肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法与流程

1.本发明涉及肉质中多不饱和脂肪酸检测的技术领域，特别是涉及一种肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法。


背景技术：

2.肉质是人类重要的食物来源，还与人体健康息息相关。而多不饱和脂肪酸则被认为对人体健康有益。关于多不饱和脂肪酸的测定方法目前有国家标准，即食品安全国家标准
‑‑
食品中脂肪酸的测定(gb5009.168-2016)，我国规定了肉质中的脂肪酸使用气相色谱法进行检测(gb 5009.168—2016)，如申请号为cn201510312760.0的专利中提出的同时检测小鼠血液和肝脏组织中脂肪酸含量的气相色谱方法，此方法能定量检测脂肪酸的种类和含量，但样品前处理过程复杂，耗时长，且成本高，所以为了对该方法进行改进，国内外对于肉质脂肪检测的主要方法有气相色谱法、紫外分光光度计法、液相色谱法等，但都存在成本高和效率低等问题，很难在生产实践中快速批量化使用，进而出现中红外光谱mir(mid-infrared spectroscopy)技术，其是一种非常经济高效的检测工具，通过中红外光对分子中特定化学键吸收所在的频率和对应的波峰的不同，来预测所研究物质和性状的性质或含量，从而可以得知生物的生理状态等信息，已经可以对蛋白总量和脂肪总量等指标进行检测，目前国外早已开始了基于中红外检测肉质中物质成分的研究，但是其存在精度不高，特征波段不够准确等问题，再有国外检测模型并不一定适合于我国肉质成分，故需要尽快建立适合于我国肉质的多不饱和脂肪含量检测方法，快速、高效、准确和无创测定猪肉质性状中重要性能指标多不饱和脂肪酸含量，为种猪遗传育种提供表型数据及理论依据，并且可检测分析肉质中多不饱和脂肪酸含量，为食品加工业和消费者提供参考。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供一种实现了肉质中多不饱和脂肪酸含量的快速、准确、低成本的检测，实现了快速批量检测的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法。
4.本发明的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，包括以下步骤：
5.s1、实验准备
6.材料准备：选取国内11个省份肉市场猪肉120样品，运送至实验室；
7.器材准备：电热恒温水浴锅、玻璃索氏提取器、安捷伦气相色谱仪，包括自动进样器、柱温箱、进样瓶、涡漩振荡器、针管过滤器、0.22μm尼龙滤膜、100m
×
0.25mm
×
0.2μm，毛细管色谱柱、氦气；
8.s2、中红外光谱的采集
9.将样品倒入圆形样品盘中，利用肉质快速检测仪进行光谱采集，具体采集步骤为：将肉样粉碎分批放入用于后续多不饱和脂肪酸的含量测定；
10.s3、多不饱和脂肪酸含量的气相谱技术测定
11.(1)、样品水解提取，称取均匀试样0.1g-10g(精确至0.1mg，约含脂肪100mg-200mg)移入到250ml平底烧瓶中，加入约90mg-110mg焦性没食子酸，加入几粒沸石，再加入2ml95％乙醇，混匀；
12.(2)、脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化，在脂肪提取物中加入1％-3％氢氧化钠甲醇溶液8ml，连接回流冷凝器，80℃
±
1℃水浴上回流，直至油滴消失，从回流冷凝器上端加入7ml15％三氟化硼甲醇溶液，在80℃
±
1℃水浴中继续回流1min-3min，用少量水冲洗回流冷凝器，停止加热，从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温，准确加入10ml-30ml正庚烷，振摇1min-3min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层，吸取上层正庚烷提取溶液大约5ml，至25ml试管中，加入大约3g-5g无水硫酸钠，振摇1min，静置5min，吸取上层溶液到进样瓶中待测定；
13.(3)、气相色谱仪器参数，色谱柱：100m
