脆弱拟杆菌防治乳糜泻的应用的制作方法

1.本发明涉及脆弱拟杆菌防治乳糜泻的应用技术，特别是一株脆弱拟杆菌zy-312在防治乳糜泻中的应用。


背景技术：

2.乳糜泻(celiac disease,cd)又称麸质敏感性肠病，是一种在儿童和成人中发生的累及小肠的慢性、多器官自身免疫性疾病，尤其是表达hla-dq2/-dq8基因的遗传易感个体。由摄入含麸质类食物促发，导致小肠黏膜萎缩，表现为以乳糜样腹泻为主要表现的一种肠道疾病。临床表现有慢性腹泻、腹部不适、体重下降、贫血，也可有肠外表现，如疱疹样皮炎、周围神经系统症状等。过去认为乳糜泻是一种罕见疾病。但随着近年来人们对乳糜泻认识的加深，高敏感性血清学筛查技术的引入，小肠活检的应用以及基因检测手段的发展，发现乳糜泻影响着全球约1％的人口，且有逐渐增长的趋势。
3.终生无麸质饮食(gluten free dietary，gfd)是目前唯一公认的有效治疗手段。大多数患者坚持无麸质饮食数天至数周后症状会逐渐缓解至消失，数周至数月后血清标志物检测也逐渐降至正常，肠道黏膜恢复相对比较缓慢，且组织学完全恢复正常十分少见。虽然gfd对患者来说利大于弊，但gfd在日常生活中很难避免，即使能够保证gfd，也有约60％乳糜泻患者小肠黏膜病理改善并不明显，肠道微生态无法完全恢复，肠道症状持续存在。此外，无麸质饮食也会造成营养不均衡，某些微量元素摄入不足，如铁、叶酸、维生素b1、维生素b12等。
4.尚无有效的药物方案，随着乳糜泻的免疫发病机制逐步被认识，一些新的治疗方法正在进行临床试验中。其中微生物疗法也是乳糜泻的一种新型疗法，近年来被广泛研究。麸质中的主要成分麦醇溶蛋白，由于不能被胃肠道中的消化酶所完全降解，生成一些富含谷氨酰胺和脯氨酸的肽段，触发肠道适应性免疫反应和固有免疫反应过度，损害肠黏膜结构导致发病。大量研究已证明，肠道微生物群可调节免疫，还能通过调节肠道上皮的紧密连接影响肠道通透性。例如，双歧杆菌能够降低由麸质刺激引发的肠上皮通透性增加，下调乳糜泻的th1通路从而减少炎症，减少空肠的组织学病损。
5.脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis，b.fragilis)为革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染、有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，分为产肠毒素型(etbf)和非产肠毒素型(ntbf)，是人及动物肠道正常菌群的一部分，正常寄居于人体呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜等。申请人研究团队从2012年开始探索并从健康婴儿粪便中分离脆弱拟杆菌b.fragilis(菌株zy-312)，已有研究证明，zy-312有保护肠黏膜和肠屏障、调节免疫的作用(fan h,chen z,lin r,et al.bacteroides fragilis strain zy-312defense against cronobacter sakazakii-induced necrotizing enterocolitis in vitro and in a neonatal rat model.msystems.2019；4(4):e00305-19.published 2019aug 6.)，在防治肠道疾病中有较大潜力。
6.本发明采用的脆弱拟杆菌zy-312不含bft基因，是非产毒菌株，急性毒性证实，该
菌株对正常小鼠和裸鼠均无致病性(wang y，deng h，li z，tan y，han y，wang x，du z，liu y，yang r，bai y，bi y，zhi f.safety evaluation of a novel strain of bacteroides fragilis.front microbiol.2017mar 17；8:435.)。根据专利zl201510459408.x和科技文献xu w，su p，zheng l，fan h，wang y，liu y，lin y，zhi f.in vivo imaging of a novel strain of bacteroides fragilis via metabolic labeling.front microbiol.2018oct 1；9:2298.的报道，该菌株对胃酸、胆盐有着较好的耐性，能够保证其在胃中的存活和有效定植。
7.尽管有研究显示肠道菌群在防治乳糜泻方面有巨大潜力，但还没有出现专为防治乳糜泻而开发的微生态制剂。因此，有必要探索脆弱拟杆菌防治乳糜泻的应用。


技术实现要素：

