一种梣酮-血蓝蛋白免疫原及其多克隆抗体与制备方法、应用

1.本发明涉及生物化学和分子免疫学技术领域，具体是一种梣酮-血蓝蛋白免疫原及其多克隆抗体与制备方法、应用。


背景技术：

2.白鲜皮为芸香科植物白鲜dictamnus dasycarpus turcz.的干燥根皮。具有清热燥湿，祛风解毒之功效，现代药理作用研究表明其具有抗肿瘤、抗炎、止血、抗氧化等活性。特别是在治疗皮肤病方面具有显著疗效。随着白鲜皮药材及相关制剂的应用，肝毒性相关的报道逐渐增加，近年来其诱导的药物性肝损伤虽然已经引起关注，但具体的致毒机制仍不清楚。
3.梣酮(fra)是白鲜皮药材中的特征性成分，作为其含量测定的控制指标被收载于《中国药典》(2020版)。研究发现白鲜皮中梣酮可诱导小鼠和斑马鱼肝损伤，给以cyp3a选择性抑制剂酮康唑和亲核性试剂n-乙酰半胱氨酸(nac)共同处理可显著改善小鼠肝损伤。梣酮是呋喃萜类化合物，根据对呋喃和含呋喃结构的天然化学成分的报道，这些化合物诱导的肝毒性主要与呋喃环的代谢有关。呋喃环经p450酶催化代谢为顺稀二醛(cis-enedial)中间体，是一种强亲电试剂，可迅速与蛋白质上的半胱氨酸(cys)和/或赖氨酸(lys)发生共价结合形成吡咯啉(pyrroline)或吡咯(pyrrole)结构的加合物，故这些蛋白质加合物的形成被认为是毒性作用的一个重要触发因素。当共价结合发生后，蛋白质的原有功能可能会降低甚至失活，进一步影响肝细胞正常功能甚至引起细胞死亡，最终导致肝损伤，因此被共价修饰的蛋白质的识别与检测具有重要意义。
4.因此，寻找一种可特异性识别蛋白加合物中fra-pyrroline和fra-pyrrole结构的抗体，是目前急需解决的问题。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种梣酮-血蓝蛋白免疫原及其多克隆抗体与制备方法、应用。
6.一种梣酮-血蓝蛋白免疫原，是选择高免疫原性的血蓝蛋白(klh)作为载体蛋白，与梣酮(fra)化学合成得到。
7.进一步的，所述梣酮-血蓝蛋白免疫原，是通过如下方法制备得到：取梣酮，加入丙酮，充分溶解后，再加入dmdo，室温搅拌反应，37℃下n2流吹干，残渣加入native klh溶液，常温搅拌反应1，即得免疫原fra-klh。
8.进一步的，所述步骤具体如下：精密称取梣酮7.3mg，加入丙酮750μl，充分溶解后，再加入dmdo 1.5ml，室温搅拌反应30min，37℃下n2流吹干，残渣加入native klh溶液1.48ml，常温搅拌反应1h，即得免疫原fra-klh。
9.一种选择性识别梣酮-蛋白共价结合物的多克隆抗体，采用所述的免疫原免疫动物后制备得到。
10.进一步的，所述免疫动物后制备得到，是对家兔进行免疫接种后分离血清得到。
11.进一步的，是通过如下方法制备得到：对家兔进行免疫接种，家兔经背部随机10处注射1.0ml的免疫原乳剂，第一次免疫接种fca-fra-klh，间隔7天，用fia-fra-klh进行加强免疫，定时分离血清。其具体步骤如下：新西兰大白兔经耳缘静脉取血5ml，4℃放置1h，6,000g离心5min，取上清6,000g离心3min，再取上清于-80℃储存，得空白血清。收集完空白血清后进行免疫接种，家兔经背部随机10处注射1.0ml的免疫原乳剂。第一次免疫接种fca-fra-klh，间隔7天，用fia-fra-klh进行加强免疫。每次分离血清后，通过elisa法测定免疫血清的抗体滴定即最大的血清稀释倍数，直至最大的血清稀释倍数1∶20,000以上且随着免疫次数不在增加即可结束。
12.进一步的，所述fca-fra-klh，是采用弗氏完全佐剂的免疫原乳剂。具体是通过如下步骤制备得到：取免疫原200μl，加入4.8ml的pbs，混合均匀后，加入5ml弗氏完全佐剂(fca)，常温搅拌反应3h至完全乳化。
13.进一步的，所述fia-fra-klh是采用弗氏不完全佐剂的免疫原乳剂。具体是通过如下步骤制备得到：取免疫原200μl，加入4.8ml的pbs，混合均匀后，加入5ml弗氏不完全佐剂(fia)，常温搅拌反应3h至完全乳化。
