一种获取高效表达Mccj25重组菌株的构建方法及其发酵工艺和应用与流程

一种获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法及其发酵工艺和应用
技术领域
1.本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一种获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法及其发酵工艺和应用。


背景技术：

2.在畜牧业日益发展的今天，由肠道致病菌导致的污染和细菌耐药性的快速扩散给畜牧业造成了重大损失，随着饲料禁抗这一损失也日趋严重。lasso peptide抗菌肽家族因其独特稳定的套索状结构和强大的抗菌能力，被研究人员普遍认为是开发替抗产品的优选对象。
3.mccj25是由其质粒携带的mcjabcd基因簇的大肠杆菌菌株产生的21个氨基酸残基组成的套索肽，属于lasso peptide抗菌肽家族，分子量约为2.1kda，其1-8号残基形成内酰胺大环，9-21号残基形成特殊尾巴贯穿大环，使其结构非常稳定。稳定的空间结构使得mccj25对酸碱、高温有很强的耐受性，对蛋白酶的耐受性也显著优于一般抗菌肽。mccj25的3号、5号残基可与细胞膜fhua受体结合，以分子间作用力打开细胞膜通道使细胞质外流；4号、7号、9号、10号、19号、21号残基可抑制胞内ran聚合酶，使其对包括致病性大肠杆菌，沙门氏菌和志贺氏菌在内的常见肠杆菌类致病菌表现出强大的杀灭作用。凡此诸多优点使mccj25拥有了作为抵抗细菌感染的新药的巨大潜质，但产量低下仍是制约其工业化生产的巨大障碍。
4.mcjabcd基因簇中，mcja基因编码结构蛋白及其前体，mcjbcd基因编码修饰蛋白、免疫转运蛋白(si jia pan等，2011)。在营养缺陷依赖型野生中，mcja的表达水平十分低下，导致最终mccj25的分泌表达水平低下。若通过基因工程技术将mcja基因的表达水平大幅提升，同时将mcjbcd基因的表达水平控制在一个合适范围而不过多地干扰宿主菌对mcja基因表达，则有可能实现最终mccj25表达量的突破性增长。
5.目前已有机构对原始基因簇和菌株改造，并已开发出数种相对高产菌株：申请号为cn201610985222.2的专利公开了一种高效表达microcin j25(mccj25)的工程菌株及其发酵工艺，用双质粒分别构建mcja和mcjbcd的表达框，共转化到大肠杆菌mc4100中，获得表达量为0.5g/l的重组菌株，保藏编号cgmcc no.12902。申请号为cn202110731403.3的专利公开了一种高效表达mccj25的工程菌及其发酵工艺，mcjabcd基因簇共用一个t7启动子，并将其克隆在载体pbr322中，转化入宿主菌大肠杆菌bl21(de3)后获得一株高效表达mccj25的工程菌，其表达量为4.1g/l。而鉴于以上所得菌株的表达量并不高，仍需对如何获得高表达工程菌作进一步研究。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法及其发酵工艺和应用。
7.本发明的技术内容如下：
8.本发明提供了一种获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
9.获取mccj25中mcjabcd基因簇的初始基因序列，对其mcja基因进行优化，之后将mcja基因和mcjbcd基因分别引入由诱导型强启动子介导和组成型启动子介导的大肠杆菌双表达框质粒中，获得重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌工程菌株中表达，即获得高效表达mccj25的重组菌株；
10.所述经密码子优化之后的mcja基因的核酸序列如seq id no.1所示，其导入质粒之后为通过诱导型强启动子介导；
11.所述mcjbcd基因导入质粒之后通过组成型启动子介导；
12.所述诱导型强启动子包括能被乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖等在内的廉价的工业原料诱导的启动子，包括t7启动子、arabad启动子，优选t7启动子；
13.所述组成型启动子为不需特殊条件便能使基因持续表达的启动子，包括j23119、ptac、p46，优选j23119；
14.所述大肠杆菌双表达框质粒包括petduet-1、pcoladuet-1、pcdfduet-1、prsfduet-1的一种，优选prsfduet-1；将上述大肠杆菌双表达框质粒中自带的其中一个t7启动子替换成上述组成型启动子，将另一个t7启动子保留或替换成arabad启动子，构建带有诱导型强启动子介导和组成型启动子介导的质粒
