一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑gRNA靶点快速筛选的方法

一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种无筛选标记基因的猕猴桃毛状根转化方法和基因编辑grna靶点快速筛选的方法。


背景技术：

2.猕猴桃具有高维生素c含量和均衡的营养成分，包括膳食纤维，各种矿物质和其他代谢物，风味独特且对健康有益的水果，食用猕猴桃可改善免疫、消化和代谢健康，甚至提供抗癌作用，深受消费者的青睐。鉴于猕猴桃丰富的物种资源和驯化潜力，对猕猴桃的基因组学、作用机制都进行了广泛的研究。
3.开发高效快速的转化识别系统无疑是加快勘探和物种改良的前提。实现这些目标的一种优化方法是根茎农杆菌介导的转化方法。现代生物技术的应用使猕猴桃品种改良、营养提升、抗逆抗病并延长货架期成为可能。应用基因工程技术手段对猕猴桃品种改良与定向培育，是当今研究的目标。农杆菌(agrobacterium)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，根癌农杆菌(a.tumefaciens)和发根农杆菌(a.rhizogenes)是较为常见两种农杆菌。农杆菌介导的遗传转化是一种天然的植物遗传转化体系，可将插入在经改造t-dna区的目的基因，借助农杆菌的侵染实现目的基因向植物基因组的转移和整合，进一步通过组织培养技术，得到转基因植物。现有最成熟、广泛用于猕猴桃遗传转化的为根癌农杆菌eha105介导的叶盘转化法，当农杆菌通过侵染猕猴桃叶盘伤口进入细胞后，ti质粒上的t-dna区脱离质粒整合到基因组，经过有抗性压力选择的愈伤组织诱导，与再生获得转基因猕猴桃植株，虽然转化稳定，但是周期较长，需要全程施加选择压力，阳性率不高，鉴定时间点较为滞后。因此，建立一个高效、快速鉴定的遗传转化体系对猕猴桃分子生物学研究、基因编辑探索与育种改良具有重要意义。
4.发根农杆菌k599介导的猕猴桃毛状根转化法，为另一种转化途径，由ri质粒上的t-dna脱离质粒而整合到植物基因组，获得转基因不定根或称毛状根，在此基础进行快速鉴定，或由转化出的毛状根进一步再生为植株。此外，现如今几乎所有的植物遗传转化中都要使用选择性标记基因诸如抗生素来筛选转化植株，这也成也公众消费者的安全性顾虑。
5.现有猕猴桃遗传转化的方法，需要经历从猕猴桃组织样品的预培养，共培养，低浓度抗生素到高浓度抗生素的筛选与再生，时间周期长，对培养基、激素与抗生素成本需求大，对操作的要求也较高。除此之外，现有技术转化出的再生植株，有转基因的外源筛选标记基因marker gene(hygr/kanr)的表达，而且由于从愈伤组织到再生植株的生根期的长周期跨度，对猕猴桃根系相关的研究极不友好。
6.鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于解决如何优化现有猕猴桃遗传转化与快速筛选基因编辑靶点
grna的方法，无需猕猴桃组织样品的从预培养，共培养，低浓度到高浓度抗生素的筛选与再生的长周期、高成本与高要求、低容错的操作，提供了一种无筛选标记基因的猕猴桃毛状根转化方法和基因编辑grna靶点快速筛选的方法，以极简的方法实现快速广泛的转基因研究与基因编辑筛选。
8.为了实现上述目的，本发明公开了一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.s1，目的基因表达载体与菌种准备
10.使用植物双元表达载体pcambia1300-35s::egfp和pbi121，以enhanced green fluorescent protein与β-glucuronidase报告基因作为目的基因，用于鉴定分析转化后的基因表达与效率；
11.s2，外植体培养与组培苗植物材料的准备
12.选择温室或自然界中健康的猕猴桃外植体茎段和叶片，用于猕猴桃无菌组培苗的再生，使用猕猴桃无菌组培苗，修剪切割或剪下附有叶片的下胚轴，即单个叶片、叶柄与下胚轴的部分即可，使用注射器针头对其造成伤口用于浸泡侵染；
13.s3，发根农杆菌k599侵染；
14.将培养、收集重悬后的k599侵染液置于摇床活化30分钟后，将用于侵染的叶片叶柄或有叶下胚轴组织，浸泡于k599侵染液体培养基中，使菌液接触组织伤口，轻柔摇晃或上下颠转10～12分钟；