14.所述选择性识别梣酮-蛋白共价结合物的多克隆抗体在特异性识别梣酮-蛋白加合物中的应用。
15.进一步的，所述特异性识别梣酮-蛋白加合物中的应用，是对梣酮诱发肝损伤的蛋白靶点进行elisa、westernblot和免疫荧光检测方面的应用。
16.所述选择性识别梣酮-蛋白共价结合物的多克隆抗体为白鲜皮及fra代谢活化后形成的中间体共价修饰的蛋白质的定性、半定量和可视化定位提供有力的研究工具。
17.与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
18.(1)本技术基于免疫化学法，选择高免疫原性的血蓝蛋白(klh)作为载体蛋白，与梣酮(fra)化学合成免疫原，其可以用于制备特异性识别梣酮-蛋白加合物的多克隆抗体。
19.(2)本技术建立了一种选择性识别梣酮蛋白加合物的多克隆抗体及其制备方法，并成功制备了识别白鲜皮中fra-蛋白共价结合物的多克隆可抗体。
20.(3)本技术利用免疫化学方法制备一种可特异性识别蛋白加合物中fra-pyrroline和fra-pyrrole结构的抗体(图1)，并通过elisa、western blot和immunofluorescence技术验证抗体对fra代谢活化后共价修饰蛋白质的识别能力，为白鲜皮及fra代谢活化诱导肝损伤的诊断与分子机制研究提供有力工具。
附图说明
21.图1是选择性识别梣酮-蛋白共价结合物的多克隆抗体的制备、验证流程图。
22.图2是竞争性抑制剂的化学合成路线图。
23.图3是pyrrole(fra-cys/lys,a)和pyrroline(fra-lys,b)加合物的结构式。
24.图4是免疫原蛋白水解液中fra-cys/lys和fra-lys加合物的代表色谱图，(注：a:native klh水解液的mrm质谱图；b：fra-klh水解液的mrm质谱图；c：epi质谱图)。
25.图5是包被抗原蛋白水解液中fra-cys/lys和fra-lys加合物的代表色谱图(注：a:native bsa水解液的mrm质谱图；b：fra-bsa水解液的mrm质谱图；c：epi质谱图)。
26.图6是免疫第6次的抗血清滴度。
27.图7是竞争性elisa实验结果图。
28.图8是小鼠肝组织中蛋白加合物的wb分析结果图。
29.图9是小鼠肝组织中蛋白加合物的免疫荧光分析结果图。
具体实施方式
30.下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
31.1材料与方法
32.1.1材料
33.1.1.1主要仪器
34.ab 5500qtrap液相色谱质谱联用仪(美国sciex)；variosska多功能酶标仪(美国thermo fisher scientific)；lsm 900超高分辨活细胞成像分析系统(德国zeiss)；eclipse ci正置荧光显微镜(日本nikon)；gy-1200l层析实验冷柜(上海归永)；nx50冷冻切片系统(美国thermofisher)；超低温冷冻冰箱(广东宏阔)；powerpac basic电泳仪(美国bio-rad)；mini-subcellgt电泳槽(美国bio-rad)；trans-blot turbo蛋白快速转印仪(美国bio-rad)；gboxchemixl1.4凝胶成像系统(英国syngene)。
35.1.1.2主要试药
36.梣酮(fra)购买自成都亿发生物科技有限公司(纯度》95％)；酮康唑(ktc)购买自上海源业生物科技有限公司；牛血清白蛋白(bsa)、血蓝蛋白(klh)、强ripa裂解液、蛋白磷酸酶抑制剂pmsf、dapi染色液、glycine、sds、tris、tween-20、含dtt的sds-page缓冲液购买自北京索莱宝公司；pvdf膜购买自美国millipore公司；hrp标记羊抗兔igg购买自美国cst公司；快速发光液购买自大连美仑生物；3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺(tmb)购买自北京中华科技；弗氏完全佐剂和弗氏非完全佐剂购买自西格玛公司；脱脂奶粉购买自内蒙古伊利；alexafluor488(绿色)标记山羊抗兔荧光二抗购买自美国thermo scientific公司；fitc羊抗兔igg购买自上海爱必信公司；sds-page凝胶快速制备试剂盒购买自上海生工生物工程股份有限公司；抗荧光衰减封片剂购买自武汉博士德；4％多聚甲醛、曲拉通x-100、购买自上海碧云天。