×
0.25mm
×
0.2μm，熔融石英毛细管柱，固定相：氰丙基-聚硅氧烷，载气：氦气，柱头压力：225kpa(175kpa-225kpa)，分流比：100：1，进样器温度：260℃-280℃，检测器温度：270℃-290℃，进样量：1μl，程序升温；
14.(4)、将所有测得的9种多不饱和脂肪酸含量进行求和，则为单不饱和脂肪酸含量；
15.s4、有效样本的选择
16.120个样本中，剔除掉样本变质、损耗、中红外光谱测定异常、样本参考值测定异常等操作导致的无效数据，共剔除掉了20个异常样本，选择了100个样本进行模型的建立与优化。
17.优选的，所述s1的材料准备中，120样品，每份肉样采集左半胴体背最长肌大约1斤，放到速冻袋子密封，依次编号，运回途中在肉样周围放置冰袋(2-4℃)防止变质。
18.优选的，所述s3中从回流冷凝器上端加入7ml15％三氟化硼甲醇溶液，在80℃
±
1℃水浴中继续回流2min。
19.优选的，所述s3中从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温，准确加入10ml-30ml正庚烷，振摇2min。
20.优选的，所述s3中进样器温度：270℃，检测器温度：280℃。
21.优选的，所述s3中加入约100mg焦性没食子酸。
22.优选的，所述s3中在脂肪提取物中加入2％氢氧化钠甲醇溶液8ml。
23.优选的，所述s3中程序温度：
24.温度/℃：100、保留时间/min：13；
25.温度/℃：100-180、保留时间/min：6、速率/℃/min：10；
26.温度/℃：180-200、保留时间/min：20、速率/℃/min：1；
27.温度/℃：200-230、保留时间/min：10.5、速率/℃/min：4。
28.与现有技术相比本发明的有益效果为：
29.1、在特征波段的选择方面，打破了常用的使用算法筛选特征，而是使用人工手动选择+多次遍历的方法，最终选取用于建模的特征波段；
30.2、选取了多不饱和脂肪酸模型建立的最优预处理与算法组合，确定了最优参数，提高了模型的准确性；
31.3、实现了肉质中多不饱和脂肪酸含量的快速、准确、低成本的检测，实现了快速批量检测，每一个样本的测定时间仅需10-15秒，提高了检测效率，具有较强的实用性，将可广
泛应用于肉质品质测定和食品质量品质检测。
附图说明
32.图1是本发明未经处理的肉质样品中红外光谱图(a)与平均光谱图(b)；
33.图2是本发明diff2+diff1预处理后的肉质样品中红外光谱图；
34.图3是本发明选取的十五个特征波段光谱总图(a)以及每个特征波段放大图(b)；
35.图4是本发明模型肉质数据真实值与预测值相关性与拟合直线图。
具体实施方式
36.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
37.实施例1
38.多不饱和脂肪酸的预测模型算法的选择：
39.本实施例主要使用了岭回归(ridge)与偏最小二乘回归(plsr)算法进行模型建立与对比，理由如下：
40.岭回归是线性回归的一种，只是在算法建立回归方程时候，岭回归加入了正则化的限制，从而达到解决过拟合的效果，正则化有两种，分别为l1正则化l2正则化，l2正则化相比于l1正则化的优势在于：(1)可以进行交叉验证(2)实现了随机梯度下降，岭回归就是加入了l2正则化后的线性回归模型，保留了线性回归的优点，符合模型建立的要求，而且结果较为稳定，是较常使用的基础算法之一，因此本实施例选择了此算法为待选算法；
41.偏最小二乘回归算法是多特征样本中非常有效的算法之一，中红外光谱数据中，每一个样本对应1060个波点，是多特征样本的代表，同时偏最小二乘回归算法很少出现过拟合情况，所以很多中红外光谱的研究者们会选择使用偏最小二乘回归算法进行模型的建立，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
42.实施例2
43.中红外光谱初步模型算法及其最优预处理组合的筛选：
44.有效特征筛选是对光谱数据进行处理的基本操作，目的是为了消噪，并为提取特征打好基础，有效特征筛选主要有特征抽取、特征预处理与特征降维三种，本实施例主要采用sg(卷积平滑)、msc(多元散射校正)、snv(标准正态变量变换)、diff1(一阶差分)和diff2(二阶差分)等五种处理方法对光谱数据进行特征预处理；