15.s4，黑暗共培养；
16.将进行浸泡菌液后的组织样品移出并用无菌滤纸轻轻吸干样品附着的液体，转移到共培培养基上，置于组培室内黑暗条件下共培养2～3天；
17.s5，诱导毛状根
18.共培养结束后，将植物组织样品转移到毛状根诱导培养基中进行毛状根诱导，每隔2周更新一次新培养基，待毛状根从下胚轴与叶片伤口处出现；
19.s6，毛状根鉴定
20.将诱导出的毛状根剪下，每个独立毛状根为一个独立转化事件，根据不同目的进行化学染色，荧光观察，提取dna进行pcr测序分析或者western blot的鉴定，生物学重复》3；
21.s7，诱导再生
22.将鉴定阳性的转基因毛状根，剪成小段置于愈伤组织培养基上进行转基因的再生，不定芽从愈伤组织上出现后，再切下转移至再生苗生长培养基中进行培养；
23.s8，阳性苗鉴定与培养
24.对阳性再生苗进行取样，可选择进行如步骤s6操作一致的不同目的的鉴定方式进行鉴定。
25.所述步骤s2中外植体培养中使用的外植体培养基包括含维生素的ms培养基4.43g/l、蔗糖30g/l、iba0.1mg/l、植物凝胶2.5g/l，溶剂为双蒸水，ph为5.8。
26.所述步骤s3中侵染液体培养基包括含维生素的ms培养基2.215g/l、蔗糖20g/l、乙酰丁香酮100μm/l，溶剂为双蒸水，ph为5.6。
27.所述步骤s4中共培培养基包括含维生素的ms培养基2.215g/l、蔗糖30g/l、乙酰丁
香酮100μm/l、植物凝胶2.5g/l，溶剂为双蒸水，ph为5.8。
28.所述步骤s5中毛状根诱导培养基包括前两周毛状根诱导培养基和两周后毛状根诱导培养基，所述前两周毛状根诱导培养基包括含维生素的ms培养基4.43g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶2.5g/l、头孢噻肟300 400mg/l，溶剂为双蒸水，ph为5.8，所述两周后毛状根诱导培养基含维生素的ms培养基2.215g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶2.5g/l、头孢噻肟300-400mg/l，溶剂为双蒸水，ph为5.8。
29.所述步骤s5中毛状根诱导培养基中头孢噻肟浓度为400mg/l。
30.所述步骤s6中不同目的包括启动子活性的分析、荧光标记信号观察、目的基因表达检测和基因编辑验证。
31.与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明可在短期内以毛状根转化快速高效的表达外源基因与实现靶向基因的编辑，成本低，操作容易且阳性率高。以鉴定阳性的毛状根组织再生的植株，依然保持稳定的基因表达。
附图说明
32.图1为无筛选标记基因的猕猴桃快速遗传转化方法流程图；
33.图2为猕猴桃转化毛状根形态；
34.图3为转化毛状根gfp荧光信号与wb鉴定；
35.图4为转化毛状根gus染色；
36.图5为毛状根诱导再生与再生植株gus染色；
37.图6为应用于毛状根转化中的基因编辑序列的分析结果。
具体实施方式
38.以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
39.一、培养基配方
40.无筛选标记基因的猕猴桃快速遗传转化培养基包括：
41.1、外植体培养基。此培养基用于从外植体茎段上获得用于培育无菌组培苗和切割叶盘的无菌叶片。包含以下含量的各组分：含维生素的ms培养基4.43g/l，蔗糖30g/l，iba0.1mg/l，植物凝胶2.5g/l，溶剂为双蒸水，调整ph＝5.8。
42.与现有的外植体芽生长培养基相比,上述技术方案所提供的培养基中添加植物激素适宜，更快速稳定生长出对植物激素敏感的茎段外植体无菌叶片，更适合用于侵染或再生植株。
43.2、侵染液体培养基。此培养基用于悬浮与活化k599发根农杆菌和猕猴桃组织的浸泡侵染。包含以下含量的各组分：含维生素的ms培养基2.215g/l，蔗糖20g/l，乙酰丁香酮100μm/l，溶剂为双蒸水，调整ph＝5.6。
44.与现有的侵染液体培养基相比,上述技术方案所提供的液体侵染培养基中添加适宜浓度乙酰丁香酮，调整了适合菌活化的ph值，具有较好的侵染效果。
