TaVRT-A2蛋白及其相关生物材料在调控植物种子蛋白质含量中的应用

tavrt-a2蛋白及其相关生物材料在调控植物种子蛋白质含量中的应用
技术领域
1.本发明涉及tavrt-a2蛋白及其相关生物材料在调控植物种子蛋白质含量中的应用。


背景技术：

2.普通小麦(triticum aestivum l.)是禾本科植物，在世界各地广泛种植。小麦作为人类的主食之一，主要由淀粉和蛋白质两大组分组成。磨成面粉后可制作面包、馒头、饼干和面条等食物，为人类提供各种蛋白质、矿物质以及维生素等物质。
3.近年来，现代农业日益发展，人们生活水平显著提升，对优质小麦的需求日益增加。淀粉和蛋白质共同决定着小麦营养品质、外观品质、蒸煮食用品质和加工品质等。高产和优质一直是育种研究的目标，但目前为止，产量和品质均提高的基因鲜有报道。因此，研究淀粉和蛋白质的遗传基础及其对小麦品质的影响，发掘产量和品质可以均提高的基因对小麦育种具有重要意义。
4.tavrt-a2对植物的生长发育具有重要的调控作用。前期发现tavrt-a2在调控小麦颖壳长度中有报道，可以增加颖壳长度的同时增加千粒重。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何调控或提高植物种子中蛋白质的含量。
6.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质和/或调控所述蛋白质编码基因表达的物质和/或调控所述蛋白质的含量的物质和/或调控所述蛋白质的活性的物质的下述任一种应用：
7.p1、在调控植物种子蛋白质含量中的应用，
8.p2、在提高植物种子蛋白质含量中的应用，
9.p3、在制备提高植物种子蛋白质含量的产品中的应用，
10.p4、在植物育种中的应用，
11.p5、在植物品质改良中的应用。
12.所述蛋白质可谓如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：
13.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
14.a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)衍生的或与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
15.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
16.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
17.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所
述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
18.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
19.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
20.上述应用中，所述蛋白质可来源于小麦。
21.上述应用中，所述植物可为下述任一种：
22.d1)单子叶植物，
23.d2)禾本目植物，
24.d3)禾本科植物，
25.d4)小麦属植物，
26.d5)小麦。
27.上文所述物质可为下述生物材料。
28.所述调控可为上调或增强或提高。
29.与上文所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用也属于本发明的保护范围的下述任一种应用：
30.q1、所述生物材料在调控植物种子蛋白质含量中的应用，
31.q2、所述生物材料在提高植物种子蛋白质含量中的应用，
32.q3、所述生物材料在制备提高植物种子蛋白质含量的产品中的应用，
33.q4、所述生物材料在植物育种中的应用，
34.q5、所述生物材料在植物改良中的应用。
35.上述应用中，所述生物材料可为下述任一种：
36.b1)编码上文所述蛋白质的核酸分子；
37.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
38.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
39.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
40.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
41.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；
42.b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官；
43.b8)促进或提高上文所述蛋白质的基因表达的核酸分子；
44.b9)含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
45.上述应用中，b1)所述核酸分子可为如下所示的所述蛋白质的编码基因：
46.b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的核苷酸的cdna分子或dna分子；
47.b2)核苷酸是序列表中序列2的cdna分子或dna分子，
48.b3)与b2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。
49.上述应用中，所述植物可为下述任一种：
50.d1)单子叶植物，
51.d2)禾本目植物，
52.d3)禾本科植物，
53.d4)小麦属植物，
54.d5)小麦。
55.上述生物材料中，b2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。
56.可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pwmb123、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。
57.上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
58.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种提高植物种子蛋白质含量的方法，所述方法可包括增强或提高目的植物中上文所述蛋白质的编码基因的表达量或/和调控所述蛋白质的含量的物质或/和上文所述蛋白质的活性，从而提高植物种子蛋白质的含量。
59.上述方法中，所述增强或提高目的植物中上文所述蛋白质的活性或/和上文中所述蛋白质的编码基因的表达量是通过将上文所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。
