一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法与流程

1.本发明属于分析领域，涉及一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法。


背景技术：

2.寡核苷酸是一类含有20个左右碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸dna或核糖核酸rna内的核苷酸)，寡核苷酸可以很容易地和它们的互补链以碱基配对的原理结合，以其独有的作用机理代表了一类全新的疾病治疗领域，是近十几年医药领域开发的热点。小核酸药物包括反义寡核苷酸aso、免疫刺激性寡核苷酸、核酶、mircornas、sirnas、核酸适配体和镜像寡核苷酸等等。
3.亚磷酰胺是合成小核酸原料药(寡核苷酸)的必需品，主要包括dna系列和rna系列以及他们的衍生物，符合质量要求的核苷单体及时供应是小核酸药物商业化的关键因素。原料药合成过程中的化学修饰技术和制剂工艺中的递送技术是小核酸药物成功最关键的因素。
4.因此，作为重要的亚磷酰胺单体纯度的高低直接影响着下游产品品质的好坏。
5.由于亚磷酰胺单体沸点高、难汽化，使用的气相色谱法无法实现检测其纯度的目的。且目前对亚磷酰胺纯度分析方法检测还未有相关文献报告。


技术实现要素：

6.针对现有亚磷酰胺纯度分析方法研究缺失，本发明目的在于提供一种亚磷酰胺单体高效液相色谱分析方法，本发明采用反相高效液相色谱法来分析，具有分析时间短，组分峰分离效果好、分辨率高、分析精度高、重现性好，操作简易等优点，达到对亚磷酰胺的质量进行有效的控制。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，所述亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法包括以下步骤：
9.1)配制样品溶液：称取样品置于容量瓶中，溶解后定容，得到样品溶液；
10.2)配制流动相a与流动相b，经微孔膜过滤，超声脱气后，采用反相高效液相色谱对样品溶液进行检测，检测亚磷酰胺纯度；
11.3)采用面积归一化法进行纯度结果计算。
12.作为本发明的一种优选方案，步骤1)中，所述样品溶液的浓度为0.5-1.0mg/ml，溶解所用溶剂为乙腈。
13.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，反相高效液相色谱使用waters primier高效液相色谱仪，配紫外检测器和全波长检测。
14.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，色谱柱为water acquily beh c18色谱柱，色谱柱规格为长度100mm，内径2.1mm，填料粒径为1.7μm。
15.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，流动相a为10mm乙酸铵水溶液，流动相b为
色谱级乙腈；
16.洗脱梯度为：0min，40％流动相a：60％流动相b；12min，10％流动相a：90％流动相b；12.1min，40％流动相a：60％流动相b；15min，40％流动相a：60％流动相b。
17.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，检测条件为：检测波长235nm；流速0.3ml/min；进样体积2μl；柱温30℃；进样盘温度10℃。
18.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，过滤所用的微孔膜为0.22μm。
19.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，超声脱气的时间为15min。
20.本发明采用以上技术方案，具有以下有益效果；
21.(1)本发明分析时间短，应用本发明所述的方法进行检测，从样品前处理到完成结果分析，只需要20分钟；
22.(2)组分峰分离效果好，理论板数高达30000，可以将样品中所含的组分完全分离。
23.(3)分辨率高，通过选择固定相和流动相的种类以及配比，可以达到最佳分离效果。
24.(4)分析精密度高。
25.(5)重现性好，误差小，分析结果稳定。
26.(6)操作简易，分析全部自动化，检测由仪器完成，无论有无实验基础，只要经过操作培训，即可进行操作。
27.(7)达到亚磷酰胺的质量进行有效控制目的，纯度检测结果。
附图说明
28.图1：dmt-da(bz)-ce-phosphoramidite分析样品检测所得结果。
29.图2：dmt-dt-ce-phosphoramidite分析样品检测所得结果。
30.图3：dmt-dc(bz)-ce-phosphoramidite分析样品检测所得结果。
31.图4：dmt-dg(ibu)-ce-phosphoramidite分析样品检测所得结果。
具体实施方式
32.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.本发明中，所用仪器包括：
34.(1)waters primier高效液相色谱仪，配紫外检测器和全波长检测；
35.(2)色谱柱water acquily beh c18(100
×
2.1mm,1.7μm)；
36.(3)超声波脱气装置。
