预苯酸脱氢酶SaPD及其编码基因和应用

预苯酸脱氢酶sapd及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉预苯酸脱氢酶sapd及其编码基因和应用。


背景技术：

2.l-酪氨酸是一种芳香族氨基酸，是生物体重要的条件必需氨基酸，对人和动物的生长发育和新陈代谢起重要的作用，是婴幼儿和苯丙酮尿症患者重要的外源营养补充剂，广泛应用于食品、饲料行业。在医药领域，l-酪氨酸可以改善记忆力，抵抗抑郁和焦虑，是帕金森氏病药物3,4-二羟基-l-苯丙氨酸(l-dopa)的重要前体，也是合成l-多巴、甲状腺素、肾上腺素、酪氨酸亚硫酸盐等高附加值药物的前体。在化工行业中，l-酪氨酸是对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等产品的制备原料。
3.传统的l-酪氨酸生产主要有化学法、蛋白质水解法、酶法和发酵法。蛋白质水解法存在材料来源受限、工艺和产品复杂、周期长等缺点，已被淘汰。化学法过程繁杂、产物转化率低、环境污染重，尤其是只能合成d、l-型外消旋体，受到了严重制约。
4.微生物发酵法是当前l-酪氨酸主要方法。在微生物体内合成l-酪氨酸的代谢通路中，分支酸作为l-酪氨酸、l-色氨酸和l-苯丙氨酸合成的分支点，三种芳香氨基酸竞争底物。为了提高l-酪氨酸的生产效率，往往要修饰和优化微生物代谢网络和表达调控网络。因此，生产菌株往往要经过诱变处理或代谢工程改造。发酵法生产l-酪氨酸工艺控制也比较复杂，需要满足微生物自身生长和产物积累的双重要求。
5.生物酶催化专一性强、反应条件温和、条件容易控制，为l-酪氨酸的廉价、高效生产提供了重要的思路，受到越来越多的重视。预苯酸脱氢酶能够催化预苯酸氧化脱羧产生对羟基苯丙酮酸，再经过转氨作用合成l-酪氨酸，是微生物从头和从l-酪氨酸的关键酶，也是体外生产l-酪氨酸的可行途径。但是，目前发现的预苯酸脱氢酶，在催化l-酪氨酸的合成过程中，绝大多数都受到终产物l-酪氨酸的反馈抑制，这在很大程度上限制了l-酪氨酸的产量。必须要通过手段解除酪氨酸对预苯酸脱氢酶的反馈抑制，或者选育高活性和低反馈抑制的新型预苯酸脱氢酶，才能实现对酶法和微生物法生产l-酪氨酸至关重要。
6.微生物发酵生产l-酪氨酸使用的是来自大肠杆菌、短杆菌、棒杆菌、或基因工程改造菌株的预苯酸脱氢酶，少见来自极端微生物菌株的生物酶。极端酶往往具有更好的ph、温度、盐度适应范围和重金属、有机溶剂、变性剂的耐受性，或者其它来源生物酶所不具备的特征。本发明提供了一种来源于嗜盐碱微生物菌株的预苯酸脱氢酶sapd及其编码基因，耐受l-酪氨酸，可用于生产条件宽泛，可用于l-酪氨酸的生产。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供预苯酸脱氢酶sapd及其编码基因和应用。
8.本发明提供的蛋白质，来源于盐螺旋菌nm(salinispirillum sp.nm)，是一种预苯酸脱氢酶，命名为sapd蛋白，氨基酸序列由序列表中序列1所示。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有序列表中序列1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其突变体，只要其与前述氨基
酸序列具有99％以上同源性，且具有预苯酸脱氢酶功能，均属于本发明保护范围。具体的，所述改变包括氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或替换。
9.sapd蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
10.优选的，所述基因的碱基序列如序列表中序列2所示，该基因序列来源于盐螺旋菌(salinispirillum sp.)，由900个碱基组成。由于核苷酸序列的特殊性，任何序列表中序列2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
11.含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本发明的保护范围。
12.本发明还保护sapd蛋白作为预苯酸脱氢酶的应用。应用sapd蛋白作为预苯酸脱氢酶时，采用的温度为25-70℃，采用的ph为3-11。应用sapd蛋白作为预苯酸脱氢酶时，采用的温度为40℃，采用的ph为8。
13.本发明提供的预苯酸脱氢酶具有较高的酶活力和热稳定性，对产物l-酪氨酸的耐受性高，并且反应温度宽泛，反应ph宽泛。
14.盐螺旋菌nm(salinispirillum sp.nm)已于2021年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为cctcc no:m 2021460。
附图说明
15.图1为菌株nm的扫描电镜照片。
16.图2为菌株nm的系统进化树。
17.图3为sapd蛋白质的sds-apge电泳图。
18.图4为检测最适ph时的相对酶活结果。
19.图5为检测最适反应温度时的相对酶活结果。
20.图6为l-酪氨酸对sapd蛋白质的酶活影响结果。