8.为克服现有技术中所存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种脆弱拟杆菌在制备预防和/或治疗乳糜泻的产品中的应用。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌，能够通过保护肠黏膜和肠屏障、调节免疫、减轻炎症，有效防治乳糜泻。
9.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种脆弱拟杆菌在制备预防和/或治疗乳糜泻的产品中的应用，所述脆弱拟杆菌是保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312。
11.在一些实施方案中，所述脆弱拟杆菌是活菌或灭活菌。
12.在一些实施方案中，所述灭活菌是形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌。
13.在一些实施方案中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造、修饰、减毒、化学处理或物理处理的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
14.在一些实施方案中，乳糜泻包括典型乳糜泻、非典型乳糜泻或无症状乳糜泻。
15.在一些实施方案中，所述产品为药物、食品、保健品或益生菌。
16.在一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
17.在一些实施方案中，所述药物的剂型为丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、管饲制剂、混悬剂、霜剂、喷雾剂、口服液、灌肠剂、膏剂或贴剂。
18.在一些实施方案中，所述药物的给药周期为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药。
19.在一些实施方案中，所述药物的给药方式是口服或灌肠。
20.在一些实施方案中，所述食品包括奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌或发酵谷类食品；所述食品还可以是动物食品，比如饲料等。
21.第二方面，本发明提供一种含有脆弱拟杆菌的组合物在制备治疗和/或预防乳糜泻的产品中的应用，所述脆弱拟杆菌是保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312。
22.在一些实施方案中，所述组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物或益生菌组合物。
23.在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
24.本发明的有益效果：
25.本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312，可通过保护肠黏膜和肠屏障、调节免疫、减轻炎症，有效防治乳糜泻。
附图说明
26.图1为本发明实施例1的脆弱拟杆菌zy-312的菌落特征图；
27.图2为本发明实施例1的脆弱拟杆菌zy-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图。
具体实施方式
28.本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2015年4月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏。分类命名：脆弱拟杆菌zy-312(bacteroides fragilis zy-312)，保藏编号cgmcc no.10685。脆弱拟杆菌zy-312由本发明申请单位自行分离获得，并且已经在授权专利保护(专利号201510459408.x)。
29.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
30.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，所有细胞购自atcc；所有细胞培养材料购自gibco；所有实验动物购自浙江维通利华实验动物技术有限公司；或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
31.除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本发明中的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
32.实施例1脆弱拟杆菌的发酵培养
33.将脆弱拟杆菌zy-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