15.所述大肠杆菌工程菌株包括bl21(de3)、rosseta(de3)、top10的一种。
16.本发明还提供了一种获取高效表达mccj25重组菌株的发酵工艺，包括如下步骤：
17.1)发酵：将上述获得的高效表达mccj25的重组菌株接种到摇瓶培养基，获得摇瓶种子液，将其分别经过一级、二级发酵，之后放入发酵罐中进行诱导表达生产；
18.所述摇瓶培养基采用lb培养基，其组分包括酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l；
19.所述一级、二级发酵所采用的培养基组分包括酵母提取物5～10g/l，优选为10g/l；蛋白胨10～20g/l，优选为12g/l；kh2po43～5g/l，优选为5g/l；k2hpo
4 7～15g/l，优选为12.5g/l；一水葡萄糖10～20g/l，优选为20g/l；
20.所述发酵罐的培养基组分包括酵母提取物5～10g/l，优选为10g/l；蛋白胨10～20g/l，优选为10g/l；kh2po
4 3～5g/l，优选为3g/l；k2hpo47～15g/l，优选为15g/l；一水葡萄糖20～35g/l，优选为30g/l；硫酸铵3～5g/l，优选为3.5g/l；硫酸镁1～1.5g/l，优选为1.5g/l；硫酸钙3～5mg/l，优选为4mg/l以及诱导剂；
21.所述诱导剂包括乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖的一种，其用量分别为乳糖20～50g/l、低蛋白乳清粉30～60g/l、阿拉伯糖0.5～4g/l，优选低蛋白乳清粉50g/l；
22.发酵前段控制发酵ph≥5.8。
23.所述一级发酵的时间为7～9h，二级发酵的时间为4～5h；
24.所述发酵罐培养时间为12～18h，其中前5～8h是以葡萄糖为碳源的增菌阶段，后7～13h是以乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖为诱导剂的分泌表达阶段；
25.2)浓缩：将发酵罐中获取的发酵液经陶瓷膜设备去除菌体及大分子杂蛋白，之后经纳滤膜截留，去除多余的水和离子等小分子杂质，获取高浓度mccj25的浓缩液；
26.所述陶瓷膜的孔径为0.2～0.5μm；
27.所述纳滤膜规格为100～1000da。
28.本发明还提供了一种上述重组菌株获得的高效表达mccj25产物在制备液体剂型、可溶粉末剂型和不可溶粉末剂型的应用；
29.所述液体剂型的制备包括：往浓缩液中加入气相二氧化硅，进行高速分散处理，得到mccj25水剂产品；
30.所述气相二氧化硅的比表面积为200～400m2/g；
31.所述不可溶粉末剂型的制备包括：将浓缩液与二氧化硅和/或玉米芯粉以质量比为1：(2～3)混合，经干燥获得不溶产品；
32.所述可溶粉末剂型的制备包括：将浓缩液与可溶性粉末混合，经干燥获得可溶产品，所述可溶性粉末包括扶态粉、元明粉、β-环糊精、可溶性淀粉的一种以上，其用量分别占浓缩液的10～25wt％、10～20wt％、1～5wt％、2～10wt％。
33.本发明的有益效果如下：
34.本发明的获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法，将mccj25中的mcja基因优化，利用诱导型启动子与组成型启动子的结合，将mcja和mcjbcd基因同时引入同一个双表达框质粒中，使mcja基因和mcjbcd基因在同一个质粒和同一个宿主菌中的同时呈现不同水平表达，解决了现有技术中双质粒表达存在质粒干扰的问题，或者两段基因表达水平出现差异以及表达量偏低的问题；本发明通过对mcjabcd基因簇的强+弱启动调控，获取高效表达mccj25重组菌株，实现mccj25的高水平表达，利用乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖等诱导剂，实现对重组菌株的高水平诱导表达，表达量达3.53g/l，使得所形成的构建方法为mccj25的低成本、高水平工业化生产提供了思路；
35.本发明的获取高效表达mccj25重组菌株的发酵工艺，通过对菌株的发酵的优化，实现mccj25的高表达，表达量可高达5.2g/l，并且所得发酵产物可产品化，制备mccj25水剂型、可溶粉末剂型和不可溶粉末剂型，为mccj25的产品化奠定了基础。
附图说明
