序列如下：
13.正向引物5
’‑
gctattagagatgcgaggaa-3’seq id no：3
14.反向引物5
’‑
tggtcaggatctggttgt-3’seq id no：4。
15.进一步地，所述5’race和3’race的引物序列如下：
[0016]5’
race的5
’‑
外引物序列为gtcaggatctggttgtcgtcgaggaa，seq id no：5；
[0017]5’‑
内引物序列为tggccgacaccaagttcctggaatc，seq id no：6；
[0018]
3race的3
’‑
外引物序列为gcgacatcaacgcggtcacgttctt，seq id no：7；
[0019]3’‑
内引物序列为cgacaacatcatctgcggcatcacg，seq id no：8。
[0020]
本发明的有益结果在于：本发明克隆了家蚕抗bmnpv的关键基因bmgnβ1基因的全长序列，包括编码区cds序列、5
’‑
utr序列和3
’‑
utr序列。通过qrt-pcr技术检测了bmgnβ1基因在4个变态发育时期和幼虫各组织中的表达量，结果表明该基因在各时期、各组织中均有表达，且被bmnpv诱导下调表达，可能参与了bmnpv病毒和家蚕的互作。以编码区序列为靶标，构建增量表达载体，转染bmn细胞，发现增量表达bmgnβ1基因能够显著抑制bmnpv病毒的增殖。因此，bmgnβ1基因作为一个影响家蚕抗bmnpv的关键基因，在家蚕的抗病育种中具有重要的应用价值。
附图说明
[0021]
图1为家蚕bmgnβ1基因序列电泳图。其中，a:编码区cds扩增电泳图；b：3’race扩增电泳图；c:5’race扩增电泳图。
[0022]
图2为bmgnβ1在家蚕by品种各发育时期相对表达量。
[0023]
图3为by品种经口添食bmnpv48h后各组织相对表达量。
[0024]
图4为增量表达bmgnβ1基因可显著抑制bmnpv增殖复制，其中a.空载体pizt/v5-his-mcherry和过表达载体bmgnβ1-pizt/v5-his-mcherry转染bmn细胞24h、48h和72hbmgnβ1的相对表达水平；b.bmnpv-egfp感染pizt/v5-his-mcherry空载体24h、48h、72hbmn细胞感染；c.bv-egfp感染bmgnβ1-pizt/v5-his-mcherry后24h、48h、72h感染bmn细胞；d.bmnpv感染空载体pizt/v5-his-mcherry和过表达载体bmgnβ1-pizt/v5-his-mcherry转染的bmn细
胞后24h、48h和72hvp39的相对表达水平。说明：*,p《0.05有差异；**,p《0.01差异显著；***,p《0.001差异极显著；ns＝不显著。
具体实施方式
[0025]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0026]
主要试剂及生产厂家
[0027][0028]
实施例1bmgnβ1基因全长序列的克隆
[0029]
根据家蚕基因组序列设计bmgnβ1基因编码区特异性引物，
[0030]
正向引物5
’‑
gctattagagatgcgaggaa-3’(seq id no：3)
[0031]
反向引物5
’‑
tggtcaggatctggttgt-3’(seq id no：4)
[0032]
以家蚕5龄起蚕的中肠组织cdna为模板进行编码区pcr扩增，得到了一条约1200bp的条带(图1a)。
[0033]
用race试剂盒对家蚕bmgnβ1基因的5’race和3’race进行扩增。
[0034]
其中：
[0035]5’
race的5
’‑
外引物序列为gtcaggatctggttgtcgtcgaggaa(seq id no：5)
[0036]5’‑
内引物序列为tggccgacaccaagttcctggaatc(seq id no：6)
[0037]
3race的3
’‑
外引物序列为gcgacatcaacgcggtcacgttctt(seq id no：7)
[0038]3’‑
内引物序列为cgacaacatcatctgcggcatcacg(seq id no：8)
[0039]3’
race得到了一条约1100bp的条带(图1b)，5’race得到了一条约300bp的条带(图1c)。
[0040]
将这三个片段进行胶回收并克隆到pmd19-t载体，转化到大肠杆菌dh10b中，涂布平板并过夜培养，挑取阳性克隆，并进行菌液pcr进行鉴定，将正确的菌液送由上海生工生物工程有限公司测序。将测序结果进行拼接，结果显示，家蚕bmgnβ1基因全长为2243bp，3’race为935bp，5’race为288bp，orf为1023bp，编码340个氨基酸。
[0041]
bmgnβ1基因具有9个外显子，8个内含子，外显子/内含子边界处均符合gt-ag规则。bmgnβ1蛋白序列预测大小为37.24kd，有一个跨膜区域，为跨膜蛋白。
