一株PET塑料高效降解菌及其应用的制作方法

一株pet塑料高效降解菌及其应用
技术领域
1.本发明属微生物及其应用技术领域，更具体地说，本发明涉及一种诺卡氏菌及其应用。


背景技术：

2.塑料工业的迅猛发展改变了人们传统的生产、生活方式，给人们的生活带来了极大的便利，但产生的大量塑料垃圾在自然环境中不断累积，给全球的生态环境造成了严重的负担。每年有大量的塑料垃圾进入海洋生态系统，给海洋的鸟类、鱼类等生物造成了严重的生存威胁。聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol terephthalate，pet)由石油衍生的对苯二甲酸和乙二醇为材料合成，具有烃链长、分子量高、气体渗透性低、难降解等特点。因生产成本低、耐用性好和使用简便等优点，pet成为使用量最多的聚酯材料，全球一半以上的合成纤维和塑料瓶由pet制成。由于pet分子的主链上存在芳香族化合物而难以自然降解，pet塑料的绿色降解对于人类健康和保护生态环境，具有积极意义和作用。
3.微生物降解是目前塑料绿色降解的最佳方法，微生物附着在塑料表面，形成生物膜，微生物分泌的胞外降解酶攻击聚酯分子中的酯键，pet被水解成低聚物、二聚物、水溶性单体，如对苯二甲酸羟乙酯(bhet)、对苯二甲酸单羟酯(mhet)、对苯二甲酸(tpa)等，最终被矿化为二氧化碳和水。到目前为止只有少数的细菌、放线菌和真菌被报道能够将pet部分降解为低聚物或单体。放线菌是发现塑料降解菌的重要来源，目前已经报道从放线菌门中发现褐色喜热裂孢菌(thermobifida fusca)、链霉菌属(streptomyces)、绿色糖单孢菌(saccharomonospora viridis)等菌株可有效的降解pet。角质酶(cutinase)属于α/β折叠水解酶超家族，具有丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸残基组成的催化三联体，是目前有效降解pet的重要酶类。pet塑料的玻璃化温度为76℃，在高温下稳定的角质酶更有利于塑料的降解，不同菌种来源的角质酶，表现出了不同的温度适应性，显示出不同的pet降解活力。因此，本专利通过挖掘高效的pet塑料降解菌和新型的高温稳定的角质酶，用于环境中pet塑料降解，对于保护生态环境具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一种具有pet降解能力的新的诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511以及该菌株scsio 66511在pet塑料降解方面的应用。
5.诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号cgmcc no.26044，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为：2022年12月4号。
6.本发明的第二个目的是提供诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511在降解pet塑料中的应用。
7.本发明的第三个目的是提供一种诺卡氏菌scsio 66511来源的新型角质酶sccut，氨基酸序如seq id no.3的第31-317位氨基酸序列所示。
8.本发明的第四个目的是提供编码上述角质酶sccut的基因。
9.优选，所述的基因的核苷酸序列如seq id no.2第91-951位核苷酸所示。
10.本发明的第五个目的是提供上述角质酶sccut或其编码基因在降解pet塑料中的应用。
11.本发明的第六个目的是提供一种基因工程菌，其含有上述编码上述角质酶sccut的基因，并能表达角质酶sccut。
12.优选，所述的基因工程菌是大肠杆菌工程菌株bl21(de3)。
13.与现有技术相比，本发明具有如下优势：
14.1、本发明的诺卡氏菌scsio 66511是不同于已发现的pet降解细菌的新物种。
15.2、本发明的诺卡氏菌scsio 66511来源于海洋环境，具有较强的环境适应能力，并具备良好的pet塑料降解效果。
16.3、诺卡氏菌scsio 66511来源的角质酶sccut最适酶活性温度为70℃，表现出高温稳定性，且显示出高效的pet降解作用。
17.诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号cgmcc no.26044，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为：2022年12月4号。
附图说明