36.图1为petduet-1、pcoladuet-1、pcdfduet-1和prsfduet-1的质粒图谱；
37.图2为实施例1的24个双表达框质粒的构建示意图；
38.图3为重组菌株pcr鉴定产物凝胶电泳结果；
39.图4为重组菌株rosseta-pcdfd-t7a-jbcd
进行15t发酵罐中试发酵上清中mccj25含量图谱。
具体实施方式
40.以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定。
41.若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
42.实施例1
43.一种获取高效表达mccj25重组菌株的构建
44.1)获取mccj25中mcjabcd基因簇的初始基因序列，对其mcja基因进行优化，之后将
mcja基因和mcjbcd基因分别引入由诱导型强启动子介导和组成型启动子介导的大肠杆菌双表达框质粒中，可降低不同质粒在同一宿主菌时出现的相互干扰效应，即获得重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌工程菌株中表达，实现两段基因的不同水平表达，即获得高效表达mccj25的重组菌株；
45.所述经密码子优化之后的mcja基因的核酸序列如seq id no.1所示，其导入质粒之后为通过诱导型强启动子介导，所述诱导型强启动子包括能被乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖等在内的廉价的工业原料诱导的启动子，包括t7启动子、arabad启动子，优选t7启动子，有助于提高mccj25前提蛋白的表达量；
46.所述mcjbcd基因导入质粒之后通过组成型启动子介导，所述组成型启动子为不需特殊条件便能使基因持续表达的启动子，包括j23119、ptac、p46，优选j23119；
47.所述大肠杆菌双表达框质粒包括petduet-1、pcoladuet-1、pcdfduet-1、prsfduet-1的一种，质粒图谱分别如图1所示，优选prsfduet-1；将上述大肠杆菌双表达框质粒中自带的其中一个t7启动子替换成上述组成型启动子，将另一个t7启动子保留或替换成arabad启动子构成带有诱导型强启动子介导和组成型启动子介导的质粒；
48.所述大肠杆菌工程菌株包括bl21(de3)、rosseta(de3)、top10的一种。
49.根据以上构建方法，将所选取的诱导型强启动子、组成型启动子、大肠杆菌双表达框质粒、大肠杆菌工程菌进行构建，获得24个双表达框质粒(如图2所示为构建示意图)，然后将mcja基因和mcjbcd基因分别引入质粒中，获得24个双表达重组质粒，之后将由t7启动子介导的表达载体分别转入bl21(de3)和rosseta(de3)宿主菌中，由arabad启动子介导的表达载体转入top10宿主菌中；
50.将转化后的重组菌涂布于含卡那霉素或氨苄西林的抗性平板中进行筛选，获得36株对应的重组表达mccj25的工程菌(见表3)，挑取单菌落以p-f&p-r为鉴定引物，pcr反应体系如表1：
51.表1pcr鉴定体系
[0052][0053]
pcr反应程序为：预变性95℃
×
5min，变性95℃
×
30s，退火52℃
×
30s，延伸72℃
×
65s，重复30个循环，终延伸72℃
×
3min。
[0054]
如图3(其中m为dl2000 dna ladder marker、lane1为重组菌bl21(de3)-pet-t7a-j23119bcd
、lane2为重组菌bl21(de3)-pet-t7a-ptacbcd
、lane3为重组菌bl21(de3)-pet-t7a-p46bcd
、lane4为重组菌bl21(de3)-pcolad-t7a-j23119bcd
、lane5为重组菌bl21(de3)-pcolad-t7a-ptacbcd
、lane6为重组菌bl21(de3)-pcolad-t7a-p46bcd
、lane7为重组菌bl21(de3)-pcdfd-t7a-j23119bcd
、lane8为重组菌bl21(de3)-pcdfd-t7a-ptacbcd
、lane9为重组菌bl21(de3)-pcdfd-t7a-p46bcd
、lane10为重组菌bl21(de3)-prsfd-t7a-j23119bcd
、lane11为重组菌bl21(de3)-prsfd-t7a-ptacbcd
、lane12为重组菌bl21(de3)-prsfd-t7a-p46bcd