[0042]
bmgnβ1基因，其核苷酸序列如seq id no：1所示，具体如下：aaagggccgatcttgagggtgtatgaaaagctaatggtggattgttccgtgataaaaacttgtgaaatatccttgttttagtgtggtgatattgaaaagatacaaaatgtgccaaaaagtggttatccaatcttaatggtgatatagaaatcgcccgaaaatcgctggagcgtcgatcgaagggacattgctgacagaaggatcggtgcgttgcgtgttgtacgtgcgcggcgcgcggttgtcgatcgtctg
[0043]
ttccacgtgagctgtgtgtgacgcgtgtattaatc
[0044]
atgaacgagctggacagcctacgccaggaggcggaaacccttaaaaacgctattagagatgc
[0045]
gaggaaagcggcatgcgacacgtcgctggcccaggccacctcgaacctggagccgatcggt
[0046]
cgcatacagatgcgcacccgacgaaccttgcgcggtcatctcgcgaagatctacgccatgcac
[0047]
tggggcagtgattccaggaacttggtgtcggccagtcaggacggtaagctgatcgtgtggg
[0048]
acagccacacgaccaacaaggtgcacgcgatcccgctgcgctcatcctgggtgatgacctgc
[0049]
gcctacgcgccctcgggctcctacgtcgcttgcggtggactggacaacatctgctcgatttat
[0050]
agcctgaagacgcgcgagggcaacgtgcgcgtgtcccgcgagctgcccggccactcgggct
[0051]
acctgtcctgctgccgcttcctcgacgacaaccagatcctgaccagctccggcgacatgacct
[0052]
gcgcgctgtgggacatcgagaccgggcagcagtgcgggcagttcacgggccacaccggtg
[0053]
acgtcatgtcgctgtcgctggcgccggaccagcgcacgttcgtgtccggggcgtgcgacgc
[0054]
gtccgccaagctgtgggacgtgcgggactgcacgtgcaagcagaccttcccggggcacga
[0055]
gagcgacatcaacgcggtcacgttcttcccgtccgggttcgcgttcgcgacgggctccgatg
[0056]
acgccacgtgccgcatgttcgacatccgcgccgaccaggagctcgccatgtactcgcacgac
[0057]
aacatcatctgcggcatcacgtccgtcgccttctccaagtcgggccgcctgctgctcgccggc
[0058]
tacgacgacttcaactgcaacgtgtgggactccatgaagagcgagcgtgccggcatcctggc
[0059]
cggccacgacaaccgcgtgtcgtgtctcggcgtcaccgagaacggcatggcggtcgccacc
[0060]
ggctcctgggactccttcctgcgcatctggaac
[0061]
acatctcacacaaacaaacacctaaacacacacccaaacatatgtcgcatgattagtcaaacat
[0062]
cgatccatctatatatgtaatctataaaagttaatgtctgtatgttcgtcttgtacgccgattgag
[0063]
ttgaagctttgtatagttgtggacggctgcgtgaatgtttttgacttagtaccgttataacacg
[0064]
gtaggtggcgcgcgagtgcctcgtggagcgatagagacgataaagtgaggcacgatttgac
[0065]
tagcattcaatgtaccaatttattgttcagccgatttacacgtgagctcattaattgaaatttaa
[0066]
atgtatctgaaaaacgagatggtactaataagcatttatggagataatataattgtgaaggcaa
[0067]
cgtatgaatcacaactattgtcttttttgttgttgttatctctgaacttcatattacacgtacaca
[0068]
gacgattttattgaacaacgtttgagcagaacgaatgtttttctaaacatgtgacatagtgtaa
[0069]
agtcgttagtgtcccttttttttataatgaacttttatcgattttggttagttcgatgttgcggc
