肾小管上皮细胞在替代角膜内皮细胞方面的应用

1.本发明属于医药领域，涉及肾小管上皮细胞在缓解或治疗角膜内皮功能失代偿方面的应用。
技术背景
2.角膜内皮细胞构成角膜组织的最内层，在维持角膜透明中发挥着至关重要的作用。成人角膜内皮细胞增殖能力有限，损伤后仅可通过周边细胞的扩大移行进行修复，当受到创伤、外伤、手术、药物或营养不良等因素影响时均可造成角膜内皮细胞的不可逆损伤，当角膜内皮细胞数量降至临界值（约400-500个/mm2）以下时将引起角膜内皮细胞功能失代偿，表现为进行性的角膜水肿、混浊，严重影响患者视觉质量。目前，角膜移植手术是临床上治疗角膜内皮细胞功能失代偿的最有效的手术方式，但由于全球范围内的角膜供体稀缺，角膜移植手术推广应用明显受限。
3.为了解决上述难题，通过构建组织工程角膜内皮替代供体角膜成为了目前研究的主流，具有重大的临床应用前景。种子细胞的选择作为该项技术的核心要素，现阶段主要的替代种子细胞包括培养的人原代角膜内皮细胞、成体干细胞、胚胎干细胞以及诱导多能干细胞来源的角膜内皮样细胞等，但是以上细胞移植效果有限。人原代角膜内皮细胞仍旧依赖于健康的供体角膜，且细胞无法在体外大量扩增，容易发生衰老与纤维化改变。角膜内皮样替代细胞来源广泛，但缺乏标准的定向分化方法，且细胞鉴定及纯化存在困难，其治疗的安全性及有效性亟需进一步研究。因此，截止目前，一直没有理想的角膜内皮替代种子细胞实现角膜长期透明且临床广泛应用。
4.基于角膜内皮细胞通过屏障功能与泵功能维持角膜透明，筛选体内具有屏障功能的异位“屏障”细胞是一种有潜力的筛选角膜内皮替代细胞的策略。肾小球是肾脏的基本结构和功能单位，其组成主要由毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜、上皮细胞组成滤过屏障。作为肾小球滤过屏障的一部分，肾小管上皮细胞滤过孔径为40nm,是滤过膜中最小的滤过孔径，维持滤过膜的电荷屏障，可产生胶原iv与氨基多糖，参与基底膜的修复。因此，肾小管上皮细胞具有替代角膜内皮细胞重建角膜内皮屏障，维持角膜透明的潜能。