45.本实施例每个样本对应一条mir光谱数据。将全光谱波段代入进行建模，比较分析模型的准确度，使用两种算法和六种方法(包括无预处理)进行一一配对，以确定模型初步最优算法和预处理组合，结果如下表：
46.比较结果如下：
[0047][0048]
经过比较，发现偏最小二乘回归与二阶差分(plsr+diff2)的组合整体效果更好，而且相比于ridge算法过拟合情况较弱，所以模型初步最优算法和预处理组合最终选择：plsr+diff2。
[0049]
实施例3
[0050]
中红外光谱检测肉质中多不饱和脂肪酸含量的方法的建立：
[0051]
1、建模数据集的划分
[0052][0053]
本实施例中的建模数据集划分中，80％为训练集，20％为测试集，训练集与测试集的比例为4：1，同时训练集又叫做交叉验证集，在训练模型的过程中进行10折交叉验证；
[0054]
2、建模特征波段的手动选择过程及确定
[0055]
选取特征波段的方法有很多，主要包括算法选取特征与手动选取特征两种，算法选取特征的原理主要来源于各波点与参考值之间的相关性，优点在于速度快、效率高，但缺点在于忽略了相邻波点之间的协同作用，思路较为单一；手动选取特征的优点在于选择的过程中可以强化波段(即相邻波点)的作用，同时可以在提升模型的过程中更多得保留光谱的原始信息状态，包容性与泛化能力更强，选取波段准确，缺点在于选择速度慢，效率低；
[0056]
本实施例选取特征波段采用手动选取的方法，选取步骤如下：
[0057]
(1)、确定基本算法与预处理组合，由实施例2可知plsr+diff2的效果组合整体较好，所以最终选择plsr+diff2组合作为多不饱和脂肪酸的初步模型算法与预处理组合；
[0058]
(2)、确定最佳第二次预处理，建模过程中，有时仅一次预处理会限制模型的泛化能力和优化潜力，本实施例在建模过程中发现进行第二次预处理可以更好地优化模型，所以将初步模型算法选择与预处理组合的结果进行第二次预处理，选择出最佳的第二次预处理方法，经过比较发现第二次预处理使用diff1对训练集效果的提升较为明显，且测试集效果并没有很严重的下降，优化潜力较大，而diff2的过拟合情况较为严重，所以最终选择diff1作为最佳第二次预处理方法(结果如下表)；
[0059][0060][0061]
建模特征波段的手动选择过程如下：
[0062]
(1)、将全波段以100个波点为一段进行分段，最终分为11段，根据预实验，发现保留部分水吸收相关的光谱区域可提升模型的准确度，因此，在此步骤中，并未去掉水吸收相关的光谱区域；
[0063]
(2)、以50个波点为一组，使用偏最小二乘回归算法，首先将第一段波段临界处两端波点增加或减少一组波点，寻找最优效果，并以此为基础对第二段波段进行类似操作，最终将11个波段全部完成一轮操作后算第一次遍历完成；
[0064]
(3)、在第一次遍历完成后进行第二次、第三次或更多次的手动遍历，直到所有的波点不再变化为止，即为最优特征波段；
[0065]
最终经过十五轮筛选，得到最优结果，如表所示：
[0066][0067]
最终选取的特征波段结果为：933.64cm-1-1049.38cm-1
、1053.23cm-1-1192.12cm-1
、1253.85cm-1-1415.89cm-1
、1477.61cm-1-1651.22cm-1
、1793.97cm-1-2075.60cm-1
、2110.33cm-1-2291.65cm-1
、2303.23cm-1-2650.45cm-1
、3016.96cm-1-3109.55cm-1
、3140.41cm-1-3244.58cm-1
、3395.04cm-1-3641.95cm-1
、3931.30cm-1-4077.91cm-1
、
4101.05cm-1-4232.23cm-1
、4274.66cm-1-4510.00cm-1
、4618.03cm-1-4810.93cm-1
、4861.08cm-1-5015.40cm-1
，每一段前后允许有两个波点的差距，结果发现模型中添加部分第一段与第二段水吸收区域后，模型可以达到最优效果，说明多不饱和脂肪酸的特征波段包含部分水吸收区域；