[0070]
ccctcgtcgatagatggcgctttaacgtcttgtcgctcgtgatcgacgtaaaatctcgaatcgc
[0071]
gatcaaaggatagcgaataaacgcaccaaaacgttcgataaagttaattatatagatcacgttt
[0072]
cgtgcgtcagggcgcggtgtgtccgtcagtccgtatatttagttccctacaatcgaatagcgtc
[0073]
gccagcctcccgaacgcggcgcggttatcgagaagccccttttaaaaagtacgcgataaaat
[0074]
tcgaatccgatcttagtagaattattctggatcggaacggcacgaaattataattattactatta
[0075]
atttataacaacataaaaaaaaaaacggggcagatcg
[0076]
bmgnβ1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no：2所示，具体如下：
[0077]
mneldslrqeaetlknairdarkaacdtslaqatsnlepigriqmrtrrtlrghlakiyamhwgsdsrnlvsasqdgklivwdshttnkvhaiplrsswvmtcayapsgsyvacggldnicsiyslktregnvrvsrelpghsgylsccrflddnqiltssgdmtcalwdietgqqcgqftghtgdvmslslapdqrtfvsgacdasaklwdvrdctckqtfpghesdinavtffpsgfafatgsddatcrmfdiradqelamyshdniicgitsvafsksgrlllagyddfncnvwdsmkseragilaghdnrvsclgvtengmavatgswdsflriwn
[0078]
实施例2bmgnβ1基因的时期、组织表达谱检测
[0079]
设计bmgnβ1基因的荧光定量特异引物，(正向引物5
’‑
gattccaggaacttggtgtc-3’(seq id no：9)，反向引物5
’‑
gagcagatgttgtccagtc-3’(seq id no：10))以bmgapdh为内参基因(正向引物5
’‑
cgattcaacattccagagca-3’(seq id no：11)，反向引物5
’‑
gaacaccatagcaagcacgac-3’(seq id no：12))实时荧光定量pcr方法检测该基因在by家蚕品种卵、幼虫、蛹和成虫四个变态发育时期和幼虫头、丝腺、气管、马氏管、表皮、脂肪体、中肠、血淋巴、性腺中的表达量。以各样品rna反转录成cdna为模板，每个样品3个技术重复，结果采用2-δδct
方法进行分析。反应体系为20ul体系，包括sybrpremixextaq10ul，forwardprimer(10μm)0.5ul，reverseprimer(10μm)0.5ul，dna模板(《100ng)1ul，ddh2o8ul。pcr扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
[0080]
结果如2所示，bmgnβ1基因在四个变态发育时期中均有表达，其中蛾期表达量最高，卵期表达量最低。bmnpv感染bmgnβ1基因在by品种各组织中表达均显著性下调表达(如图3所示)，表明bmgnβ1基因参与了bmnpv病毒和家蚕的互作。
[0081]
实施例3构建增量表达载体bmgnβ1-pizt/v5-his-mcherry
[0082]
为了研究bmgnβ1基因的功能，通过增量表达的方式来提高bmgnβ1基因的表达量，然后感染病毒，检测病毒增殖是否受到了抑制。根据所获得的bmgnβ1基因序列，与19-t载体连接，克隆转化，将阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序验证。根据天根生化科技(北京)有限公司高纯度质粒小提中量试剂盒说明书进行bmgnβ1-19-t质粒提取。将提取好的bmgnβ1-19-t质粒与pizt/v5-his-mcherry载体用kpnⅰ内切酶和xbaⅰ内切酶进行双酶切，体系如下：
[0083][0084]
然后放置37℃金属浴中酶切6小时进行胶回收，16℃过夜连接。将连接产物转入dh5α感受态细胞中，后进行阳性克隆筛选并进行质粒提取。提取的质粒按以下体系进行双酶切验证：
[0085][0086]
37℃金属浴中酶切反应4h，用1％凝胶电泳检测酶切产物，并送至上海生工生物工程有限公司进行测序验证正确，最终构建bmgnβ1-pizt/v5-his-mcherry重组质粒。
[0087]
实施例4检测增量表达bmgnβ1基因对bmnpv增殖的影响
[0088]