18.图1为本发明的诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511显微形态特征。(a，扫描电镜观察形态；b，透射电镜观察形态)
19.图2为本发明的诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511系统发育树。
20.图3为本发明的诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511来源角质酶系统发育树。
21.图4为在不同温度下，角质酶sccut活性情况。
22.图5为在最适温度70℃下，角质酶sccut稳定性分析。
23.图6为扫描电镜观察菌株nocardioides sp.scsio 66511对pet塑料粉末的降解作用。(a，未处理的pet粉末；b，菌株降解后pet粉末)
24.图7为扫描电镜观察菌株nocardioides sp.scsio 66511对pet塑料膜的降解作用。(a，未处理的pet塑料膜；b，c，d为菌株降解后pet塑料膜)
25.图8为扫描电镜观察菌株nocardioides sp.scsio 66511来源角质酶sccut对pet塑料粉末的降解作用。a，未处理的pet粉末；b，角质酶sccut降解后pet粉末)
26.图9为扫描电镜观察菌株nocardioides sp.scsio 66511来源角质酶sccut对pet塑料膜的降解作用。(a，未处理的pet塑料膜；b，c，d为角质酶sccut降解后pet塑料膜)
具体实施方式
27.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
28.实施例1pet降解菌scsio 66511的分离与筛选
29.从中国南海美济礁采集石芝珊瑚样品。使用研钵将珊瑚组织磨成粉末状，称取1g珊瑚组织样品置于9ml无菌的天然海水中，采用稀释涂布的方法将稀释后的样品，取150μl涂布在藻液培养基(al)上，28℃倒置培养14天，挑取不同形态的菌落在2216e培养基上进行
纯化，获得纯化菌株。将获得的菌株在无机盐培养基(msm)(添加pet塑料粉末为唯一碳源)上培养，菌株scsio 66511生长良好。
30.藻液培养基(al):甘油0.5g；海藻糖0.5g,d系群(durusdinium sp.sysc 24-3)虫黄藻破碎液10ml,琼脂15g,自然海水1000ml,将各成分混合均匀，调ph 7.2，121℃灭菌20min备用。
31.2216e培养基：购买自青岛海博生物，产品型号：hb0132-1；
32.无机盐培养基(msm):na2hpo
4.
2h2o 3.5g；kh2po
4 1.0g；(nh4)2so
4 0.5g；mgcl
2.
6h2o0.1g；cacl
2 0.05g,琼脂15g,水1000ml，将各成分混合均匀，调ph7.2，121℃灭菌20min备用。
33.实施例2菌株scsio 66511的形态学和分子生物学鉴定
34.1、形态与生理学特征：
35.将菌株scsio 66511采用三区划线方式接种于2216e固体培养基上，28℃培养5天后观察其菌落形态。挑取单菌落进行革兰氏染色，采用扫描电镜和jeol透射电镜观察菌株的细胞形态。硝酸盐还原、吲哚、水解明胶，水解七叶灵等测试采用api 20ne试剂条。
36.菌株scsio 66511在2216e上呈现白色，规则圆形，表面光滑，边缘整齐。菌株革兰氏染色为阳性，细胞呈现不规则杆状(图1)。过氧化氢酶、半乳糖苷酶、硝酸盐还原、水解凝胶、水解七叶灵和水解淀粉为阳性，氧化酶为阴性。
37.2、系统进化分析：
38.采用细菌dna提取试剂盒提取菌株scsio 66511的基因组dna。以提取的dna为模板，采用细菌通用引物27f(5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
)和1492r(5
′‑
tacgacttaaccccaatcgc-3
′
)进行16s rrna基因的pcr扩增。pcr反应体系(50μl)见表1。对pcr产物进行胶回收，经过ta克隆后，使用m13f/m13r基因扩增后产物，送往广州天一辉远基因科技有限公司完成测序。
39.获得的序列在ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/)在线工具完成序列相似性比较。采用mega 11构建基于16s rrna基因序列的neighbor-joining系统进化树，计算模型为kimura 2-paremeter。通过克隆测序获得菌株scsio 66511的16s rrna基因全长序列为1492bp(seq id no.1所示)。序列比对发现菌株scsio 66511与已发表的模式菌株序列相似度低于物种区分的临界值98.65％，其中相似度最高的模式菌为nocardioides iriomotensis ir27-s3