34.菌落特征：脆弱拟杆菌zy-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm之间，参见图1。
35.显微镜下形态：脆弱拟杆菌zy-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
36.选取单个菌落接种于植物源蛋白胨液体培养基中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌zy-312菌泥。
37.实施例2脆弱拟杆菌活菌液的制备
38.1)将脆弱拟杆菌zy-312菌种分别划线接种于血平皿，37℃、厌氧培养48h。
39.菌落特征：脆弱拟杆菌zy-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm。
40.2)增菌：从步骤1)中选取单个菌落接种于tsb(胰蛋白胨大豆肉汤，含5％胎牛血
清)中进行增菌培养，所得菌液保存备用。
41.3)脆弱拟杆菌zy-312活菌液：将步骤1)制备的菌液，用麦氏比浊管做菌数测定，用生理盐水稀释至108cfu/ml和10
10
cfu/ml，保存备用。
42.4)按上述方法制备脆弱拟杆菌atcc25285活菌液10
10
cfu/ml，保存备用。
43.实施例3脆弱拟杆菌的灭活菌粉的制备
44.(1)取实施例1制得的脆弱拟杆菌发酵液进行离心处理，收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:(10～30)(m:v)比例加入生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心收集洗涤后的菌体。
45.(2)向步骤(1)所得菌体加入5％麦芽糊精+0.9％氯化钠混合成的赋形剂，按菌体：赋形剂＝1:(5～15)(m:m)比例进行添加，搅拌分散后在(70～100)
±
5℃热灭活(20～40)
±
5分钟，得灭活菌液。
46.(3)将步骤(2)所得的灭活菌液离心收集灭活菌泥。
47.(4)在步骤(3)收集的灭活菌泥中加入赋形剂使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液。
48.(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40
±
2℃预冻1～3小时后，-20
±
2℃预冻0.5～1h，最后-40
±
2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5
±
2℃和0
±
2℃)、解析干燥(35
±
2℃)制备成灭活菌粉，菌粉的菌数达到1
×
10
11
cell/g。
49.实验时，使用菌粉配制脆弱拟杆菌zy-312菌液1
×
108cell/ml和1
×
10
10
cell/ml、脆弱拟杆菌atcc25285菌液1
×
10
10
cell/ml。
50.实施例4脆弱拟杆菌在体外对麦醇溶蛋白诱导的caco-2细胞改变的药效实验
51.麸质中的主要成分是麦醇溶蛋白，不能被胃肠道中的消化酶所完全降解，生成一些富含谷氨酰胺和脯氨酸的肽段，触发肠道适应性免疫反应和固有免疫反应，诱导肠上皮细胞凋亡，细胞间紧密连接被破坏，导致肠屏障受损，肠通透性增加，表现为慢性腹泻与腹部不适的临床症状。本实验利用caco-2细胞体外模型，探究脆弱拟杆菌对麦醇溶蛋白诱导的细胞损伤、紧密连接蛋白表达下降的影响。
52.4.1实验设计及流程
53.4.1.1caco-2细胞的复苏和传代
54.caco-2细胞生长于含10％ fbs的dmem培养基中(完全培养基)，加入1％青霉素/链霉素，在37℃温度下，5％ co2、饱和湿度的培养箱中培养，每两天更换一次培养基。
55.a)液氮中取出细胞株，在37℃恒温水浴锅中迅速融化。无菌条件下打开冻存管，转移液体至15ml的离心管中，用完全培养基2-3ml重悬细胞，1000rpm，离心5min。弃上清后，加入完全培养基5ml，将细胞接种于培养瓶，37℃温度下，5％ co2浓度的培养箱培养48h。
56.b)弃去原培养液，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，消化5min，加入3ml完全培养基终止反应，并移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；弃上清液，加入适宜的完全培养基，将细胞分接于培养瓶，37℃温度下，5％ co2浓度的培养箱培养24h。
57.4.1.2脆弱拟杆菌对caco-2单层细胞跨膜电阻和紧密连接蛋白zo-1mrna的表达水平的影响
58.(1)caco-2单层细胞建立
59.将caco-2细胞按105/cm2的接种密度接种于24孔millicell小室中，培养10-15天。