37.本发明提供了一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，包括仪器选择、检测条件的设定、样品处理、检测；
38.使用本发明所述的检测方法，检测亚磷酰胺纯度，检测时间小于15分钟；
39.所述的检测条件的设定，洗脱梯度的体积比见表1；
40.表1.洗脱梯度
41.time(min)a％b％0406012109012.14060154060
42.流动相a为10mm nh4oac in h2o；流动相b为色谱级纯乙腈。
43.稀释剂/空白：乙腈。
44.检测条件设定，检测波长235nm；流速0.3ml/min；进样体积2μl。柱温30℃；进样盘温度10℃。
45.实施例1
46.本实施例提供的亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，包括：
47.样品处理：
48.1)准确称取6mg样品置于10ml容量瓶中，加入少量乙腈溶解后定容。
49.2)将配制好的流动相先经0.22μm膜过滤，然后超声脱气15分钟后，置于高效液相色谱仪上，脱气使用。
50.3)待出峰后，使用面积归一化法进行纯度结果计算。
51.参见附图，图1为dmt-da(bz)-ce-phosphoramidite分析样品检测所得结果，主峰分离度为4.1，理论板数高达40000；图2为dmt-dt-ce-phosphoramidite分析样品检测所得结果，主峰分离度为5.1，理论板数高达30000；图3为dmt-dc(bz)-ce-phosphoramidite分析样品检测所得结果，主峰分离度为5.4，理论板数高达40000；图4dmt-dg(ibu)-ce-phosphoramidite分析样品检测所得结果，主峰分离度为4.5，理论板数高达30000；可见本发明组分峰分离效果好，可以将样品中所含的组分完全分离。分辨率高，通过选择固定相和流动相的种类以及配比，可以达到最佳分离效果。
52.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，其特征在于，所述亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法包括以下步骤：1)配制样品溶液：称取样品置于容量瓶中，溶解后定容，得到样品溶液；2)配制流动相a与流动相b，经微孔膜过滤，超声脱气后，采用反相高效液相色谱对样品溶液进行检测，检测亚磷酰胺纯度；3)采用面积归一化法进行纯度结果计算。2.根据权利要求1所述的一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，其特征在于，步骤1)中，所述样品溶液的浓度为0.5-1.0mg/ml，溶解所用溶剂为乙腈。3.根据权利要求1所述的一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，其特征在于，步骤2)中，反相高效液相色谱使用waters primier高效液相色谱仪，配紫外检测器和全波长检测。4.根据权利要求1所述的一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，其特征在于，步骤2)中，色谱柱为water acquily beh c18色谱柱，色谱柱规格为长度100mm，内径2.1mm，填料粒径为1.7μm。5.根据权利要求1所述的一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，其特征在于，步骤2)中，流动相a为10mm乙酸铵水溶液，流动相b为色谱级乙腈；洗脱梯度为：0min，40％流动相a：60％流动相b；12min，10％流动相a：90％流动相b；12.1min，40％流动相a：60％流动相b；15min，40％流动相a：60％流动相b。6.根据权利要求1所述的一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，其特征在于，步骤2)中，检测条件为：检测波长235nm；流速0.3ml/min；进样体积2μl；柱温30℃；进样盘温度10℃。7.根据权利要求1所述的一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，其特征在于，步骤2)中，过滤所用的微孔膜为0.22μm。8.根据权利要求1所述的一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，其特征在于，步骤2)中，超声脱气的时间为15min。

技术总结
本发明公开了一种亚磷酰胺单体液相色谱快速分析方法，包括以下步骤：配制样品溶液：称取样品置于容量瓶中，溶解后定容，得到样品溶液；配制流动相A与流动相B，经微孔膜过滤，超声脱气后，采用反相高效液相色谱对样品溶液进行检测，检测亚磷酰胺纯度；采用面积归一化法进行纯度结果计算。本发明采用反相高效液相色谱法来分析，具有分析时间短，组分峰分离效果好、分辨率高、分析精度高、重现性好，操作简易等优点，达到对亚磷酰胺的质量进行有效的控制。达到对亚磷酰胺的质量进行有效的控制。达到对亚磷酰胺的质量进行有效的控制。


技术研发人员：侯丽强 刘婷 马燕 田小丽
受保护的技术使用者：杭州诺泰诺和生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.03.08
技术公布日：2023/7/12