45.3、共培固体培养基。此培养基用于猕猴桃组织在浸泡侵染后，置于黑暗环境下的共培养。包含以下含量的各组分：含维生素的ms培养基2.215g/l，蔗糖30g/l，乙酰丁香酮100μm/l，植物凝胶2.5g/l，溶剂为双蒸水，调整ph＝5.8。
46.4、毛状根诱导培养基。此培养基用于共培养后的毛状根诱导培养基,分为前两周和两周后培养基，均不需要添加任何植物激素。前两周培养基各组分为：含维生素的ms培养基4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶2.5g/l，cefotaxime 300-400mg/l，溶剂为双蒸水，调整ph＝5.8。两周后培养基各组分为：含维生素的ms培养基2.215g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶2.5g/l，cefotaxime300-400mg/l，溶剂为双蒸水，调整ph＝5.8。为防止诱导过程中出现不必要的污染，可选择添加600μl/l植物组培抗菌剂ppm。
47.与现有的共培培养基与诱导培养基相比，上述所提供的培养基中无需添加植物激素与筛选标记的抗生素，添加适宜浓度的植物组培抗菌剂ppm可有效避免组培操作中的污染，在低成本和高容错情况下诱导毛状根。分为两步法的前两周ms培养基，在前期可有效去除菌污染，两周后的1/2ms培养基更适合诱导毛状根生长，使用植物凝胶代替琼脂粉使培养基透明更容易观察植物状态。
48.5、愈伤组织诱导与再生培养基。本技术提出的从愈伤组织诱导至再生芽的培养基，均使用同一培养基配方，无需更换组分与添加筛选抗性。包括以下含量的各组分：对于中华猕猴桃为，含维生素的ms培养基4.43g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶2.5g/l，玉米素zeatin 3.0mg/l,naa 0.1mg/l、植物组培抗菌剂ppm 600μl/l，cefotaxime 300-400mg/l，溶剂为双蒸水，调整ph＝5.8。对于毛花猕猴桃，含维生素的ms培养基4.43g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶2.5g/l，玉米素zeatin 2.0mg/l，6-ba3.0mg/l，naa0.1mg/l、植物组培抗菌剂ppm 600μl/l，cefotaxime300-400mg/l，溶剂为双蒸水，调整ph＝5.8。
49.与现有的诱导与再生培养基相比，上述的培养基中，在诱导愈伤组织与再生植株期间，未添加筛选标记的抗生素，适用于两种不同品种猕猴桃的适宜的植物分裂素与生长素的比例和浓度，具有更好的诱导愈伤组织和再分化作用。相比较之前的培养基，植物凝胶添加量提升有助于避免叶片在高浓度分裂素下的玻璃化。
50.以上方案培养基所使用ms来自phytotechnology公司m519(murashige&skoog(ms)basal medium w/vitamins)。植物凝胶为coolaber公司货号cp8581z-phytagel。植物组培抗菌剂ppm为coolaber公司货号ptc1000-plant preservative mixture(ppm)。
51.二、植物材料
52.用于侵染的猕猴桃组织可选择无菌组培苗中由附带有叶片叶柄的下胚轴和顶芽。用注射器造成伤口的节间和叶片更易于诱导毛状根，避免使用多次继代培养出现玻璃化与状态不佳的植物材料。
53.三、目的基因表达载体与菌种准备
54.使用植物双元表达载体pcambia1300-35s::egfp和pbi121，以egfp(enhanced green fluorescent protein)与gus(β-glucuronidase)报告基因作为目的基因，用于鉴定分析转化后的基因表达与效率。以植物双元表达载体pcambia1300-cas9载体进行靶向特定基因的基因编辑，用于检测与验证猕猴桃毛状根中的基因编辑。
55.四、外植体培养与组培苗植物材料的准备
56.为了萌发新生无菌苗和新生叶片材料，选择温室或自然界中健康的猕猴桃外植体茎段和叶片，洗刷修整，并在流动的水中冲洗半小时进行预清洁。
57.对于叶片，依次置于70％乙醇中约2分钟，无菌水清洗3次，2％naclo约4分钟，无菌水清洗3次，在无菌滤纸上吸干水，然后迅速转移在愈伤组织诱导与再生培养基上。用于不