具体实施方式
21.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
22.实施例1、盐螺旋菌nm的分离、鉴定和保藏
23.一、分离
24.样品取自内蒙古鄂尔多斯地区的一处碱湖，取碱湖样品50μl，加入碱湖滤液450μl，吹打混匀得到10-1浓度样品，依次稀释得到10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
浓度的样品。取碱湖水样原液20μl、40μl及稀释得到的样品，涂布到lbh固体培养基中，在35℃恒温培养箱中培养3-4d后，观察生长情况。
25.二、鉴定
26.将纯化后的菌株接种至lbh固体培养基中，于30℃恒温培养3d后，记录菌株的菌落
颜色、凸起情况、边缘规则性、大小及透明度等。利用透射电子显微镜和倒置荧光显微镜观察菌株的形态、大小和胞外附属物等特征。利用革兰氏染色法对菌株进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。此外，采用穿刺接种法将菌株接种至半固体lbh培养基中，用以观察细菌的运动性和好氧性情况。
27.以lbh液体培养基作为基础培养基，分别添加0-10.0％浓度(以1％为增量，w/v)的nacl，将菌株接种至上述培养基中，并于30℃下培养7d，空白对照组为不接种菌株的lbh培养基，利用分光光度计在600nm波长下检测菌体密度，从而确定菌株生长的最佳盐度；在ph 3.0-11.0范围内(以1.0单位为间隔)，调节lbh液体培养基的ph值，将菌株接种至上述液体培养基中，空白对照组为不接种菌株的lbh培养基，使用分光光度计在600nm波长下检测菌体的生长密度，确定菌株生长的最适ph；将菌株接种至lbh液体培养基中，分别在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、37℃、40℃、45℃和50℃下培养7d，空白对照组为不接种菌株的lbh培养基，利用分光光度计在600nm波长下检测菌体的生长密度，从而确定菌株的最适温度及温度生长范围；利用biolog gen iii鉴定板检测菌株对不同碳源的利用情况。
28.使用api 20ne和api 32gn试剂盒对菌株进行鉴定，如硝酸盐还原试验、亚硝酸盐还原试验、酶活特性及碳源利用试验等。菌株nm和参考菌株salinispirillum marinum gcwy1
t
的结果见表1。
29.表1
30.31.[0032][0033]
利用基因组提取试剂盒提取菌株的基因组dna，并利用pcr技术扩增菌株的16s rdna序列。本实验采用的pcr体系为：4μl模板dna、1μl引物27f、1μl引物1492r、5μl 10
×
taq buffer、4μl dntp、0.8μl taq dna聚合酶、34.2μl灭菌超纯水。利用琼脂糖凝胶电泳对pcr扩增产物进行验证，若条带大小符合预期实验结果，则将pcr扩增产物送至青岛擎科生物有限公司进行测序。如果测序结果正确，则对pcr扩增产物进行切胶回收，并利用pclone007 simple vector kit克隆试剂盒克隆目的条带，再将克隆后的目的基因与质粒pmd18-t连接，最后将重组质粒转入大肠杆菌e.coli dh5α中，转化过程严格按照感受态细胞e.coli dh5α的使用操作说明进行。将测得的16s rdna序列结果上传至https://www.ezbiocloud.net/网站进行序列对比分析，确定分离细菌的种属，并下载与菌株亲缘性较高的细菌的16s rdna序列。通过选择合适的外群，并基于分离菌株及其相关菌株的16s rdna基因序列，使用mega 7.0软件构建菌株的系统发育树。使用近邻连接法(nj)进行细菌的系统发育分析。基于1000次重复，使用bootstrap分析确定系统发生树的拓扑结构。系统进化树见图2。
[0034]
以上鉴定结果表明，菌株nm属于糖螺旋菌科(saccharospirillaceae)，盐螺旋菌属(salinispirillum)。
[0035]
三、保藏
[0036]
盐螺旋菌nm(salinispirillum sp.nm)已于2021年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为cctcc no:m 2021460。
[0037]
实施例2、预苯酸脱氢酶(sapd蛋白)的制备
[0038]
经过大量序列分析、比对和功能验证，从盐螺旋菌nm中发现一个新蛋白，将其命名为sapd蛋白，如序列表的序列1所示。将盐螺旋菌nm中编码sapd蛋白的基因命名为sapd基因，其编码框如序列表的序列2所示。
[0039]
一、构建重组质粒
[0040]
1、以盐螺旋菌nm的基因组dna为模板，采用pd-f和pd-r组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。
[0041]
pd-f：5
’‑
ccggaattcatgatcaatcaagcg-3’；
[0042]
pd-r：5
’‑
cccaagcttttacctggaacgttct-3’。
[0043]
2、取步骤1得到的pcr扩增产物，与pet-28a载体连接，得到重组质粒pet-28a-sapd。