t
(96.15％)。基于16s rrna基因序列构建的nj系统进化显示，菌株scsio 66511与nocardioides mesophilus msl-22(t)、aeromicrobium massiliense jc14(t)等模式菌株具有最近的亲缘关系(图2)。
40.表1基因组dna的pcr反应体系
[0041][0042]
2、比较基因组分析
[0043]
对菌株scsio 66511进行全基因组测序，获得菌株scsio 66511的基因组完成图。结果显示，基因组大小为4.6m，g+c含量为66.9％。基于基因组序列采用ani计算平均核苷酸一致性，基于基因组序列的模拟dna-dna杂交值(dddh)，采用在线工具ggdc 2.1(http://ggdc.dsmz.de/home.php)完成。采用在线工具aai calculator(http://enve-omics.ce.gatech.edu/aai/)计算基于基因组氨基酸序列的平均氨基酸相似性。基于基因组分析的结果如表2所示，菌株与亲缘关系较近的已发表菌株的ani值都显著低于公认的ani《95％-96％的物种界限阈值，相应的dddh值显著低于70％dddh作为物种界限的阈值，aai在潜在新属的阈值45-65％内。因此可以确认菌株为诺卡氏菌科的潜在新种，本发明将菌株命名为：诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号cgmcc no.26044，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为：2022年12月4号。
[0044]
表2菌株与近缘模式菌种的比较基因组分析
[0045][0046]
实施例3角质酶基因sccut重组载体pet28b的构建
[0047]
根据菌株nocardioides sp.scsio 66511的基因组注释结果，获得一个角质酶家族的基因，其含有951个碱基(如seq id no.2所示)，编码317个氨基酸(氨基酸序列如seq id no.3所示)，在ncbi进行序列比对，氨基酸最大相似性为43.5％，基于氨基酸序列与已知的角质酶(具有pet降解作用)氨基酸序列构建系统进化树如图3所示；通过对该基因分析，发现在其n段编码一个30个氨基酸的信号肽，去除信号肽序列，从91位核苷酸位置设计引物scf1(5
′‑
tgggatccccgaattccgatgcaccgtgcgcgccgct-3
′
)/scr1(5
′‑
gtc acgatgcggccgctgcgtgccgcgtcgcgcaggc-3
′
)对该目标基因进行pcr扩增，通过胶回收获得目的基因片段。将回收后的基因片段连接在载体pet28b的ndeⅰ和xhoⅰ之间，得到重组载体pet28b-sccut，将重组后的载体转化至宿主e.coli dh5a中，得到的单克隆测序验证是否为正确的基因序列(与seq id no.2第91-951位核苷酸相同)，测序正确的菌株，提取重组质粒pet28b-sccut。
[0048]
实施例4工程菌bl21(de3)/sccut的构建与新型角质酶sccut蛋白的制备
[0049]
将提取的质粒pet28b-sccut转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，培养1h后，将大肠杆菌细胞涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养皿上，37℃培养12h，挑取单克隆
进行测序验证(与seq id no.2第91-951位核苷酸相同)，验证成功的为含有角质酶的基因工程菌bl21(de3)/sccut。将基因工程菌bl21(de3)/sccut在500ml锥形瓶中37℃，180rpm/min震荡培养4h，按体积比2％的接种量接种至含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb液体培养基中，在37℃，180rpm/min震荡培养至od600为0.6-0.8；然后加入终浓度为0.1mm的iptg，在16℃下震荡培养20h。在4℃条件下8000r/min离心10min收集菌体，用tris-hcl缓冲液(50mm、ph8.0)洗涤菌体3次，重悬菌体并超声破碎，然后4℃，10000r/min离心去除沉淀，得到的上清为粗酶液。粗酶液用ni
2+
亲和层析柱进行蛋白纯化，用咪唑梯度洗脱，收集洗脱液，然后用10kda的超滤管置换为50mm ph8.0的tris-hcl缓冲液，并进行浓缩。利用sds-page检验蛋白的纯度，用超微量蛋白检测仪检测浓缩蛋白的浓度，得到的蛋白为角质酶nscut，大小为31kda，其氨基酸序列如seq id no.3的第31-317位氨基酸序列所示。