期间使用millicell ers-2上皮跨膜细胞电阻仪(millipore corporate)测量单层细胞的电阻，当电阻值(transepithelial resistance，ter)达到600ω/cm2时，则认为单层细胞融合成功，可用于试验。
60.(2)实验分组
61.表1实验分组及给药
[0062][0063]
(3)实验方法
[0064]
在用麦醇溶蛋白和活菌药/灭活菌药处理之前，将汇合的单层细胞用pbs洗涤两次，并在含有10％ fbs和2mm谷氨酰胺但不含抗生素的dmem培养基中孵育过夜。
[0065]
①
按照上述分组在细胞小室上层分别加入相应的样品孵育，孵育6小时后立即测量ter，每个组别做三个复孔。
[0066]
②
按照上述分组在细胞小室上层分别加入相应的样品孵育，孵育24小时后收集细胞，使用qpcr方法测定紧密连接蛋白zo-1的mrna表达水平，每个组别做三个复孔。
[0067]
(4)检测项目与方法
[0068]
caco-2细胞跨膜电阻：caco-2细胞单层的完整性使用电阻仪ers测量跨膜电阻值(teer)评估,大于600ω/cm即可视为细胞融合成功。teer值越高,表示细胞完整性越高，细胞层越致密。
[0069]
紧密连接蛋白zo-1mrna表达水平：使用qpcr方法测定，反应肠屏障功能。
[0070]
数据统计与分析：使用spss统计软件25.0进行统计学分析。
[0071]
4.2实验结果
[0072]
4.2.1跨膜电阻
[0073]
表2.脆弱拟杆菌对caco-2细胞跨膜电阻的影响(mean
±
sd，n＝3)
[0074][0075]
注：“**”表示与模型组比较，p《0.01；“***”表示与模型组比较，p《0.001；“##”表示与标准株活菌组比较，p《0.01；“###”表示与模型组比较，p《0.001；“++”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.01。
[0076]
给予药物孵育前后的细胞跨膜电阻值如表2所示，与空白对照组相比，模型组麦醇溶蛋白处理后跨膜电阻值下降，表示细胞受损。与模型组比较，zy-312各处理组的跨膜电阻均显著升高，有统计学差异，而atcc25285标准株组的跨膜电阻与模型组比较无统计学差异。与标准株活菌组比较，zy-312各活菌组的跨膜电阻均显著升高，有统计学差异；与标准株灭活菌组比较，zy-312各灭活菌组的跨膜电阻均显著升高，有统计学差异。上述结果表明脆弱拟杆菌，特别是脆弱拟杆菌zy-312可以恢复由麦醇溶蛋白诱导的跨膜电阻值降低，具有细胞保护作用。
[0077]
4.2.2紧密连接蛋白zo-1mrna表达水平
[0078]
表3.脆弱拟杆菌对zo-1mrna表达水平的影响(mean
±
sd，n＝3)
[0079][0080][0081]
注：“**”表示与模型组比较，p《0.01；“***”表示与模型组比较，p《0.001；“##”表示与标准株活菌组比较，p《0.01；“++”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.01。
[0082]
脆弱拟杆菌zy-312对caco-2细胞紧密连接蛋白zo-1mrna的表达水平如表3所示，caco-2细胞在给予麦醇溶蛋白处理后(模型组)，zo-1的表达降低，与空白对照组比较有显著差异。麦醇溶蛋白与zy-312共同孵育caco-2细胞24h后，zo-1mrna的表达上调，与模型组比较有显著差异，而标准株atcc25285的zo-1mrna的表达量与模型组比较无统计学差异。与标准株活菌组相比，zy-312各活菌组zo-1mrna的表达上调，有统计学差异；与标准株灭活菌组相比，zy-312各灭活菌组zo-1mrna的表达上调，有统计学差异。
[0083]
脆弱拟杆菌活菌组或灭活菌组均能有效改善麦醇溶蛋白处理的肠细胞跨膜电阻值，相比模型组，细胞的完整性较高，说明脆弱拟杆菌活菌和灭活菌有细胞保护作用；脆弱拟杆菌活菌和灭活菌能够上调紧密蛋白zo-1的表达，能够减少麦醇溶蛋白造成的肠屏障受损。上述结果提示脆弱拟杆菌zy-312具有较好的治疗乳糜泻的作用。
[0084]
实施例5脆弱拟杆菌在体内对麦醇溶蛋白诱导的乳糜泻的药效实验
[0085]
麦醇溶蛋白诱导免疫反应在乳糜泻的发病中非常重要，包括抗组织转谷氨酰胺酶(ttg)抗体增加，ifnγ、il-15等促炎因子表达增加，导致肠道组织的炎症增加，造成肠上皮凋亡，病理上表现为绒毛萎缩、隐窝增生；紧密连接蛋白表达下降，表现为肠道通透性增加。
[0086]
5.1实验设计及流程
[0087]
5.1.1动物模型的建立及实验方法
[0088]
本实验使用的是诱发性动物模型，共64只雌雄各半的新生wistar大鼠，其中8只正常饲养，将另外56只在出生后第0、3、20天采用麦醇溶蛋白(5mg/次/只)灌胃结合腹腔注射ifnγ(1000u)的方法，建立乳糜泻大鼠模型后分组，次日开始各组给药，具体分组及给药方法见表4，再进行后续实验。
[0089]