[0068]
3、模型参数的筛选确定
[0069]
模型参数包括预处理方法的参数以及算法的参数，本模型中所涉及到的diff2与diff1预处理方法无参数；主要参数为偏最小二乘回归算法的参数：主成分(n_component)，参数选择结果对比如下(部分)：
[0070]
根据对比结果，最终选择主成分(n_component)为5；
[0071]
经过比较分析，饱和脂肪酸的最佳回归模型为：diff2(二阶差分)+diff1(一阶差分)+plsr(n_component＝5)模型，训练集和测试集相关系数分别为0.8431和0.8308；训练集和测试集均方根误差分别为0.2776和0.2979。
[0072]
实施例4
[0073]
肉质多不饱和脂肪酸的中红外光谱(mir)的快速批量检测方法的应用：
[0074]
利用建立的多不饱和脂肪酸最佳回归模型(diff2(二阶差分)+diff1(一阶差分)+plsr(n_component＝5))对随机选取的5个外部肉质样本(非100份实验材料之一)进行预测，并将预测结果与真实值比较；
[0075]
1、采集肉质样本中的红外光谱中特征波段为：933.64cm-1-1049.38cm-1
、1053.23cm-1-1192.12cm-1
、1253.85cm-1-1415.89cm-1
、1477.61cm-1-1651.22cm-1
、1793.97cm-1-2075.60cm-1
、2110.33cm-1-2291.65cm-1
、2303.23cm-1-2650.45cm-1
、3016.96cm-1-3109.55cm-1
、3140.41cm-1-3244.58cm-1
、3395.04cm-1-3641.95cm-1
、3931.30cm-1-4077.91cm-1
、4101.05cm-1-4232.23cm-1
、4274.66cm-1-4510.00cm-1
、4618.03cm-1-4810.93cm-1
、4861.08cm-1-5015.40cm-1
中的mir数据；
[0076]
同时利用气相色谱法检测同批次肉质中的多不饱和脂肪酸真实值；
[0077]
2、将测定所得到的mir数据代入实施例3构建的diff2(二阶差分)+diff1(一阶差分)+plsr(n_component＝5)模型中，即可输出多不饱和脂肪酸含量的预测结果；
[0078]
该模型预测的结果与真实结果非常接近(如下表)，故该模型的准确性较高，可用于肉质的多不饱和脂肪酸含量预测；
[0079][0080]
本行业内技术人员只需按照其附带的使用说明书进行操作即可，而无需本领域的技术人员付出创造性劳动。
[0081]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、实验准备材料准备：选取国内11个省份肉市场猪肉120样品，运送至实验室；器材准备：电热恒温水浴锅、玻璃索氏提取器、安捷伦气相色谱仪，包括自动进样器、柱温箱、进样瓶、涡漩振荡器、针管过滤器、0.22μm尼龙滤膜、100m
×
0.25mm
×
0.2μm，毛细管色谱柱、氦气；s2、中红外光谱的采集将样品倒入圆形样品盘中，利用肉质快速检测仪进行光谱采集，具体采集步骤为：将肉样粉碎分批放入用于后续多不饱和脂肪酸的含量测定；s3、多不饱和脂肪酸含量的气相谱技术测定(1)、样品水解提取，称取均匀试样0.1g-10g(精确至0.1mg，约含脂肪100mg-200mg)移入到250ml平底烧瓶中，加入约90mg-110mg焦性没食子酸，加入几粒沸石，再加入2ml95％乙醇，混匀；(2)、脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化，在脂肪提取物中加入1％-3％氢氧化钠甲醇溶液8ml，连接回流冷凝器，80℃
±
1℃水浴上回流，直至油滴消失，从回流冷凝器上端加入7ml15％三氟化硼甲醇溶液，在80℃
±