技术实现要素：

5.本发明一方面，提供了肾小管上皮细胞用于角膜内皮替代细胞的应用；本发明另一方面，提供了肾小管上皮细胞在用于制备缓解或治疗角膜内皮损伤、角膜内皮病变、角膜内皮功能紊乱、角膜内皮细胞功能失代偿的药物或医疗器械方面的应用；进一步提供了肾小管上皮细胞在用于制备缓解或治疗角膜厚度异常、角膜透明度下降、角膜水肿、视力下降或丧失、眼睛干涩、疼痛的药物或医疗器械方面的应用。
6.本发明中，肾小管上皮细胞作为角膜内皮细胞的替代种子细胞。
7.可选地，肾小管上皮细胞选自肾小管上皮细胞系、原代肾小管上皮细胞或干细胞分化来源的肾小管上皮细胞。
8.本发明中，肾小管上皮细胞以有效剂量施用于角膜内皮细胞功能失代偿个体眼部，缓解或治疗角膜厚度异常、角膜透明度下降、角膜水肿、视力下降或丧失、眼睛干涩、疼痛的症状。
9.可选地，所述药物为细胞悬液或注射剂；所述医疗器械为细胞片、组织工程植片或试剂盒。本发明在施用前可由技术人员运用常规的方法配比，最终混合成为所需要的药物剂型。可以是滴丸、水悬溶液、水溶液、滴眼液、注射液、胶体、胶体溶液、纳米制剂、细胞片、组织工程植片或以其他形式的剂型用于人或动物。
10.可选地，肾小管上皮细胞以组织工程植片形式施用于患者眼部，所述植片厚度为50-200μm，植片上肾小管上皮细胞密度为500个/mm
2-2000个/mm2。
11.可选地，肾小管上皮细胞以细胞悬液注射形式施用于患者眼部，所述细胞悬液中肾小管上皮细胞数量为2
×ꢀ
104‑ꢀ8×ꢀ
105个。可选地，所述细胞悬液还包括dmem低糖培养基和y-27632。
12.本发明说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
13.在本发明中，术语“个体”或“患者”在此可互换地使用并且是指一种脊椎动物，优选一种哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。优选地，所述患者是人。这样的“个体”或“患者”典型地遭受或易于患有一种可以通过给予本发明的上述药物、医疗器械来预防或治疗的病症，包括但不限于如下角膜内皮损伤、角膜内皮病变、角膜内皮功能紊乱、角膜内皮细胞功能失代偿症状：角膜厚度异常、角膜透明度下降、角膜水肿、视力下降或丧失、眼睛干涩、疼痛等。
14.本发明中，术语“有效量”、
ꢀ“
有效剂量”是指向“个体”或“患者”赋予治疗或抑制作用（例如，控制、缓解、改善、缓和或减缓进展）；或预防（例如，延迟发作或降低发展风险）疾病、病症或病状或其症状的上述药物、医疗器械。对此用途有效的量将取决于例如递送的途径、所采用的具体的细胞数量或细胞活性、角膜内皮损伤的严重性、个体体重和总体健康状况、以及有经验者根据不同情况的建议。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期（例如数周至数月）或更长时间段（数月至数年）给予剂量单元。可以制成任何可使用的制剂剂型。
15.有益效果
16.本研究首次将肾小管上皮细胞引入作为替代角膜内皮的种子细胞；本发明提供的细胞悬液及其制备方法在保证细胞活力的同时，还可以有效替代角膜内皮功能恢复角膜透明度和角膜厚度，维持正常视觉功能。
附图说明
17.图1、（a）hk2细胞形态学表现；（b）hk2细胞免疫荧光染色。
18.图2、hk2细胞移植术后1 天、14天、30天裂隙灯眼前节照相及角膜oct图像。
19.图3、兔角膜内皮细胞机械刮除术后1天与14天裂隙灯眼前节照相。
20.图4、（a）兔角膜内皮细胞的形态；（b）兔角膜内皮细胞移植后1 天与14天的裂隙灯眼前节照相图像。
具体实施方式
21.下面进一步由解释本发明的以下实施例进行示例性说明，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。除非另有说明，本文所使用的技术和科学术语为本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
22.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过常规渠道采购可获得的常规产品。
23.材料来源：
24.肾小管上皮细胞：购买于宁波明舟生物科技有限公司。
25.新西兰白兔：购买于济南西岭角养殖繁育中心。
26.实施例1 人肾小管上皮细胞hk2治疗角膜内皮细胞功能失代偿
27.1、体外人肾小管上皮细胞系hk2细胞培养扩增
28.人肾小管上皮细胞系hk2细胞购买于宁波明舟生物科技有限公司，在包含10%胎牛血清（fbs）、1% 双抗（ps）的mem培养基培养扩增。
29.2、动物实验
30.采用20g软硅胶针头轻柔刮除实验新西兰白兔右眼角膜中央 φ7.0 mm范围内角膜内皮细胞，避免损伤后弹力层，建立兔角膜内皮细胞功能失代偿模型。hk2细胞（3x105细胞/只，细胞重悬于dmem低糖培养基、10μm y-27632混合液中）采用注射器（2ml）进行前房细胞注射，实验兔保持右侧卧位3小时，确保细胞贴附于角膜后弹力层表面。术后观察实验兔角膜水肿恢复情况。
31.3、结果
32.如图1所示，倒置相差显微镜下见肾小管上皮细胞hk2形态大小一致，呈规则多边形，细胞间连接紧密。细胞免疫荧光染色显示hk2细胞规律性表达功能性标志物zo1、atp1a1以及上皮标志物krt19。
33.如图2所示，当肾小管上皮细胞hk2细胞经前房注射后1天，角膜仍旧水肿且混浊，虹膜纹理不清晰；在术后14天，与未移植细胞的动物模型中央角膜持续浑浊相比（对比实施例1），接受肾小管上皮细胞移植的角膜已经完全恢复透明，且角膜厚度已恢复至正常角膜厚度，效果类似于兔自体角膜内皮细胞（对比实施例2）；在移植后30天，接受肾小管上皮细胞hk2移植的角膜持续维持正常角膜的透明度与厚度。证明，肾小管上皮细胞可以作为角膜内皮细胞替代物，移植后重建角膜内皮屏障，消除角膜水肿，长期维持正常角膜透明与厚度。
34.对比实施例1 未移植细胞的兔角膜内皮细胞功能失代偿持续维持中央角膜水肿
35.采用20g软硅胶针头轻柔刮除实验新西兰白兔右眼角膜中央 φ7.0 mm范围内角膜内皮细胞，避免损伤后弹力层，建立角膜内皮细胞功能失代偿模型，术后观察角膜修复情况。
36.如图3所示，兔角膜内皮细胞机械刮除术后1天，兔角膜中央即发生角膜水肿，角膜混浊，且虹膜与瞳孔不可见；术后14天角膜中央区仍旧显示局限性灰白色水肿，混浊，且中央瞳孔不清晰。提示，在不做任何处理条件下，刮除中央角膜内皮细胞，在术后14天内皮中央角膜持续水肿混浊，影响正常视功能。
37.对比实施例2 自体角膜内皮细胞移植治疗角膜内皮功能失代偿修复角膜水肿
38.1、兔原代角膜内皮细胞体外培养扩增
39.在显微镜下分离兔角膜后弹力层和角膜内皮细胞，在添加10 μm y-27632的dmem中培养过夜。用0.6u/ml的胶原酶i 消化角膜内皮细胞 1小时，并离心收集角膜内皮细胞，接种到完全培养基（dmem培养基、10% fbs、1% ps、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1%胰岛素-转铁蛋白、1μm sb431542和10μm y-27632）在37℃、5% co2下培养。
40.2、动物实验
41.采用20g软硅胶针头轻柔刮除实验新西兰白兔右眼角膜中央 φ7.0 mm范围内角膜内皮细胞，避免损伤后弹力层，建立兔角膜内皮细胞功能失代偿模型。将兔角膜内皮细胞（3x105细胞/只，细胞重悬于dmem低糖培养基、10μm y-27632混合液中）采用注射器（2ml）进行前房细胞注射，实验兔保持右侧卧位3小时，确保细胞贴附于角膜后弹力层表面。术后观察实验兔角膜水肿恢复情况。
42.3、结果
43.如图4a所示，倒置相差显微镜下见兔角膜内皮细胞形态大小一致，呈规则多边形，细胞间连接紧密。
44.如图4b所示，当兔角膜内皮细胞经前房注射后1天，中央角膜水肿、混浊，虹膜及瞳孔欠清晰；在移植后14天，角膜已经完全恢复透明，虹膜纹理清楚，角膜厚度已恢复至正常角膜厚度，恢复正常视觉功能。与文献报道一致，移植兔角膜内皮细胞可以重建角膜内皮功能，消除角膜水肿，恢复正常角膜透明度与角膜厚度。
45.以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