随后将大鼠平均分至各小组，用药期间继续每天麦醇溶蛋白灌胃1次，5mg/次/只。
[0090]
5.1.2实验分组及给药
[0091]
表4实验分组及给药
[0092][0093]
大鼠出生后第20天麦醇溶蛋白灌胃结合腹腔注射ifnγ处理后分组，次日开始各组的给药，给药方法为灌胃，每日2次，共给药2周，再进行后续实验。
[0094]
5.1.3检测项目与方法
[0095]
游离谷氨酰胺与脯氨酸：大鼠完成给药后处死，取肠内容物0.5g，肠内容物的处理方法为，取供试品1g，加入5ml水，置匀浆机匀浆，10000r/min离心5min，过滤；取1.5ml滤液，加0.5ml 10％三氯乙酸溶液，涡旋，10000r/min离心5min；取上清液500μl，加入500μl异硫氰酸苯酯衍生剂，混匀后室温放置30min；加入正己烷1ml，涡旋，静置分层，取下层液体，过0.22μm滤膜，制成样品。样品使用高效液相色谱-二极管阵列检测器(hplc-dad)上机分别检
测游离谷氨酰胺与脯氨酸含量。
[0096]
小肠绒毛长度：将大鼠处死后取十二指肠制作he切片，等倍数显微镜下测量和计算肠绒毛长度和隐窝深度的比值。
[0097]
肠道通透性检测：使用荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran，fitc-葡聚糖4000；sigma)进行小鼠肠道通透性测定。在小鼠处死前4小时口服给予小鼠fitc-葡聚糖(44mg/100g)。治疗结束时，麻醉小鼠，通过心脏穿刺收集血液于肝素化的离心管中，以12000
×
g离心10分钟。用等体积的ph 7.4的pbs稀释每个血浆，并通过连续稀释的fitc-葡聚糖储备溶液(0ng/ml；125ng/ml；250ng/ml；500ng/ml；1000ng/ml；2000ng/ml；4000ng/ml；8000ng/ml)制作标准曲线。然后，将100μl每个稀释的血浆转移到96孔板中。使用spark多模酶标仪检测荧光(485nm ex；528nm em)，并使用标准曲线计算每个样品的fitc-葡聚糖浓度。
[0098]
小肠组织中occludin的mrna表达水平：occludin作为紧密连接的重要组成部分，对肠屏障通透性非常重要，采用trizol法来提取小鼠十二指肠中的总rna，使用super scriptⅱ逆转录酶进行逆转录得到cdna，以cdna为模板，使用qpcr检测occludin mrna的表达水平。
[0099]
血清抗组织转谷氨酰胺酶(ttg)抗体：使用elisa检测血清特异性ttg-iga抗体，ttg抗体导致的自身免疫反应是导致乳糜泻发病的因素之一。
[0100]
小肠炎性因子ifnγ、il-15mrna的表达水平：采用trizol法来提取小鼠十二指肠中的总rna，使用super scriptⅱ逆转录酶进行逆转录得到cdna，以cdna为模板，使用qpcr检测ifnγ、il-15mrna的表达水平。
[0101]
数据统计与分析：使用spss统计软件25.0进行统计学分析。
[0102]
5.2实验结果
[0103]
5.2.1肠内容物中游离谷氨酰胺与脯氨酸含量
[0104]
表5.游离谷氨酰胺与脯氨酸含量(mean
±
sd，n＝8)
[0105][0106][0107]
注：“**”表示与模型组比较，p《0.01；“***”表示与模型组比较，p《0.001；“##”表示与标准株活菌组比较，p《0.01；“###”表示与模型组比较，p《0.001；“++”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.01；“+++”表示与标准株灭活菌比较，p《0.001。
[0108]
麦醇溶蛋白在胃肠道中被降解为不易消化的富含谷氨酰胺和脯氨酸的肽段，是引起乳糜泻的发病的因素之一。正常对照组未给予麦醇溶蛋白，模型组给予麦醇溶蛋白后，肠
内容物中游离谷氨酰胺与脯氨酸含量有一定程度的提高，说明部分麦醇溶蛋白可被消化分解为游离氨基酸；与模型组相比，zy-312各处理组的肠内容物中谷氨酰胺与脯氨酸含量均升高(p＜0.001)，说明zy-312有助于帮助分解不易消化的肽段为可吸收的游离氨基酸，减少肽段对胃肠道的刺激，从而减轻乳糜泻严重程度。与标准株活菌组相比，zy-312各活菌组的肠内容物中谷氨酰胺与脯氨酸含量均升高，有统计学差异；与标准株灭活菌组相比，zy-312各灭活菌组的肠内容物中谷氨酰胺与脯氨酸含量均升高，有统计学差异。5.2.2小肠绒毛长度和隐窝深度的比值(v:c)
[0109]
表6.脆弱拟杆菌对大鼠肠道通透性的检测结果(mean
±
sd，n＝8)
[0110][0111]
注：“*”表示与模型组比较，p《0.05；“**”表示与模型组比较，p《0.01；“***”表示与模型组比较，p《0.001；“#”表示与标准株活菌组比较，p《0.05；“##”表示与标准株活菌组比较，p《0.01；“++”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.01。