[0050]
实施例5温度对新型角质酶sccut活性影响及稳定性分析
[0051]
选取pnp-c4作为角质酶活性测定的标准底物，加入190μl浓度为0.5mm pnp-c4(使用20mm tri-hcl，ph8.0溶液溶解)和10μl 0.5mg/ml酶溶液为反应体系，酶与底物反应温度控制在5-95℃范围内(间隔为5℃)，测定不同温度下角质酶sccut的相对活性(70℃下表现出最高酶活性，定义为100％，其他温度下酶活性与它相比计算)，确定最适温度。酶的热稳定性测定：将角质酶sccut置于最适温度70℃下，每隔30min测定酶对底物得残余活性，检测波长为405nm，未经热处理得酶活性定义为初始活性100％。
[0052]
根据检测的活性发现在角质酶sccut在5℃到95℃范围内均表现出活性，高温有利于提高酶活性，在70℃下表现出最高活性(图4所示)，这有利于该酶的开发利用。根据在70℃下的热稳定性检测，发现在150min时，该酶的相对活性仍大于50％，表现出高温稳定性(图5所示)。
[0053]
实施例6菌株nocardioides sp.scsio 66511对pet塑料粉末和塑料膜降解能力分析
[0054]
pet塑料降解菌对pet塑料粉末的降解实验按照以下步骤进行：
[0055]
首先将pet粉末用75％乙醇浸泡1h除菌，除去乙醇后干燥6h，得pet粉末备用。称量50mg pet粉末，放置于100ml锥形瓶中，加入20ml msm培养液，按体积比10％的接种量将对数生长期的菌株nocardioides sp.scsio 66511菌液接入到msm培养液中，不接种菌株的组，作为对照组，每组设置三个平行。在28℃，180rpm/min的摇床中反应14d，检测pet降解产物和塑料表面微观形态变化。
[0056]
pet塑料表面微观形貌变化按照如下流程处理：将液体连同塑料粉末转入50ml离心管中，放置在4℃备用。在12000rpm/min，离心10min，收集pet粉末，用无菌水洗涤，超声处理5min，除去塑料表面的盐，重复三次后，置于烘箱中50℃干燥处理6h，将处理好的塑料样品，喷金处理40s，在扫描电子显微镜下观察pet塑料其微观形貌特征。
[0057]
pet塑料降解菌对pet塑料膜的降解实验按照以下步骤进行：
[0058]
将pet薄膜裁剪成2*2cm2大小，然后用75％的乙醇灭菌1h，取出塑料膜放置于无菌培养皿中，在无菌操作台中挥发掉塑料表面乙醇。在100ml锥形瓶中加入30ml无机盐培养基,放入3片无菌处理后的pet塑料膜，按体积比10％的接种量将对数生长期的菌株nocardioidessp.scsio 66511菌液接入到msm培养液中。以不接菌的处理作为阴性对照组，每组处理设置三个平行。将锥形瓶置于恒温摇床中，28℃，180r/min培养14天，观察pet塑料
表面的形貌变化。
[0059]
pet塑料表面微观形貌变化按照如下流程处理：使用无菌水冲洗塑料表面的菌膜和基础培养基，然后在100％乙醇中浸泡2h，取出后在放置于无菌培养皿中，在烘箱(50℃)中干燥6h。将处理好的塑料样品，喷金处理40s，在扫描电子显微镜下观察pet塑料其微观形貌特征。
[0060]
由图6和图7可见，经14天的培养，在扫描电镜下可以观察到，经过接菌nocardioides sp.scsio 66511处理组中与对照组相比，pet塑料粉末表面出现褶皱，边缘粗糙，存在明显的降解痕迹；pet塑料薄膜表面粗糙，出现明显微生物侵蚀的孔洞，对照组处理的pet塑料未发生变化；以上观察结果说明菌株scsio 66511对pet塑料具有降解作用。
[0061]
实施例7新型角质酶sccut对pet塑料粉末和塑料膜降解能力分析
[0062]
新型角质酶sccut对pet塑料粉末的降解实验按照以下步骤进行：
[0063]
称量4mg pet粉末，放置于10ml玻璃小瓶中，加入2ml 20mm tris-hcl(ph8.5),然后加入纯化后的角质酶，终浓度为1μg/ml，加入等体积的20mm tris-hcl作为对照组，每种处理设置三个平行。在60℃，180rpm/min的摇床中反应48h，取样检测pet降解产物和塑料表面微观形态变化。
[0064]
pet降解后产物分析流程：取1ml降解溶液，8000rpm/min离心10min，上清液使用0.22μm水性滤膜过滤，备用。使用安捷伦1260高效液相色谱检测tpa，mhet，和bhet的组成。色谱柱；zorbax sb-c18ods(4.6*150mm,5μm)，检测波长240nm。流动相：a是含有0.1％(v/v)甲酸的去离子水；b是含有0.1％(v/v)甲酸的甲醇。梯度洗脱条件：0-5min 10％b；5-20min 10％-100％b溶液；流速1.0ml/min，柱温保持适温。