[0044]
pet-28a载体(pet-28a vector)：安诺伦(北京)生物科技有限公司，产品目录号69864-3。
[0045]
经测序，重组质粒pet-28a-sapd中具有序列表的序列2所示的dna分子。
[0046]
二、制备重组菌
[0047]
将重组质粒pet-28a-sapd导入大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌甲。
[0048]
将pet-28a载体导入大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌乙。
[0049]
三、表达蛋白
[0050]
1、将重组菌接种至含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基，37℃、150rpm振荡培养12小时，得到种子液。
[0051]
2、将1体积份种子液接种至99体积份含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃、200rpm振荡培养至od
600nm
值约为0.6，此时加入iptg诱导剂并使其在体系中的浓度为0.5mmol/l，然后25℃、200rpm振荡培养6h(诱导表达)，然后4℃、8000
×
g离心10min，收集菌体沉淀。
[0052]
3、取步骤2得到的沉淀，用tris-hcl缓冲液(0.05m，ph 7.4)洗涤，然后悬浮于tris-hcl缓冲液(0.05m，ph 7.2)并进行超声破碎(超声破碎参数：功率200w，每超声4s停6s，总时间为40min)，然后4℃、10000
×
g离心20min，收集上清液。
[0053]
重组菌甲进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液甲。
[0054]
重组菌乙进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液乙。
[0055]
四、纯化蛋白
[0056]
取步骤三得到的粗酶液甲，用孔径为0.22μm的微滤滤膜过滤，收集滤液。取滤液，采用superdex
tm 200 10/60凝胶层析柱进行分离纯化。将superdex
tm 20010/60凝胶层析柱连接到快速蛋白液相系统，以1
×
pbs缓冲液(ph 8.0)作为流动相，流速为0.5ml/min。收集保留体积为18-20ml对应洗脱峰的过柱后溶液，即为sapd蛋白溶液。sapd蛋白溶液的电泳图见图3，仅一条蛋白带，且符合预估分子量(约33.2kd)。
[0057]
实施例3、预苯酸脱氢酶(sapd蛋白)的酶学性质
[0058]
tris-hcl缓冲液(100mm，ph 8.0)：称取1.211g tris，用去离子水溶解，用hcl调节ph至8.0，定容至1l。
[0059]
5mm预苯酸溶液：称取0.018g预苯酸钡盐，用去离子水溶解，并定容至10ml。
[0060]
100mm edta：称取2.92g edta，用去离子水溶解，并定容至100ml。
[0061]
100mm dtt：称取1.54g dtt，用去离子水溶解，并定容至100ml。
[0062]
100mm nad
+
：称取0.663g nad
+
，用去离子水溶解，并定容至10ml。
[0063]
酶促反应体系体积为1ml，含有50mm tris(ph 8.0)，1mmol/l edta，1mmol/l dtt，2mmol/l nad
+
，0.5mm预苯酸。在设定好温度的水浴锅或金属浴中预热5min。
[0064]
加入20μl粗酶液甲，混匀开始反应，计时20min。
[0065]
加入500μl 1mol/l的naoh溶液终止酶促反应，10000g离心10min，去除沉淀。在酶标仪中用96孔板测定od
340nm
值。
[0066]
一、ph对预苯酸脱氢酶活性的影响
[0067]
1、最适ph
[0068]
取实施例2制备的sapd蛋白溶液，用缓冲液稀释至2倍体积，将稀释液作为供试液。
[0069]
分别采用如下缓冲液：ph 3.0的柠檬酸盐缓冲液、ph 4.0的柠檬酸盐缓冲液、ph 5.0的柠檬酸盐缓冲液、ph 6.0的柠檬酸盐缓冲液、ph 6.0的磷酸盐缓冲液、ph 7.0的磷酸
盐缓冲液、ph 8.0的磷酸盐缓冲液、ph 8.0的碳酸盐缓冲液、ph9.0的碳酸盐缓冲液、ph 10.0的碳酸盐缓冲液、ph 11.0的碳酸盐缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的配方见表2。磷酸盐缓冲液的配方见表3。各种盐缓冲液的配方见表4。
[0070]
表2
[0071][0072]
表3
[0073][0074]
表4
[0075][0076]
2、sapd蛋白的最适ph为8。将采用最适ph对应的缓冲液时的od
340nm
值作为100％，计算采用各种缓冲液时的相对值，作为相对酶活。结果见图4。
[0077]
二、温度对预苯酸脱氢酶活性的影响
[0078]
1、最适反应温度
[0079]
取实施例2制备的sapd蛋白溶液，用tris-hcl缓冲液(100mm、ph 8.0)稀释至2倍体积，然后作为供试液。