、lane13为重组菌rosseta(de3)-pet-t7a-j23119bcd
、lane14为重组菌rosseta(de3)-pet-t7a-ptacbcd
、lane15为重组菌rosseta(de3)-pet-t7a-p46bcd
、lane16为重组菌rosseta(de3)-pcolad-t7a-j23119bcd
、lane17为重组菌rosseta(de3)-pcolad-t7a-j23119bcd
、lane18为重组菌rosseta(de3)-pcolad-t7a-p46bcd
、lane19为重组菌rosseta(de3)-pcdfd-t7a-j23119bcd
、lane20为重组菌rosseta(de3)-pcdfd-t7a-ptacbcd
、lane21为重组菌rosseta(de3)-pcdfd-t7a-p46bcd
、lane22为重组菌rosseta(de3)-prsfd-t7a-j23119bcd
、lane23为重组菌rosseta(de3)-prsfd-t7a-ptacbcd
、lane24为重组菌rosseta(de3)-prsfd-t7a-p46bcd
、lane25为重组菌top10-pet-arabada-j23119bcd、
lane26为重组菌top10-pet-arabada-ptacbcd
、lane27为重组菌top10-pet-arabada-p46bcd
、lane28为重组菌top10-pcolad-arabada-j23119bcd
、lane29为重组菌top10-pcolad-arabada-ptacbcd
、lane30为重组菌top10-pcolad-arabada-p46bcd
、lane31为重组菌top10-pcdfd-arabada-j23119bcd
、lane32为重组菌top10-pcdfd-arabada-ptacbcd
、lane33为重组菌top10-pcdfd-arabada-p46bcd
、lane 34为重组菌top10-prsfd-arabada-j23119bcd、lane35为重组菌top10-prsfd-arabada-ptacbcd
、lane36为重组菌top10-prsfd-arabada-p46bcd
、lane37为阴性对照)所示，可见pcr鉴定结果为阳性，表明成功构建所述重组菌株。2)筛选高产重组菌株
[0055]
2.1)诱导型启动子诱导剂的选择
[0056]
选用250ml小摇瓶装50ml lb液体，灭菌后为增菌培养基备用，选取4个(a、b、c、d)；
[0057]
以表3所示构建的重组菌bl21(de3)pet-t7a-j23119bcd为测试菌株，将其单菌落分别接入上述4个备用小摇瓶中，37℃、120rpm培养8-10h，至菌液od
600
＝0.4～0.5；
[0058]
然后将终浓度为1mm的丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)接入a瓶中，将终浓度为50g/l的乳糖分2次(中间间隔3h)接入b瓶中，将终浓度为50g/l的低蛋白乳清粉(乳糖含量≥75％)分2次(中间间隔3h)接入c瓶中，d瓶不接诱导剂为对照组，诱导培养6h后，用hplc法检测a、b、c、d 4瓶培养液上清中mccj25的含量，结果如下表所示：
[0059]
表2不同诱导剂的重组菌株的表达量
[0060][0061][0062]
由表2可见，a瓶中mccj25的含量为2.83g/l；b瓶中mccj25的含量为2.66g/l；c瓶中mccj25的含量为2.62g/l；d瓶中mccj25的含量为0.15g/l。由此判定乳糖和低蛋白乳清粉
(乳糖含量≥75％)能在极大程度上代替iptg对t7启动子的诱导作用。以乳糖含量折算，低蛋白乳清粉的成本要明显低于乳糖的成本，故优选低蛋白乳清粉(乳糖含量≥75％)为t7启动子的廉价诱导剂。d瓶对照组未加诱导剂但mccj25也呈现一定量的表达，推测是由于t7启动子为松弛型启动子，存在渗漏表达现象。即在无诱导剂的情况下，其仍能介导目的基因进行一定水平的表达。
[0063]
2.2)高产重组菌株的筛选
[0064]
选用250ml小摇瓶装50ml lb液体，灭菌后为增菌培养基备用。将表3中的36株重组表达mccj25的工程菌分别接入36个上述备用小摇瓶中；
[0065]
以t7启动子进行诱导表达的24个重组菌株置于37℃、120rpm培养8-10h，至菌液od
600
＝0.4～0.5，将终浓度为50g/l的低蛋白乳清粉分2次(中间间隔3h)分别接入24个小摇瓶中进行诱导表达，6h后用hplc法检测24个小摇瓶培养液中mccj25的含量；