[0065]
pet塑料表面微观形貌变化按照如下流程处理：将液体连同塑料粉末转入2ml ep管中，12000rpm/min，离心10min，将液体保存在另外新的ep管中，放置在4℃，保存备用。将离心收集的粉末，用无菌水洗涤，超声处理5min，出去塑料表面的盐，重复三次后，置于烘箱中50℃干燥处理6h，将处理好的塑料样品，喷金处理40s，在扫描电子显微镜下观察pet塑料其微观形貌特征。
[0066]
新型角质酶sccut对pet塑料膜的降解实验按照以下步骤进行：
[0067]
将pet薄膜裁剪成1*1cm2大小，然后用75％的乙醇灭菌1h，取出塑料膜放置于无菌培养皿中，在无菌操作台中挥发掉塑料表面乙醇。在10ml玻璃瓶中2ml 20mm tris-hcl(ph8.5),然后加入纯化后的角质酶，终浓度为1μg/ml，放入3片无菌处理后的pet塑料膜，以加入等体积的20mm tris-hcl作为对照组，每组处理设置三个平行。将锥形瓶置于恒温摇床中，60℃，180r/min培养48h，检测pet降解产物和pet塑料表面的形貌变化。
[0068]
pet薄膜降解后产物检测同pet粉末检测方法完全相同，见上文分析流程。
[0069]
pet塑料表面微观形貌变化按照如下流程处理：使用无菌水冲洗塑料表面的蛋白和基础培养基，然后在100％乙醇中浸泡2h，取出后在放置于无菌培养皿中，在烘箱(50℃)中干燥6h。将处理好的塑料样品，喷金处理40s，在扫描电子显微镜下观察pet塑料其微观形貌特征。
[0070]
将纯化后的角质酶与pet粉末和pet薄膜分别反应48h后，检测降解产物的结果为：在pet粉末降解实验中，未检测到降解产物，说明降解产物浓度太低，对pet粉末的降解效率低；在pet薄膜的降解实验中，检测到了降解产物tpa，mhet和bhet，tpa的含量最高，说明该
新型角质酶可有效将pet降解成tpa，效果显著。由图8和图9可见，经过48h的孵育，在扫描电镜下可以观察到，经过角质酶sccut的处理组中与对照组相比，pet塑料粉末表面出现明显褶皱，边缘粗糙，表现出对pet塑料粉末的降解作用；过角质酶sccut的处理过的pet塑料薄膜表面粗糙，出现明显降解后的孔洞，部分蛋白位于孔洞内，对照组处理的pet塑料未发生变化；以上观察结果说明角质酶sccut对pet塑料薄膜具有明显的降解作用。
[0071]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
[0072]
seq id no.1
[0073]
[0074][0075]
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[0080]

技术特征：
1.诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511，保藏编号cgmcc no.26044。2.权利要求1所述的诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511在降解pet塑料中的应用。3.一种角质酶sccut，氨基酸序如seq id no.3的第31-317位氨基酸序列所示。4.编码权利要球3所述的角质酶sccut的基因。5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如seq id no.2第91-951位核苷酸所示。6.权利要求3所述的角质酶sccut或其编码基因在降解pet塑料中的应用。7.一种基因工程菌，其特征在于，含有编码权利要求3所述的角质酶sccut的基因，并能表达角质酶sccut。8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是大肠杆菌工程菌株bl21(de3)。

技术总结
本发明公开了一株PET塑料高效降解菌及其应用。诺卡氏菌Nocardioides sp.SCSIO66511保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCCNo.26044，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为：2022年12月4号。本发明的诺卡氏菌SCSIO 66511来源于海洋环境，具有较强的环境适应能力，并具备良好的PET塑料降解效果。具备良好的PET塑料降解效果。具备良好的PET塑料降解效果。


技术研发人员：田新朋 石松标 杨键 李青连 刘玉 曾琦 龙丽娟
受保护的技术使用者：三亚海洋生态环境工程研究院
技术研发日：2023.03.15
技术公布日：2023/7/19