经过外植体茎段萌发芽的叶片材料诱导与再生。
58.对于外植体，先将茎段修剪为5-7厘米长的段(至少有一个芽节点)，依次置于70％乙醇中2分钟，无菌水清洗3次，0.1％升汞2分钟，无菌水清洗3次。将消毒好的植物材料用无菌水充分清洗，修剪损伤部分后插入外植体培养基。4-5周后，将新生叶子切成～10x10毫米的叶片进行转化操作，或在愈伤组织和再生培养基上以培养无菌苗材料后进行转化。所有组培条件均在24℃
±
2，16小时光周期下进行。
59.五、载体准备
60.本方案设计使用egfp与gus报告基因作为目的基因，研究在发根农杆菌介导的毛状根内目的基因的表达。以pcambia1300载体为背景在mcs区域内插入camv35s::egfp-t表达阅读框，去除hygr筛选标记阅读框。在pbi121-camv35s::gus载体背景去除neor/kanr标记阅读框，构建marker-free转化载体。
61.基因编辑载体设计使用pcambia1300-ptg-camv35s-cas9系统对靶向目的基因的编辑。
62.六、发根农杆菌k599培养
63.采用所述已改造的载体质粒经过化学转化转入发根农杆菌菌株k599(菌株购自上海吐露港生物科技有限公司，此发根农杆菌菌株含有pri2659质粒，具有广泛的宿主范围，同时具有链霉素抗性)。
64.将k599感受态细胞从-80℃中取出，待融化成冰水混合物后，将质粒dna加入到感受态细胞中，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置10分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；随后加入400μl无抗生素的yeb液体培养基，于28℃摇床200rpm培养2小时，培养结束后吸取100μl左右菌液涂布于含50mg/l kana和50mg/l strep的双抗yeb平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。挑取单克隆菌落置于1ml双抗ybe培养基中小摇和鉴定，鉴定阳性菌落的菌液以1:100的比例加入双抗yeb在锥形瓶进行大摇。过夜培养，以紫外分光光度计测量菌液od600值，待锥形瓶中发根农杆菌菌液od600达到1.0-1.2后(约14小时)，将菌液离心去除yeb培养基，重悬于所述侵染液体培养基中洗涤菌液，离心去除洗涤yeb残留的液体，然后将菌重新重悬于侵染液体培养基中，调整悬浮侵染菌液至od600＝0.7(0.6-0.8均可)用于侵染。此步骤全程需在无菌操作台内进行，重悬后菌液可放置于100rpm摇床上活化片刻以等待植物侵染的准备工作。
65.七、侵染、黑暗共培养、诱导
66.将培养的无菌叶条，叶柄或有叶下胚轴(可选择用组培剪或者注射器针头制造伤口)，浸泡、重悬于k599侵染液体培养基中，轻柔摇晃或上下颠转10-12分钟，然后用无菌滤纸轻轻吸干样品附着的液体，转移到共培培养基上，置于黑暗条件下培养2-3天。共培养结束后，将植物组织样品转移到补充有400mg/l cefotaxime的毛状根诱导培养基中进行毛状根诱导。每隔2-3周更新一次新培养基，待毛状根出现。
67.此步骤中，适宜的od600的菌液和活化有助于提升侵染效率，农杆菌侵染浓度过高或侵染时间过长会导致植物材料伤口处细胞受到过大伤害而无法恢复，农杆菌浓度过低或侵染时长过短会导致侵染不充分。
68.侵染操作中，注意在用无菌滤纸吸附残余液体时，避免将组织样品暴露在长时间酒精灯前热风环境中。
69.在早期诱导中，如果不能有效抑制农杆菌，可以多次转移到新培养基中。诱导前期可选择使用ms无激素培养基，两周后使用1/2ms无激素培养基。此阶段的培养基不添加任何激素。
70.此外，组培剪或注射器针头给植物组织和叶片上造成的伤口可能会促进更多的毛状根诱导。
71.八、转化后的毛状根鉴定
72.将上一步骤转化诱导出的足够大小的毛状根进行鉴定，把野生型与随机选择的9个独立转化的gus转化系毛状根进行gus染色。真空负压20-30min，37℃静置染色过夜，然后分别以70％、80％和100％的乙醇进行脱色，分析报告基因表达、统计阳性率。
73.将egfp转化系毛状根置于激光共聚焦显微镜(fv1000 olympus)观察荧光信号，重验证使用western blot鉴定报告基因egfp的蛋白表达。