60.上述方法中，所述蛋白的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
61.1)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多
启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
62.2)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
63.3)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv,mcmv和amv)。
64.上述方法中，所述对逆境胁迫敏感植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
65.上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
66.上述方法中，所述植物和/或目的植物可为下述任一种：
67.d1)单子叶植物，
68.d2)禾本目植物，
69.d3)禾本科植物，
70.d4)小麦属植物，
71.d5)小麦。
72.上文所述的蛋白质和/或上文所述的生物材料也属于本发明的保护范围。
73.本发明通过对以津硬8号为背景，基因tavrt-a2序列有差异的近等基因系总蛋白质含量进行分析，发现了tavrt-a2的新功能，该基因表达量与籽粒蛋白质含量成正相关。
74.本发明的有益效果在于，本发明首次发现小麦长颖壳基因tavrt-a2及其编码蛋白在提高小麦蛋白质含量中的应用
75.本发明通过在植物中过表达tavrt-a2基因提高种子蛋白质含量，种子中蛋白质含量可提升1.0％-4.6％。
76.因此，tavrt-a2基因及其编码的蛋白可用于植物育种和品质改良。
附图说明
77.图1为本发明小麦长颖壳基因tavrt-a2近等基因系，利用近红外光谱仪测定小麦种子中蛋白质含量，nil
hapi
指nil-tavrt-a2
jy8
，nil
hapii
指nil-tavrt-a2
3962
。
78.图2为本发明实施例2中植物基因tavrt-a2的克隆载体的结构示意图。
79.图3为本发明实施例3中植物表达载体pwmb110的结构示意图。
80.图4为本发明实施例4中小麦转基因材料中tavrt-a2的表达量检测分析结果。“**”代表p＜0.01。
81.图5为本发明实施例4中近红外光谱仪测定的转基因材料小麦种子中蛋白质含量检测分析图。“**”代表p＜0.01。
具体实施方式
82.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
83.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
84.本发明试剂和材料的来源如下：
85.大肠杆菌trans1-t1 phage resistant：全式金公司，货号：cd501-03；
86.t载体：-blunt simple cloning kit，全式金公司，货号：cb111-01；
87.pwmb110载体：本实验室保存，相关文献：liu j,chen z,wang z,zhang z,xie x,wang z,chai l,song l,cheng x,feng m,wang x,liu y,hu z,xing j,su z,peng h,xin m,yao y,guo w,sun q,liu j,ni z.ectopic expression of vrt-a2 underlies the origin of triticum polonicum and triticum petropavlovskyi with long outer glumes and grains.mol plant.2021sep 6；14(9):1472-1488.
88.波兰小麦3962，津硬8号：本实验室保存，公众可以从中国农业大学获得，仅用于重复本发明。相关文献：ectopic expression of vrt-a2 underlies the origin of triticum polonicum and t.petropavlovskyi with long outer glume and grain.molecular plant,2021,14:1472-1488。
89.小麦材料“fielder”和中国春：本实验室保存，公众可以从中国农业大学获得，仅用于重复本发明。相关文献：小麦
‘
fielder’ω-醇溶蛋白基因及启动子的克隆与序列分析[j].中国农业大学学报,2020,25(07):1-9。
[0090]
实施例1、小麦长颖壳基因tavrt-a2的克隆
[0091]
前期工作中波兰小麦3962与津硬8号构建的近等基因系的比较显示：以波兰小麦3962为供体，津硬8号(jy8)为受体，构建近等基因系nil(tavrt-a2
3962
)和nil(tavrt-a2
jy8
)中，对该对近等基因系的蛋白质含量进行比较，结果如图1所示，nil-tavrt-a2
3962
的种子总蛋白含量(图1中的nil
hapii
代表)均显著高于nil-tavrt-a2
jy8
(图1中的nil
hapi
代表)。因此对小麦中tavrt-a2基因进行克隆和过表达转化，并进行表型分析。
[0092]
提取小麦材料“fielder”的基因组dna，分别利用正向引物5
’‑
atggcgcgggagaggcgggc-3’(序列表中序列3)和反向引物5
’‑
ttacttccaaggtaacgctag-3’(序列表中序列4)，以小麦的基因组dna为模板进行pcr扩增，克隆并测序获得小麦tavrt-a2基因，其cds序列如序列表中序列2所示；tavrt-a2蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
[0093]
序列1：
[0094]
marerrairriesaaarqvtfskrrrglfkkaeelavlcdadvalvvfsstgklsqfasssmneiidkysthsknlgksdqqpaidlnlehckydslneqlaeaslrlrhmrgeeldglsvgelqqmeknletglqrvlctkdrqfmqqisdlqhkgtqlaeenmrlknqmhevptastvavaeaenvvpedahssdsvmtavhsgssqdnddgsdislklalpwk。
[0095]
序列2：
harwood,w.a.(2021).an efficient agrobacterium-mediated transformation protocol for hexaploid and tetraploid wheat.curr.protoc.1:e58.)的小麦转化方法，将步骤1.1获得的重组农杆菌eha105/pwmb110-tavrt-a2转化小麦fielder获得tavrt-a2过表达转基因小麦，使用bar基因的检测引物(f：5