[0080]
检测方法：反应总体积为1ml，含有50mm tris(ph 8.0)，1mmol/l edta，1mmol/l dtt，2mmol/l nad+，0.5mm预苯酸的反应液，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃分别预热5min。加入供试液20μl，反应20min后，加入1mol/l的naoh 100μl终止反应.于10000g离心10min，取上清液200μl，在酶标仪中用96孔板测定od
340nm
值。
[0081]
2、最适反应温度为40℃。将采用最适反应温度时的od
340nm
值作为100％，计算采用各种反应温度时的相对值，作为相对酶活。结果见图5。
[0082]
三、酶活力的测定
[0083]
酶活(iu)定义为：在30℃和ph 7.0的情况下，每催化产生1mol nadh的酶量为一个酶活力单位u。
[0084]
检测方法：加入供试液20μl、50mm tris(ph 8.0)，1mmol/l edta，1mmol/l dtt，2mmol/l nad+，0.5mm预苯酸，30℃反应10min，连续记录od
340nm
数值。
[0085]
采用实施例2制备的粗酶液甲作为供试液，酶活为527u/ml。
[0086]
采用实施例2制备的粗酶液乙作为供试液，酶活为0u/ml。
[0087]
采用实施例2制备的sapd蛋白溶液作为供试液，检测单位体积供试液的酶活。检测实施例2制备的sapd蛋白溶液中的蛋白浓度。将单位体积供试液的酶活除以单位体积供试液的蛋白含量，得到蛋白比活力，数值为757u/mg。
[0088]
实施例4、预苯酸脱氢酶(sapd蛋白)对l-酪氨酸的耐受
[0089]
取实施例2制备的sapd蛋白溶液，用tris-hcl缓冲液(100mm、ph8.0)稀释至2倍体积，作为供试液；
[0090]
反应总体积为1ml，含有50mm tris(ph 8.0)，1mmol/l edta，1mmol/ldtt，2mmol/l nad+，0.5mm预苯酸。分别加入浓度为0.01mm、0.1mm、1mm、5mm、10mm的l-酪氨酸
[0091]
在40℃的水浴锅或金属浴中预热5min。
[0092]
加入20μl供试液，混匀开始反应，计时20min。
[0093]
加入500μl 1mol/l的naoh溶液终止酶促反应，10000g离心10min，去除沉淀。在酶标仪中用96孔板测定od
340nm
值。
[0094]
以不加l-酪氨酸的od
340nm
值作为100％，计算加入不同浓度l-酪氨酸时的相对值，作为相对酶活。结果见图6。
[0095]
实施例5、预苯酸脱氢酶(sapd蛋白)用于制备l-酪氨酸
[0096]
1、实验过程
[0097]
(1)取实施例2制备的sapd蛋白溶液，用pbs缓冲液(100mm，ph8.0)稀释至500u/ml，作为供试液。
[0098]
(2)反应物总体积100ml，含有50mm tris(ph 8.0)，1mmol/l edta，1mmol/l dtt，2mmol/l nad+，0.5mm预苯酸。反应温度40℃，搅拌速度150rpm，反应时间12h。
[0099]
(3)反应混合物加入天冬氨酸转氨酶，天冬氨酸，反应ph 8.0，反应温度40℃，搅拌速度150rpm，反应时间24h。反应结束后，加入醋酸重结晶，得到l-酪氨酸晶体。
[0100]
(4)使用反相色谱对l-酪氨酸进行分析，使用zorbaxsb-c18(4.6
×
150mm)柱，柱温20℃，流速0.5ml/min，流动相使用8.0mm醋酸钠溶液(ph 4.0)：甲醇＝4:1，检测波长230nm。
[0101]
2、预苯酸脱氢酶(sapd蛋白)用于制备l-酪氨酸
[0102]
反应结束后，经hplc分析得知，l-酪氨酸的转化率可达90％，说明该酶在l-酪氨酸制备方面有较大的应用潜力。

技术特征：
1.一种预苯酸脱氢酶基因编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列由序列表中序列1所示。2.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列包含在序列表中序列2所述的核苷酸序列中。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物。5.权利要求1所述蛋白质作为预苯酸脱氢酶的应用。

技术总结
本发明公开了预苯酸脱氢酶SaPD及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，来源于盐螺旋菌(Salinispirillum sp.)，是一种预苯酸脱氢酶，命名为SaPD蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还保护SaPD蛋白作为预苯酸脱氢酶的应用。蛋白作为预苯酸脱氢酶的应用。


技术研发人员：李静 刘建国 张海林 翟永年 公辉
受保护的技术使用者：中国石油大学（华东）
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/12