[0066]
以arabad启动子进行诱导表达的12个重组菌株置于37℃、120rpm培养4-6h，至菌液od
600
＝0.2-0.3，将终浓度为2g/l的阿拉伯糖进行诱导，6h后用hplc法检测12个小摇瓶培养液中mccj25的含量。
[0067]
表3不同重组菌株的表达量
[0068]
[0069][0070]
结果由表3可见，在所建立的36组重组菌株中，以arabad启动子诱导的菌株表达水平普遍低于t7启动子诱导的表达水平。而以t7启动子诱导的重组菌株中，含clodf13复制子的重组载体，在四种不同复制子的表达载体中表达量最高，其中以pcdfd-t7a-j23119bcd为表达载体，rosseta(de3)为宿主菌的重组工程菌rosseta-pcdfd-t7a-jbcd
表达量最高达3.53g/l，所以判断该菌株为表达mccj25的最优选菌株，后续发酵条件的优化和工艺探索均应用此菌株进行。
[0071]
实施例2
[0072]
一种获取高效表达mccj25重组菌株的发酵工艺
[0073]
2.1发酵工艺
[0074]
1)发酵：将上述获得的高效表达mccj25的重组菌株接种到摇瓶培养基，获得摇瓶种子液，将其分别经过一级、二级发酵，之后放入发酵罐中进行诱导表达生产；
[0075]
所述摇瓶培养基的组分包括酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l；
[0076]
所述一级、二级发酵所采用的培养基组分包括酵母提取物5～10g/l、蛋白胨10～20g/l、kh2po
4 3～5g/l、k2hpo
4 7～15g/l、一水葡萄糖10～20g/l；
[0077]
所述发酵罐的培养基组分包括酵母提取物5～10g/l、蛋白胨10～20g/l、kh2po
4 3～5g/l、k2hpo
4 7～15g/l、一水葡萄糖20～35g/l、硫酸铵3～5g/l、硫酸镁1～1.5g/l、硫酸钙3～5mg/l以及诱导剂；
[0078]
所述诱导剂包括乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖的一种，其用量分别为乳糖20～50g/l、低蛋白乳清粉30～60g/l、阿拉伯糖0.5～4g/l；
[0079]
2)浓缩：根据大肠杆菌分子量大小和发酵液中mccj25分子量大小，优选膜设备对发酵液进行去渣和浓缩，具体操作为：将发酵液导入陶瓷膜循环罐中，开启循环泵和输料泵，控制工作压力0.4～0.6mpa，待陶瓷膜透过液体积达发酵原液体积65％～80％时，往陶瓷膜循环罐中加入发酵原液25％～35％水，继续分离至陶瓷膜截留液占发酵原液体积的10％～20％，完成发酵原液的去渣工序，之后陶瓷膜透过液导入纳滤膜循环罐中，开启循环泵和增压泵，控制工作压力为0.5～3.0mpa，待纳滤膜透过液体积达陶瓷膜透过液体积的10％～20％时完成发酵液的浓缩工序，所得纳滤膜高浓度mccj25的浓缩液为发酵液的5～8
倍浓缩。
[0080]
2.2发酵工艺的优化
[0081]
优选摇瓶培养基的组分包括酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l；
[0082]
所述一级、二级发酵所采用的培养基组分包括酵母提取物10g/l、蛋白胨12g/l、kh2po
4 5g/l、k2hpo
4 12.5g/l、一水葡萄糖20g/l；
[0083]
以实验室30l发酵罐为反应容器，优选酵母提取物10g/l、蛋白胨10g/l、kh2po
4 3g/l、k2hpo
4 15g/l、一水葡萄糖30g/l、硫酸铵3.5g/l、硫酸镁1.5g/l、硫酸钙4mg/l、低蛋白乳清粉流加量30g/l为发酵基础配方；
[0084]
根据以上，对发酵酸碱度和诱导剂流加时间进行优化：
[0085]
1)发酵过程中酸碱度的控制
[0086]
当发酵ph低于5.6影响大肠杆菌生长，大肠杆菌代谢产品偏碱性，当发酵ph高于7.2会形成ph负反馈调节，不利于表达；由于以葡萄糖为碳源时培养基会逐渐酸化，而发酵后段随着代谢产物的累积，发酵液的ph会逐渐回升；本实施例以氨水为ph调节剂对发酵过程调节ph，特别是发酵前段ph进行调节。
[0087]
表4不同酸碱度对发酵的影响
[0088][0089]
由表4可见，本实施例中发酵后段ph逐渐回升，但都不会高于7.2；发酵前段控制ph≥5.8时，发酵液中mccj25含量最高达4.25g/l。
[0090]
2)诱导剂的流加量
[0091]
表5不同诱导剂流加量对发酵的影响