[0112]
与正常对照组相比，模型组的小肠绒毛长度和隐窝深度的比值降低，说明绒毛长度缩短和/或隐窝加深，符合乳糜泻的绒毛萎缩，隐窝增生的病理表现。脆弱拟杆菌活菌和灭活菌各组均可改善大鼠的肠绒毛状态，使肠绒毛恢复到正常的长度，肠绒毛长度和隐窝深度的比值恢复正常。特别是脆弱拟杆菌zy-312具有更好的治疗乳糜泻的潜力。zy-312各活菌组与标准株活菌组相比，肠绒毛长度和隐窝深度的比值升高，有统计学差异；zy-312各灭活菌组与标准株灭活菌组相比，肠绒毛长度和隐窝深度的比值升高，有统计学差异；说明相比标准株，zy-312使肠绒毛恢复得更好。
[0113]
5.2.3肠道通透性检测
[0114]
表7.脆弱拟杆菌对大鼠肠道通透性的检测结果(mean
±
sd，n＝8)
[0115]
[0116]
注：“*”表示与模型组比较，p《0.05；“***”表示与模型组比较，p《0.001；“#”表示与标准株活菌组比较，p《0.05；“##”表示与标准株活菌组比较，p《0.01；“++”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.01；“+++”表示与标准株灭活菌比较，p《0.001。
[0117]
血浆中fitc-葡聚糖的浓度越高，说明小鼠的肠道通透性越高，肠屏障受损程度越大。与正常饲养的正常对照组比较，模型组血浆中的fitc-葡聚糖的浓度明显升高，说明ifnγ+麦醇溶蛋白破坏了小鼠的肠屏障。药物治疗后，与模型组比较，脆弱拟杆菌zy-312各组均降低了血浆中fitc-葡聚糖的浓度，与模型组比较有统计学差异。zy-312的活菌/灭活菌均可有效改善ifnγ+麦醇溶蛋白诱导的肠屏障通透性增强。与标准株活菌组相比，zy-312各活菌组的血浆中fitc-葡聚糖的浓度更低，有统计学差异；与标准株灭活菌组相比，zy-312各灭活菌组的血浆中fitc-葡聚糖的浓度更低，有统计学差异。说明与标准株相比，zy-312的活菌/灭活菌对改善ifnγ+麦醇溶蛋白诱导的肠屏障通透性效果更佳。
[0118]
5.2.4小肠组织中occludin的mrna表达水平
[0119]
表8.脆弱拟杆菌对小肠组织中occludin的mrna表达水平的影响(mean
±
sd，n＝8)
[0120][0121]
注：“***”表示与模型组比较，p《0.001；“##”表示与标准株活菌组比较，p《0.01；“+”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.05；“++”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.01。
[0122]
occludin是紧密连接相关蛋白中最具有代表性的蛋白之一，它封闭细胞旁路，形成紧密连接的基础结构。与正常对照组相比，模型组occludin mrna表达下降。与模型组比较，zy-312各组的occludin mrna均显著升高，有统计学差异，而atcc25285标准株组的occludin mrna与模型组无统计学差异。上述结果表明脆弱拟杆菌，特别是脆弱拟杆菌zy-312可以改善ifnγ-麦醇溶蛋白诱导的occludin表达下降，对肠屏障有保护作用。与标准株活菌组相比，zy-312各活菌组的occludin mrna均显著升高，有统计学差异；与标准株灭活菌组相比，zy-312各灭活菌组的occludin mrna均显著升高，有统计学差异。说明与标准株相比，zy-312的活菌/灭活菌上调occludin mrna效果更佳。
[0123]
5.2.5血清ttg-iga抗体
[0124]
表9.脆弱拟杆菌对乳糜泻大鼠的血清ttg抗体水平的影响(mean
±
sd，n＝8)
[0125]
[0126][0127]
注：“**”表示与模型组比较，p《0.01；“***”表示与模型组比较，p《0.001；“##”表示与标准株活菌组比较，p《0.01；“###”表示与模型组比较，p《0.001；“++”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.01；“+++”表示与标准株灭活菌比较，p《0.001。
[0128]
ttg-iga抗体的产生会导致自身免疫反应，促进乳糜泻的发生。与正常对照组相比，模型组血清ttg-iga抗体升高。与模型组比较，zy-312各组的血清ttg-iga抗体均显著降低，有统计学差异。上述结果表明脆弱拟杆菌，特别是脆弱拟杆菌zy-312可以改善ifnγ-麦醇溶蛋白诱导的血清ttg-iga抗体升高，具有调节免疫的作用。与标准株活菌组相比，zy-312各活菌组的血清ttg-iga抗体均显著降低，有统计学差异；与标准株灭活菌组相比，zy-312各灭活菌组的血清ttg-iga抗体均显著降低，有统计学差异。说明与标准株相比，zy-312的活菌/灭活菌下调血清ttg-iga抗体均显著降低效果更佳。