技术特征：
1.肾小管上皮细胞用于角膜内皮替代细胞的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，肾小管上皮细胞在制备用于缓解或治疗角膜内皮损伤、角膜内皮病变、角膜内皮功能紊乱、角膜内皮细胞功能失代偿的药物或医疗器械方面的应用。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，肾小管上皮细胞在制备用于缓解或治疗患有角膜内皮细胞功能失代偿患者角膜厚度异常、角膜透明度下降、角膜水肿、视力下降或丧失、眼睛干涩、疼痛的药物或医疗器械方面的应用。4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述肾小管上皮细胞选自肾小管上皮细胞系、原代肾小管上皮细胞以及干细胞诱导分化的肾小管上皮细胞。5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述肾小管上皮细胞以细胞悬液形式施用于患者眼部，所述细胞悬液中肾小管上皮细胞数量为2
×
10
4-8
×
105。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，细胞重悬于dmem低糖培养基、y-27632混合液中。7.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述肾小管上皮细胞以组织工程植片形式施用于患者眼部，所述植片厚度50μm-200μm，植片细胞密度500个细胞/mm
2-2000个细胞/mm2。8.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述个体为哺乳动物。9.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述个体为人、兔、鼠、猫或狗。10.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述药物或医疗器械为注射剂、细胞片或试剂盒。

技术总结
本发明公开了肾小管上皮细胞在用于制备缓解或治疗角膜内皮损伤、角膜内皮病变、角膜内皮功能紊乱、角膜内皮细胞功能失代偿的药物或医疗器械方面的应用，所述肾小管上皮细胞用于替代角膜内皮细胞可重建改善角膜内皮的屏障功能进而消除角膜水肿，降低角膜厚度，恢复视觉功能，为角膜内皮功能失代偿的临床治疗提供新的种子细胞与新的治疗策略。供新的种子细胞与新的治疗策略。


技术研发人员：周庆军 史伟云 董春晓 李宗义 段豪云
受保护的技术使用者：山东第一医科大学附属眼科研究所（山东省眼科研究所、山东第一医科大学附属青岛眼科医院）
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/7/12