1℃水浴中继续回流1min-3min，用少量水冲洗回流冷凝器，停止加热，从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温，准确加入10ml-30ml正庚烷，振摇1min-3min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层，吸取上层正庚烷提取溶液大约5ml，至25ml试管中，加入大约3g-5g无水硫酸钠，振摇1min，静置5min，吸取上层溶液到进样瓶中待测定；(3)、气相色谱仪器参数，色谱柱：100m
×
0.25mm
×
0.2μm，熔融石英毛细管柱，固定相：氰丙基-聚硅氧烷，载气：氦气，柱头压力：225kpa(175kpa-225kpa)，分流比：100：1，进样器温度：260℃-280℃，检测器温度：270℃-290℃，进样量：1μl，程序升温；(4)、将所有测得的9种多不饱和脂肪酸含量进行求和，则为单不饱和脂肪酸含量；s4、有效样本的选择120个样本中，剔除掉样本变质、损耗、中红外光谱测定异常、样本参考值测定异常等操作导致的无效数据，共剔除掉了20个异常样本，选择了100个样本进行模型的建立与优化。2.如权利要求1所述的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其特征在于，所述s1的材料准备中，120样品，每份肉样采集左半胴体背最长肌大约1斤，放到速冻袋子密封，依次编号，运回途中在肉样周围放置冰袋(2-4℃)防止变质。3.如权利要求1所述的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其特征在于，所述s3中从回流冷凝器上端加入7ml15％三氟化硼甲醇溶液，在80℃
±
1℃水浴中继续回流2min。4.如权利要求1所述的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其特征在于，所述s3中从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温，准确加入10ml-30ml正庚烷，振摇2min。5.如权利要求1所述的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其特征在于，所述s3中进样器温度：270℃，检测器温度：280℃。6.如权利要求1所述的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其特征在于，所述s3中加入约100mg焦性没食子酸。
7.如权利要求1所述的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其特征在于，所述s3中在脂肪提取物中加入2％氢氧化钠甲醇溶液8ml。8.如权利要求1所述的肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其特征在于，所述s3中程序温度：温度/℃：100、保留时间/min：13；温度/℃：100-180、保留时间/min：6、速率/℃/min：10；温度/℃：180-200、保留时间/min：20、速率/℃/min：1；温度/℃：200-230、保留时间/min：10.5、速率/℃/min：4。

技术总结
本发明涉及肉质中多不饱和脂肪酸检测的技术领域，特别是涉及一种肉质中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法，其实现了肉质中多不饱和脂肪酸含量的快速、准确、低成本的检测，实现了快速批量检测；包括以下步骤：S1、实验准备；S2、中红外光谱的采集；S3、多不饱和脂肪酸含量的气相谱技术测定(1)、样品水解提取；(2)、脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化；(3)、气相色谱仪器参数；(4)、将所有测得的9种多不饱和脂肪酸含量进行求和，则为单不饱和脂肪酸含量；S4、有效样本的选择。有效样本的选择。有效样本的选择。


技术研发人员：罗文学 段晓红 骆菲 张军辉 王贵江 倪俊卿 郭彦军 刘辉 刘廷玉 何旭
受保护的技术使用者：河北省畜牧良种工作总站（河北省种畜禽质量监测站）
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/7/19