’‑
atttggagaggacacgctga-3’和r：5
’‑
gaaacccacgtcatgccag-3’)进行转基因植株的鉴定，获得tavrt-a2转基因t0代阳性过表达小麦3个株系。将t0代阳性转基因过表达小麦种植收获得到t1代转基因过表达小麦种子并进行种植，得到t1代单株，将t1代单株同样使用bar基因的检测引物进行pcr鉴定获得阳性t1代单株，收获t1代阳性单株种子，继续种植检测，获得3个t2代阳性转基因小麦纯合株系oe-tavrt-a2-#1、oe-tavrt-a2-#3和oe-tavrt-a2-#6。
[0109]
对tavrt-a2转基因t2代过表达小麦3个株系中tavrt-a2基因的表达量进行检测，实验设置三个重复。每个重复实验设置如下：提取3个转基因过表达株系和野生型植株(wt)小麦fielder的叶片总rna，反转录为cdna，采用real-time rt-pcr方法，以wheat-actin为内标基因，检测tavrt-a2基因的相对表达量。引物序列如下：
[0110]
qtavrt-a2-f：5
’‑
gttgtcgttttatgtctccg-3’；
[0111]
qtavrt-a2-r：5
’‑
cctgtctcagcgaattcact-3’；
[0112]
qwheat-actin-f：5
’‑
gaccgtatgagcaaggagat-3’；
[0113]
qwheat-actin-r：5
’‑
caatcgctggacctgactc-3’。
[0114]
检测结果如图4所示，转基因小麦oe-tavrt-a2-#1、oe-tavrt-a2-#3和oe-tavrt-a2-#6中tavrt-a2基因的表达量均显著(p＜0.01)高于野生型小麦fielder，说明tavrt-a2过量表达小麦株系构建成功。
[0115]
2.表型观察
[0116]
使用近红外光谱仪(波通da7250)测定3个tavrt-a2转基因过表达株系和野生型植株(wt)小麦fielder的成熟种子中总蛋白质的含量。
[0117]
测定结果如图5显示，转基因小麦oe-tavrt-a2-#1、oe-tavrt-a2-#3和oe-tavrt-a2-#6种子中总蛋白质的含量均显著(p＜0.01)高于野生型植株(wt)小麦fielder，提高1.0％-4.6％。
[0118]
因此，小麦长颖壳基因tavrt-a2过表达会导致小麦种子中蛋白质含量显著提高，小麦长颖壳基因及其相关蛋白tavrt-a2可以调控小麦种子蛋白质的含量，可应用于小麦育种和品种改良。
[0119]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.蛋白质和/或调控所述蛋白质编码基因表达的物质和/或调控所述蛋白质的含量的物质和/或调控所述蛋白质的活性的物质的下述任一种应用：p1、在调控植物种子蛋白质含量中的应用，p2、在提高植物种子蛋白质含量中的应用，p3、在制备提高植物种子蛋白质含量的产品中的应用，p4、在植物育种中的应用，p5、在植物品质改良中的应用；所述蛋白质是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)衍生的或与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于小麦。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：d1)单子叶植物，d2)禾本目植物，d3)禾本科植物，d4)小麦属植物，d5)小麦。4.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：q1、所述生物材料在调控植物种子蛋白质含量中的应用，q2、所述生物材料在提高植物种子蛋白质含量中的应用，q3、所述生物材料在制备提高植物种子蛋白质含量的产品中的应用，q4、所述生物材料在植物育种中的应用，q5、所述生物材料在植物改良中的应用，所述生物材料为下述b1)至b9)中的任一种：b1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官；b8)促进或提高权利要求1中所述蛋白质的基因表达的核酸分子；
b9)含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：b1)所述核酸分子为如下b1)、b2)或b3)所示的所述蛋白质的编码基因：b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的核苷酸的cdna分子或dna分子；b2)核苷酸是序列表中序列2的cdna分子或dna分子，b3)与b2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：d1)单子叶植物，d2)禾本目植物，d3)禾本科植物，d4)小麦属植物，d5)小麦。7.一种提高植物种子蛋白质含量的方法，包括增强或提高目的植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量或/和调控所述蛋白质的含量的物质或/和权利要求1中所述蛋白质的活性，从而提高植物种子蛋白质的含量。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述增强或提高目的植物中权利要求1中所述蛋白质的活性或/和权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量是通过将权利要求1中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述植物和/或目的植物为下述任一种：d1)单子叶植物，d2)禾本目植物，d3)禾本科植物，d4)小麦属植物，d5)小麦。10.权利要求1中所述的蛋白质和/或权利要求4或5中所述的生物材料。

技术总结
本发明公开了TaVRT-A2蛋白及其相关生物材料在调控植物种子蛋白质含量中的应用。本发明所要保护的一个技术方案是来源于小麦的蛋白质在调控或提高植物种子蛋白质含量中的应用，该蛋白质的名称为TaVRT-A2，其可为氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质。本发明从小麦中克隆了基因TaVRT-A2，并将其在小麦Fielder中过量表达，得到转TaVRT-A2基因过表达植株，经检测发现TaVRT-A2基因过表达可显著显著提高小麦种子中总蛋白质的含量，可提高1.0％-4.6％，因此，TaVRT-A2蛋白具有调控植物种子蛋白质含量的作用，可应用于植物育种或品质改良。良。


技术研发人员：倪中福 刘静 孙其信 刘杰 陈朝燕
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/7/12