74.随机选择9个基因编辑的毛状根样品进行一步法dna提取与特异性引物pcr扩增，以pcr产物及其每个样品的产物纯化连接克隆载体进行8-12个单克隆测序，与野生型序列比对，分析靶向基因的序列编辑情况与基因型。
75.一步法提取毛状根样品dna，准备溶液edwards solution(200mm tris-hcl(ph 7.5),250mm nacl,25mm edta,and 0.5％ sds)与te buffer(10mm tris-hcl(ph 8)and 1mm edta)。使用te缓冲液将edwards溶液稀释10倍以获得提取缓冲液。将单个毛状根或3-5mg样品放入1.5ml ep管中，向试管中加入200μl提取缓冲液。用塑料棒将样品压在管壁上研磨，研磨结束后溶液可成功用于以下pcr反应(勿将样品采用液氮研磨使得研磨得过充分，否则将会提取失败)。
76.九、毛状根诱导再生与再生植株gus鉴定
77.将诱导步骤获取的gus转化系毛状根，整段或切割为小段置于愈伤组织组织诱导与再生培养基上，进行诱导再生gus转化系植株。此培养期间的培养基需添加高浓度的分裂素进行诱导，每隔3周进行更换一次新培养基保持营养供给。
78.将再生植株的新生叶片与芽进行gus染色鉴定。操作同上，真空抽负压20-30min，37℃静置染色过夜与三步脱色。
79.在此阶段的组织培养期间，培养基内激素组分可以保持不变，可选择添加植物组培抗菌剂ppm以避免不必要的污染。
80.发根农杆菌k599介导的毛状根转化法，优势在于由毛状根的产生到毛状根愈伤诱导与再生期间，全程无需抗性选择压力，转化周期短，且可实现无筛选标记基因筛选的遗传转化，植物表达载体准备时无需考虑与添加筛选标记，操作简便，节约成本，可以实现在毛状根中短期时间内的功能研究与基因编辑。
81.以去除t-dna区域内的hygr与kanr筛选标记的改造载体pcambia1300-35s::egfp与pbi121为例，仅将egfp或gus作为目的基因插入到植物基因组，在转化后通过荧光信号与化学染色进行鉴定分析。一方面，对荧光信号进行分析，与对照相比，k599介导的egfp转化毛状根的根部呈现出清晰的绿色荧光信号(图3)。以化学染色报告基因gus分析，经染色与完全脱色后，与对照相比，k599介导的gus毛状根呈现出靛蓝色的阳性表型，随机抽选的9株独立转化的毛状根中，gus转化阳性率77.78％(7/9)，其中42.86％高表达呈深靛蓝色(3/7)。野生型与阴性均无色(图4)。另一方面，应用毛状根转化的基因编辑，在9个独立转基因
毛状根中检测到了5个毛状根中的基因片段插入或缺失事件，成功验证了高效的靶向基因的染色体片段修饰(图6)。
82.进一步的，将阳性毛状根切成段或直接置于诱导愈伤组织培养基上诱导，进一步再生芽培养，将再生植株的组织叶片与芽进行化学染色，均呈现出gus成功表达的靛蓝色，表明gus从毛状根到诱导再生植株中的稳定表达(图5)。
83.由报告基因egfp与gus的稳定表达，以及基因编辑的高效性，表明我们通过发根农杆菌侵染转化途径的猕猴桃快速转化方法的可行性。
84.本技术提出的基于发根农杆菌k599介导的猕猴桃毛状根诱导的高效、快速遗传转化方法，与现有常用根癌农杆菌转化技术相比，实现了无选择标记基因参与的快速转化与基因编辑grna靶点快速筛选，本发明优化了此遗传转化期间的各步骤中的培养基组分、菌液参数与侵染材料处理和侵染操作细节，以达到缩短周期，在猕猴桃毛状根中实现广泛研究与快速筛选的目的，鉴定阳性的毛状根可用于进一步诱导与再生和培育，是一种理想的遗传转化方法。
85.以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，目的基因表达载体与菌种准备使用植物双元表达载体pcambia1300-35s::egfp和pbi121，以enhanced green fluorescent