37.1.1.3实验动物
38.雌性新西兰大耳兔(2～2.5kg)、雄性昆明小鼠(18-22g)采购自贵州医科大学动物实验中心。实验开始前，动物于温度(22～25℃)和相对湿度(40％～70％)、光照/黑暗周期为12小时的环境可控的房间饲养3天。
39.1.2方法
40.1.2.1溶液的配制
41.1.2.1.11
×
pbs磷酸缓冲盐溶液的配制(以下统称为pbs)
42.分别称取k2hpo415 g和kh2po41.5 g，加入去离子水500ml，超声使完全溶解，调节ph至7.2，4℃下储存备用。
43.1.2.1.210
×
pbs磷酸缓冲盐溶液的配制
44.分别称取k2hpo4150 g和kh2po415 g，加入去离子水500ml，超声使完全溶解，调节
ph至7.2，高温高压灭菌后封口于4℃下储存备用。
45.1.2.1.3pbst缓冲液的配制
46.分别称取k2hpo430 g和kh2po43 g，加入去离子水800ml，超声使完全溶解，调节ph至7.2，加入2ml 25％的吐温20，混匀，定容至1000ml，4℃下储存备用。
47.1.2.1.4四甲基联苯胺(tmb)溶液的配制
48.精密称取tmb 7.2mg，加入10ml dmso，超声使充分溶解，得浓度为3mm的tmb溶液，临用前按比例现配现用。
49.1.2.1.5电泳液的配制(10
×
running buffer)
50.分别称取glycine 144g，tris base 30g，sds 10g，加入1000ml去离子纯化水，超声使充分溶解，于4℃下储存。临用前，按需取去离子纯化水稀释10倍制成1
×
runningbuffer。
51.1.2.1.6转移液的配制(10
×
transfering buffer)
52.分别称取glycine 145g，tris base 29g，加入1000ml去离子纯化水，超声使充分溶解，于4℃下储存。临用前，按需取去离子纯化水、甲醇、10
×
transfering buffer按照8：1：1的比例配制成1
×
transfering buffer。
53.1.2.1.7洗涤液的配制(25
×
tbs buffer)
54.分别称取nacl 100g，tris base 30g，加入500ml去离子纯化水，超声使充分溶解，于4℃下储存。临用前，按需取去离子纯化水、25
×
tbs buffer、20％的甘油按照94：4：2的比例配制成1
×
tbst buffer。
55.1.2.1.8封闭液的配制
56.称取脱脂奶粉1g，加入20mlpbst，超声使充分溶解，即得5％的脱脂牛奶，临用前按比例现配现用。
57.1.2.1.9native klh溶液的配制
58.称取血蓝蛋白klh 3mg，加入pbs 1ml，充分溶解后，得浓度为3mg/ml的native klh溶液，临用前按比例现配现。
59.1.2.1.10native bsa溶液的配制
60.称取牛血清蛋白bsa 3mg，加入pbs 1ml，充分溶解后，得浓度为3mg/ml的native bsa溶液，临用前按比例现配现。
61.1.2.1.11碳酸氢铵溶液的配制
62.精密称取nh4hco3197 mg，加入pbs溶液50ml，超声使充分溶解，调节ph至8.0，即得浓度为50mm的nh4hco3溶液，于4℃下储存备用。
63.1.2.1.12二硫苏糖醇(dtt)溶液的配制
64.精密称取dtt 77mg，加入nh4hco3溶液10ml，超声使充分溶解，即得浓度为50mm的dtt溶液，于4℃下储存备用。
65.1.2.1.13cacl2溶液的配制
66.精密称取cacl288.8 mg，加入nh4hco3溶液4ml，超声使充分溶解，即得浓度为50mm的cacl2溶液，于4℃下储存备用。