[0129]
5.2.6小肠炎性因子ifnγ、il-15mrna的表达水平
[0130]
表10.脆弱拟杆菌对小肠炎性因子表达水平的影响(mean
±
sd，n＝8)
[0131][0132]
注：“**”表示与模型组比较，p《0.01；“***”表示与模型组比较，p《0.001；“#”表示与标准株活菌组比较，p《0.05；“##”表示与标准株活菌组比较，p《0.01；“+”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.05；“++”表示与标准株灭活菌组比较，p《0.01。
[0133][0134]
ifnγ、il-15是促炎因子，与乳糜泻的发病密切相关。与空白对照组相比，模型组血清ifnγ、il-15mrna表达升高。与模型组比较，zy-312各组的ifnγ、il-15mrna表达均显著降低，有统计学差异，而atcc25285标准株组的ifnγ、il-15mrna表达与模型组比较无统计学差异。上述结果表明，各剂量zy-312活菌/灭活菌可以明显改善ifnγ-麦醇溶蛋白诱导的ifnγ、il-15mrna表达升高，具有调节免疫的作用。与标准株活菌组相比，zy-312各活菌组明显下调了ifnγ、il-15mrna表达，有统计学差异；与标准株灭活菌组相比，zy-312各灭
活菌组明显下调了ifnγ、il-15mrna表达，有统计学差异。说明与标准株相比，zy-312的活菌/灭活菌改善ifnγ-麦醇溶蛋白诱导的ifnγ、il-15mrna表达升高的效果更佳。
[0135]
上述结果表明，脆弱拟杆菌能改善ifnγ-麦醇溶蛋白诱导的小肠绒毛萎缩，使肠道通透性升高、紧密连接蛋白occludin的表达下降，对肠屏障有保护作用，使血清ttg-iga抗体水平下降，小肠炎性因子ifnγ、il-15的表达降低，有调节免疫、抗炎的作用，在治疗乳糜泻方面具有较好的潜力。
[0136]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种脆弱拟杆菌在制备预防和/或治疗乳糜泻的产品中的应用，所述脆弱拟杆菌是保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是活菌或灭活菌；所述灭活菌是形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造、修饰、减毒、化学处理或物理处理的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。4.根据权利要求1-3任一项中所述的应用，其特征在于，所述乳糜泻包括典型乳糜泻、非典型乳糜泻或无症状乳糜泻。5.根据权利要求1-4任一项中所述的应用，其特征在于，所述产品为药物、食品、保健品或益生菌。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料；和/或，所述药物的剂型为丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、管饲制剂、混悬剂、霜剂、喷雾剂、口服液、灌肠剂、膏剂或贴剂；和/或，所述药物的给药周期为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药；和/或，所述药物的给药方式是口服或灌肠。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食品包括奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌或发酵谷类食品；所述食品还可以是动物食品，比如饲料等。8.一种含有脆弱拟杆菌的组合物在制备治疗和/或预防乳糜泻的产品中的应用，所述脆弱拟杆菌是保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物或益生菌组合物。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。

技术总结
本发明公开了脆弱拟杆菌在制备预防和/或治疗乳糜泻的产品中的应用，以及治疗和/或预防乳糜泻的含有脆弱拟杆菌的组合物。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，能够通过增加紧密连接相关蛋白的表达，改善肠屏障通透性，下调TTG-IgA抗体和促炎因子IFNγ、IL-15，减轻炎症，有效防治乳糜泻。有效防治乳糜泻。有效防治乳糜泻。


技术研发人员：王晔 黄铄雅 王薇 李平 常磊 吴嘉棋 李永霞
受保护的技术使用者：广州知易生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/7/12