protein与β-glucuronidase报告基因作为目的基因，用于鉴定分析转化后的基因表达与效率；s2，外植体培养与组培苗植物材料的准备选择温室或自然界中健康的猕猴桃外植体茎段和叶片，用于猕猴桃无菌组培苗的再生，使用猕猴桃无菌组培苗，修剪切割或剪下附有叶片的下胚轴，即单个叶片、叶柄与下胚轴的部分即可，使用注射器针头对其造成伤口用于浸泡侵染；s3，发根农杆菌k599侵染；将培养、收集重悬后的k599侵染液置于摇床活化30分钟后，将用于侵染的叶片叶柄或有叶下胚轴组织，浸泡于k599侵染液体培养基中，使菌液接触组织伤口，轻柔摇晃或上下颠转10～12分钟；s4，黑暗共培养；将进行浸泡菌液后的组织样品移出并用无菌滤纸轻轻吸干样品附着的液体，转移到共培培养基上，置于组培室内黑暗条件下共培养2～3天；s5，诱导毛状根共培养结束后，将植物组织样品转移到毛状根诱导培养基中进行毛状根诱导，每隔2周更新一次新培养基，待毛状根从下胚轴与叶片伤口处出现；s6，毛状根鉴定将诱导出的毛状根剪下，每个独立毛状根为一个独立转化事件，根据不同目的进行化学染色，荧光观察，提取dna进行pcr测序分析或者western blot的鉴定，生物学重复>3；s7，诱导再生将鉴定阳性的转基因毛状根，剪成小段置于愈伤组织培养基上进行转基因的再生，不定芽从愈伤组织上出现后，再切下转移至再生苗生长培养基中进行培养；s8，阳性苗鉴定与培养对阳性再生苗进行取样，可选择进行如步骤s6操作一致的不同目的的鉴定方式进行鉴定。2.如权利要求1所述的一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法，其特征在于，所述步骤s2中外植体培养中使用的外植体培养基包括含维生素的ms培养基4.43g/l、蔗糖30g/l、iba0.1mg/l、植物凝胶2.5g/l，溶剂为双蒸水，ph为5.8。3.如权利要求1所述的一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法，其特征在于，所述步骤s3中侵染液体培养基包括含维生素的ms培养基2.215g/l、蔗糖20g/l、乙酰丁香酮100μm/l，溶剂为双蒸水，ph为5.6。4.如权利要求1所述的一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法，其特征在于，所述步骤s4中共培培养基包括含维生素的ms培养基2.215g/l、蔗糖30g/l、乙酰丁香酮100μm/l、植物凝胶2.5g/l，溶剂为双蒸水，ph为5.8。
5.如权利要求1所述的一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法，其特征在于，所述步骤s5中毛状根诱导培养基包括前两周毛状根诱导培养基和两周后毛状根诱导培养基，所述前两周毛状根诱导培养基包括含维生素的ms培养基4.43g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶2.5g/l、头孢噻肟300～400mg/l，溶剂为双蒸水，ph为5.8，所述两周后毛状根诱导培养基含维生素的ms培养基2.215g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶2.5g/l、头孢噻肟300～400mg/l，溶剂为双蒸水，ph为5.8。6.如权利要求1所述的一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法，其特征在于，所述步骤s5中毛状根诱导培养基中头孢噻肟浓度为400mg/l。7.如权利要求1所述的一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑grna靶点快速筛选的方法，其特征在于，所述步骤s6中不同目的包括启动子活性的分析、荧光标记信号观察、目的基因表达检测和基因编辑验证。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种无筛选标记的猕猴桃毛状根遗传转化与基因编辑gRNA靶点快速筛选的方法，实现了快速、低成本、无选择标记基因参与的转化与筛选，本发明优化了此遗传转化期间的各步骤中的培养基组分、菌液参数与侵染材料处理和侵染操作细节，以达到缩短周期，提供在猕猴桃毛状根中实现广泛研究与快速筛选的目的，鉴定阳性的毛状根可用于进一步诱导与再生和培育，是一种理想的遗传转化方法。的遗传转化方法。的遗传转化方法。


技术研发人员：汪松虎 李鹏伟 章忆玲 刘亚静 汪润泽
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/12