67.1.2.1.14糜蛋白酶溶液的配制
68.精密称取糜蛋白酶50mg，加入nh4hco3溶液10ml，超声使充分溶解，即得浓度为5mg/
ml的糜蛋白酶储备液，分装后于-20℃下储存备用。
69.1.2.1.15链霉蛋白酶溶液的配制
70.精密称取链霉蛋白酶100mg，加入nh4hco3溶液10ml，超声使充分溶解，即得浓度为10mg/ml的糜蛋白酶储备液，分装后于-20℃下储存备用。
71.1.2.2竞争性抑制剂fra-nac/nal和fra/nal加合物的化学合成与纯化
72.将fra(30mg,0.13mmol)或3-甲基呋喃(10mg,0.12mmol)溶解在丙酮(25ml)中，分别加入dmdo 50ml，在室温下大力搅拌1小时，得到的溶液在n2气流下吹干。加入nac(85mg,0.52mmol)溶解于pbs中，室温剧烈搅拌2h，加入nal(96mg,0.51mmol)溶解于pbs中，室温剧烈搅拌2h，旋转蒸发除去，甲醇重溶后用硅胶柱洗脱富集。通过半制备液相分离纯化得到竞争性抑制剂fra-nac/nal、fra-nal、3-methylfuran-nac/nal和3-methylfuran-nal。具体合成路线见图2。
73.1.2.3包被抗原的合成
74.精密称取梣酮对照品3mg，加入300μl丙酮，充分溶解后，加入dmdo 0.7ml，室温涡混(2000rpm/min)反应30min，以100μl/管分装与1.5ml的ep管中，分别于37℃n2流吹干，封口后置于-20℃储存，备用。临用前，取出1管，加入100μlnative bsa溶液，室温涡混(2000rpm/min)反应60min，得包被抗原溶液储备液。10,000g离心10min，吸取上清液80μl，加入pbs至15ml，混合均匀后即得包被抗原溶液fra-bsa。
75.1.2.4免疫原的合成
76.精密称取梣酮7.3mg，加入丙酮750μl，充分溶解后，再加入dmdo 1.5ml，室温搅拌反应30min，37℃下n2流吹干，残渣加入native klh溶液1.48ml，常温搅拌反应1h，即得免疫原fra-klh，分装(200μl/管)，置于-20℃下储存。
77.1.2.5免疫原与包被抗原的水解
78.吸取上述合成的免疫原(fra-klh)、阴性免疫原(native klh)、合成抗原(fra-bsa)、阴性抗原(native bsa)各100μl，于60℃水浴中孵育30min使蛋白质变性，加入nh4hco3溶液100μl，混匀，加入dtt溶液20μl，60℃水浴中孵育60min还原蛋白质结构中的二硫键，再加入cacl2溶液40μl、糜蛋白酶溶液80μl、链霉蛋白酶溶液80μl，混合均匀后，于37℃水浴摇床上水解18h。加入800μl乙腈溶液，涡混3min，沉淀蛋白，16,000g离心10min，取上清液经hplc-ms/ms检测分析。
79.1.2.6弗氏完全/不完全免疫原乳剂的制备
80.取“1.2.4”项下分装的半免疫原200μl，加入4.8ml的1
×
pbs，混合均匀后，加入5ml弗氏完全佐剂(fca)，常温搅拌反应3h至完全乳化(达到“油包水”的状态)，得乳白色均匀混合物即得免疫原乳剂(fca-fra-klh)。采用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂(fia-fra-klh)，同法制备弗氏不完全佐剂免疫原乳剂。
81.1.2.7家兔免疫实验
82.新西兰大白兔经耳缘静脉取血5ml，4℃放置1h，6,000g离心5min，取上清6,000g离心3min，再取上清于-80℃储存，得空白血清。收集完空白血清后进行免疫接种，家兔经背部随机10处注射1.0ml的免疫原乳剂。第一次免疫接种fca-fra-klh，间隔7天，用fia-fra-klh进行加强免疫。每次分离血清后，通过elisa法测定免疫血清的抗体滴定即最大的血清稀释倍数，直至最大的血清稀释倍数1∶20,000以上且随着免疫次数不在增加即可结束。
83.1.2.8酶联免疫吸附实验(elisa)