以构建好的增量表达转染载体，bmgnβ1-pizt/v5-his-mcherry(bmgnβ1-oe)转染到bmn细胞中，同时使用转染pizt/v5-his-mcherry空载体(control)作对照组，收集转染后24h、48h、72h细胞，经qrt-pcr检测bmgnβ1相对表达量(图4a)。
[0089]
将实验组bmgnβ1-oe和control分别转染到bmn细胞中，24h后向bmn细胞中添加含有bmnpv-egfp(107pfu/ml)的7μl培养液。在感染后24h、48h、72h用荧光显微镜观察bmnpv感染细胞情况，结果发现与对照组相比，增量表达bmgnβ1后的细胞中绿色荧光明显减少，表明bmnpv的增殖复制受到明显抑制(图4b、c)，其bmnpv含量仅为对照的25％。
[0090]
为了进一步检测bmnpv病毒基因的表达量，选择bmnpv病毒的衣壳基因vp39，设计特异性引物(正向引物5
’‑
cgattcaacattccagagca-3’(seq id no：13)，反向引物5
’‑
gaacaccatagcaagcacgac-3’(seq id no：14))，利用rt-qpcr技术检测vp39表达量来分析病毒的复制情况。结果发现，增量表达bmgnβ1后的实验组的bmnpv病毒基因vp39的表达量显著低于对照组，呈极显著水平(图4d)。也表明增量表达bmgnβ1后bmnpv的增殖复制受到了明显抑制。
[0091]
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.家蚕bmgnβ1基因在培育抗bmnpv家蚕品种中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因的编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。3.一种培育抗bmnpv家蚕品种的方法，其特征在于，所述的方法通过在家蚕中增量表达家蚕bmgnβ1基因实现，所述家蚕bmgnβ1基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。4.家蚕bmgnβ1基因在制备抗家蚕bmnpv药物中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因的编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。6.如权利要求1所述家蚕bmgnβ1基因的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：根据家蚕基因组序列设计bmgnβ1基因编码区特异性引物，以家蚕5龄起蚕的中肠组织cdna为模板进行编码区pcr扩增；用race试剂盒对家蚕bmgnβ1基因的5’race和3’race进行扩增；将这三个片段进行胶回收并克隆到pmd19-t载体，转化到大肠杆菌dh10b中，涂布平板并过夜培养，挑取阳性克隆，并进行菌液pcr进行鉴定。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述bmgnβ1基因编码区特异性引物序列如下：正向引物5
’‑
gctattagagatgcgaggaa-3’seq id no：3反向引物5
’‑
tggtcaggatctggttgt-3’seq id no：4。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述5’race和3’race的引物序列如下：5’race的5
’‑
外引物序列为gtcaggatctggttgtcgtcgaggaa，seq id no：5；5
’‑
内引物序列为tggccgacaccaagttcctggaatc，seq id no：6；3race的3
’‑
外引物序列为gcgacatcaacgcggtcacgttctt，seq id no：7；3
’‑
内引物序列为cgacaacatcatctgcggcatcacg，seq id no：8。

技术总结
本发明属于基因工程领域，具体涉及到BmGNβ1基因的应用。本发明提供了家蚕BmGNβ1基因在培育抗BmNPV家蚕品种中的应用。本发明还提供了家蚕BmGNβ1基因在制备抗家蚕BmNPV药物中的应用。本发明BmGNβ1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用生物信息学分析、RACE扩增方法，获得了家蚕BmGNβ1基因的全长cDNA序列。该基因能够被BmNPV病毒诱导性下调表达。增量表达BmGNβ1基因可以显著抑制BmNPV的增殖。BmGNβ1基因在家蚕抗病毒分子育种的研究和应用中具有重要的价值，可通过增量表达该基因来提高家蚕抗BmNPV能力。该基因来提高家蚕抗BmNPV能力。该基因来提高家蚕抗BmNPV能力。


技术研发人员：李刚 钱荷英 徐安英 于琳源
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/7/12