84.吸取上述包被抗原溶液fra-bsa和native bsa溶液分别接种至96孔板，100μl/孔，于4℃下放置过夜。包被第2天，弃去涂层抗原溶液，用pbst洗涤，3次/孔。再用100μl 5％的脱脂牛奶常温封闭2h。封闭2h后，弃去封闭液，用pbst洗涤3次。洗板后加入用封闭液稀释至不同浓度的抗血清样品，100μl/孔，每个样品设置3个复孔，在常温放置2h。弃去一抗孵育液，用pbst洗涤3次。加入用pbst缓冲液稀释的hrp标记山羊抗兔免疫球蛋白(1:10,000)，100μl/孔，在常温放置2h。弃去二抗孵育液，用pbst洗涤3次。每孔加入100μl新配置的底物与供氢体溶液(取醋酸钠缓冲溶液18ml、3％的h2o220μl、0.3mm tmb 2ml，混合均匀即得)，在室温下反应30min后加入50μl 4n的h2so4溶液终止反应。在双波长(450-650nm)下测定吸光度(od)。数据处理采用graphpad prism ver 8.0(graphpad prism软件)拟合曲线采用四参数logistic方程。
85.1.2.9竞争性elisa实验
86.分别精密称取竞争性抑制剂fra-nac/nal、fra-nal、3-methylfuran-nac/nal和3-methylfuran-nal，用甲醇溶液配置成100mm的储备液，临用时再用pbs逐级稀释至100、50、10、2、1、0.5、0.1、0.02、0.01μm，与抗血清按照1：1的比例混合均匀后，于4℃条件下孵育过夜，次日按照上述“1.2.8”项下同法操作，对比竞争性抑制剂预处理后吸光度值变化。
87.1.2.1.10小鼠肝蛋白的western blot实验
88.分别灌胃给以小鼠0.5％cmc-na和0.5％cmc-na配制的梣酮(剂量：100mg/kg)，于给药后12h收集新鲜肝组织，取200mg肝组织，加入2ml细胞裂解液(含1％pmsf的ripa溶液)，匀浆，4℃下10,000g离心20min，取上清液通过bca试剂盒测定总蛋白浓度，用sds-page上样缓冲液稀释至浓度为2mg/ml，于100℃下加热10min使蛋白质变性，放置室温后转移至-20℃下储存备用。分别吸取上述样本各5μl进行sds-page。电泳结束后，采用半干法将凝胶上的蛋白条带转移至pvdf膜上。将膜置于5％脱脂牛奶室温封闭1h。将膜置于用封闭液稀释的抗血清(1：50,000)中，4℃下摇床上孵育过夜。弃去上述一抗孵育液，用tbst清洗膜5次，每次5min，将膜置于用tbst以1：10,000的比例稀释的hrp标记的山羊抗兔免疫球蛋白二抗中，常温摇床上孵育1h。弃去上述二抗孵育液，用tbst清洗膜5次，每次5min，将膜置于发光液中完全浸润后，于凝胶成像系统，曝光并拍照记录。
89.1.2.11组织免疫荧光实验
90.取灌胃给以fra(100mg/kg)后2h的小鼠肝脏，用多聚甲醛溶液中固定脱水。石蜡包埋后进行冷冻切片，切片脱蜡处理和水化处理后，用柠檬酸钠抗原修复溶液进行修复，再用pbs清洗3次，每次3min。用0.1％的triton-x-100浸泡10min使通透再用pbs清洗3次，每次3min。加入5％脱脂牛奶室温封闭30min。滴加抗血清(1:10,000)至组织切片，4℃孵育过夜；次日弃一抗，用pbs洗涤3次，每次5min。滴加488山羊抗兔的igg(1:100)至组织切片，避光室温孵育50min。然后弃二抗，用pbs洗涤3次，每次5min。滴加100μl dapi染液至组织切片，避光室温孵育10min；然后弃dapi，用pbs洗涤3次，每次5min。加适量自发荧光淬灭剂，放置5min，流水冲洗10min，加入抗荧光淬灭封片剂封片。于正置荧光显微镜(日本尼康，nikon eclipse ci)下观察并采集图像，并通过imagej软件计算平均相对荧光强度。
91.1.2.13hplc-ms/ms检测条件
92.①
hplc条件：色谱柱：ace-ar c18柱(4.6
×
100mm，3.5μm)；柱温：35℃；进样体积：5
μl；流速：0.6ml/min；流动相：0.1％甲酸乙腈(a)-0.1％甲酸水(b)；洗脱方式：fra-pyrrole和fra-pyrroline加合物梯度洗脱见表1。
93.表1hplc梯度洗脱条件tab.1hplc gradientelutionconditions
[0094][0095][0096]
②
qtrap ms条件：离子源：esi源；一级全扫范围：m/z 300-1000；二级碎裂方式：ida(information dependentacquisition)标准触发的epi(enhanced product ion)扫描模式。毛细管电压(ion sprayvoltage):5,500v(+)。fra-pyrrole离子对信息：m/z 480.2
→
417.2；fra-pyrroline离子对：m/z 377.2
→
331.2。
[0097]
2结果
[0098]
2.1合成免疫原结构中fra-pyrrole和fra-pyrroline加合物的鉴定
[0099]
图3是fra-pyrrole(fra-cys/lys)和fra-pyrroline(fra-lys)化学结构式及质谱断裂形式。为验证梣酮的反应性中间体与klh结构中的半胱氨酸和/或赖氨酸反应形成含吡咯(fra-pyrrole)和吡咯啉(fra-pyrroline)结构的衍生物。研究首先对合成的免疫原进行完全水解处理，经hplc-ms/ms检测，结果在保留时间为7.05min和7.20min处分别检测到fra-cys/lys和fra-lys加合物(图4)，离子碎片提示fra的反应性中间体成功共价修饰了血蓝蛋白klh上的亲核位点。
[0100]
2.2合成抗原结构中fra-pyrrole和fra-pyrroline加合物的鉴定
[0101]
为了考察抗体滴度与特异性，研究选择牛血清白蛋白bsa作为目的蛋白，用氧化的fra中间体与bsa反应制得包被抗原，包被抗原用于包被elisa实验使用的96孔板。为了评价合成的抗原是否有效，研究对其进行完全水解，经hplc-ms/ms检测，结果同免疫原结果相同，在保留时间为7.05min和7.20min处分别检测到fra-cys/lys和fra-lys加合物(图5)，其mrm-epi模式下的质谱行为相同，碎片离子信息提示fra的反应性中间体成功共价修饰了牛血清白蛋白bsa上的亲核位点。
[0102]
2.3抗血清滴度的测定
[0103]
研究采用fra-bsa作为包被抗原，一抗为自制的家兔血清，选择hrp标记的山羊抗兔igg作为二抗，通过elisa评价抗血清滴度(半数最大稀释倍数)。结果如图6所示，免疫第6次后抗体抗血清滴度(半数最大稀释倍数)约为1：50,000。
[0104]
2.4抗体特异性的评价
[0105]
为了验证抗血清对fra-pyrrole和fra-pyrroline结构识别的特异性，而非对furan-pyrrole和furan-pyrroline。我们选择上述合成的fra-nac/nal、fra-nal、3-methylfuran-nac/nal和3-methylfuran-nal作为竞争性抑制剂，fra-bsa作为抗原。采用elisa实验检测与竞争性抑制剂共孵育的抗体对抗原fra-bsa的识别能力。结果如图7所示，
与native bsa组相比，双波长(450-650nm)下测定的od值随着fra-nac/nal和fra-nal浓度的增加而逐渐降低，而3-methylfuran-nac/nal和3-methylfuran-nal预处理组的od值无明显变化，说明获得的抗体可选择性地识别fra-蛋白加合物中的fra-pyrrole和fra-pyrroline结构。
[0106]
2.5小鼠体内肝组织中蛋白加合物的免疫印迹验证
[0107]
为了验证抗血清对小鼠肝组织中fra反应中间体共价修饰蛋白质的识别能力，取灌胃给以fra后6h的小鼠肝组织，ripa裂解后，用sds-page分离蛋白质，结果如图8，以上述抗体为一抗，通过westernblot进行检测观察到，空白组泳道无蛋白条带，给药组泳道随着fra给药剂量增大，蛋白质条带强度显著增强，提示所制备的抗体可用于蛋白加合物的免疫印迹分析。
[0108]
2.6小鼠体内肝组织中蛋白加合物的免疫荧光验证
[0109]
基于免疫印迹实验结果，研究进一步利用抗体通过免疫荧光技术对小鼠肝组织中蛋白加合物进行成像分析。结果如图9，与空白对照组相比，灌胃fra后2h，肝组织可见明显的绿色荧光(p《0.001)，提示所制备的抗体可用于蛋白加合物的免疫荧光分析。
[0110]
3总结
[0111]
综上，本技术建立了一种选择性识别蛋白加合物的多克隆抗体的制备方法，并成功制备了识别白鲜皮中fra-蛋白共价结合物的多克隆可抗体，利用该抗体可对诱发肝损伤的蛋白靶点进行elisa、westernblot和免疫荧光检测，为白鲜皮及fra代谢活化后形成的中间体共价修饰的蛋白质的定性、半定量和可视化定位提供有力的研究工具。
[0112]
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种梣酮-血蓝蛋白免疫原，其特征在于，是选择高免疫原性的血蓝蛋白作为载体蛋白，与梣酮化学合成得到。2.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于，所述梣酮-血蓝蛋白免疫原，是通过如下方法制备得到：取梣酮，加入丙酮，充分溶解后，再加入dmdo，室温搅拌反应，37℃下n2流吹干，残渣加入native klh溶液，常温搅拌反应1，即得免疫原fra-klh。3.根据权利要求2所述的免疫原，其特征在于，所述步骤具体如下：精密称取梣酮7.3mg，加入丙酮750μl，充分溶解后，再加入dmdo1.5ml，室温搅拌反应30min，37℃下n2流吹干，残渣加入nativeklh溶液1.48ml，常温搅拌反应1h，即得免疫原fra-klh。4.一种选择性识别梣酮-蛋白共价结合物的多克隆抗体，其特征在于，采用权利要求1中所述的免疫原免疫动物后制备得到。5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述免疫动物后制备得到，是对家兔进行免疫接种后分离血清得到。6.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述抗体，是通过如下方法制备得到：对家兔进行免疫接种，家兔经背部随机10处注射1.0ml的免疫原乳剂，第一次免疫接种fca-fra-klh，间隔7天，用fia-fra-klh进行加强免疫，定时分离血清。7.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述fca-fra-klh，是采用弗氏完全佐剂的免疫原乳剂。8.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述fia-fra-klh是采用弗氏不完全佐剂的免疫原乳剂。9.权利要求4所述抗体在特异性识别梣酮-蛋白加合物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述特异性识别梣酮-蛋白加合物中的应用，是对梣酮诱发肝损伤的蛋白靶点进行elisa、westernblot和免疫荧光检测方面的应用。

技术总结
本发明涉及生物化学和分子免疫学技术领域，具体是一种梣酮-血蓝蛋白免疫原及其多克隆抗体与制备方法、应用。本申请基于免疫化学法，选择高免疫原性的血蓝蛋白(KLH)作为载体蛋白，与梣酮(FRA)化学合成免疫原，将免疫原接种于新西兰大白兔使其产生可以特异性识别梣酮-蛋白加合物的多克隆抗体。该抗体可以特异性识别蛋白加合物中FRA-pyrroline和FRA-pyrrole结构，利用该抗体可对诱发肝损伤的蛋白靶点进行ELISA、Westernblot和免疫荧光检测，为白鲜皮及FRA代谢活化后形成的中间体共价修饰的蛋白质的定性、半定量和可视化定位提供有力的研究工具。供有力的研究工具。供有力的研究工具。


技术研发人员：潘洁 郑江 李维维 胡紫霞 伍楚天
受保护的技术使用者：贵州医科大学
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/18