[0092][0093]
葡萄糖碳源利用完后，发酵do值和ph值出现极速上升，此时开始流加低蛋白乳清粉诱导表达。采用匀速流加的方式，在发酵终止前1h停止流加，结果由表5可见，低蛋白乳清粉流加总量为50g/l时，发酵液中mccj25含量最高达4.81g/l；继续增加流加量，发酵液mccj25含量无增加，所以判定低蛋白乳清粉流加总量50g/l为最优选。
[0094]
根据上述试验所得优选条件，利用大肠杆菌发酵放大优势效应，进行15t发酵罐中试生产试验，结果如图4所示，发酵液中mccj25含量最高达5.2g/l。
[0095]
因此，根据以上条件的优化，对本发明的重组菌株的发酵工艺中，所述摇瓶培养基的组分包括酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l；
[0096]
所述一级、二级发酵所采用的培养基组分包括酵母提取物5～10g/l，优选为10g/l；蛋白胨10～20g/l，优选为12g/l；kh2po43～5g/l，优选为5g/l；k2hpo
4 7～15g/l，优选为12.5g/l；一水葡萄糖10～20g/l，优选为20g/l；
[0097]
所述发酵罐的培养基组分包括酵母提取物5～10g/l，优选为10g/l；蛋白胨10～20g/l，优选为10g/l；kh2po
4 3～5g/l，优选为3g/l；k2hpo47～15g/l，优选为15g/l；一水葡萄糖20～35g/l，优选为30g/l；硫酸铵3～5g/l，优选为3.5g/l；硫酸镁1～1.5g/l，优选为1.5g/l；硫酸钙3～5mg/l，优选为4mg/l以及诱导剂；
[0098]
所述诱导剂包括乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖的一种，其用量分别为乳糖20～50g/l、低蛋白乳清粉30～60g/l、阿拉伯糖0.5～4g/l，优选低蛋白乳清粉50g/l；
[0099]
发酵前段控制发酵ph≥5.8。
[0100]
试验例
[0101]
重组菌株发酵产物的应用
[0102]
1.采用水剂防沉降工艺将实施例2发酵工艺所获得的浓缩液制成水剂半成品
[0103]
其难点在于浓缩液中的mccj25为大分子有机物，久置后大分子有机物会自然沉降到液体底部发生浓度分层现象，致使该水剂产品中的mccj25的浓度不均。气相二氧化硅因
其抗凝结作用，一般用于食品、化妆品类产品，罕见用于饲料及饲料添加剂产品。本试验例利用气相二氧化硅在溶液中高速分散后的防沉降效果，在上述纳滤膜浓缩液中加入0.5～2％气相二氧化硅(比表面积为200～400m2/g)，以线速度为20～45m/s的高速分散机处理，获得mccj25均匀分散液。用高效液相法检测所得静置分散液分时分点取样中mccj25的含量从而判定分散液中mccj25的均匀度，结果显示添加气相二氧化硅的分散液的防沉降时效是未添加组的15倍以上，防沉降时效达≥180天。
[0104]
2.采用气流干燥工艺将实施例2发酵工艺所获得的浓缩液制成粉剂型不可溶半成品
[0105]
所选赋形剂为玉米芯粉、脱脂米糠、二氧化硅中的一种或几种，此三种赋形剂(辅料)均因带有复杂的微孔结构而具备强大的吸附力，三者对水的吸附系数均≥2.0(m/m)。其中玉米芯粉、脱脂米糠为有机原料，受环境条件影响，易产生霉菌毒素类有害物质；而二氧化硅为无机原料，无此类弊端。本试验例选用80～200目颗粒状二氧化硅为赋形剂，与所得浓缩液按1:2～1:3(m/m)，优选1:2.5混合，混合后的物料呈半干湿沙状。用旋转闪蒸干燥设备或沸腾干燥设备处理该半干湿物料，进风温度设置110～140℃，出风温度控制在70～90℃范围。干燥所得为棕黄～棕灰色流动性良好的细沙状物料。将所得粉剂型物料与9倍、19倍质量的水充分混合，用高效液相法检测二组样不同混合时间下物料中mccj25的溶出率，如下表：
[0106]
表6不同混合时间(min)下物料中mccj25的溶出率(％)
[0107][0108][0109]
由表6可见，混合比例中水的含量越多、混合时间越长，有效成分mccj25的溶出率越高；在粉剂物料：水＝1:19(m/m)、混合160min时mccj25溶出率达98.9％，说明通过该干燥工艺获得的粉剂型半成品具备功能性添加剂的高溶出率特征。
[0110]
3.采用喷雾干燥工艺将实施例2发酵工艺所获得的浓缩液制成粉剂型可溶性半成品
[0111]
所选赋形剂为扶态粉、元明粉、β-环糊精、加益粉、可溶性淀粉等可溶性辅料。本试验例选用扶态粉和可溶型淀粉为赋形剂溶解于上述纳滤膜浓缩液，配成扶态粉含量为
12％、可溶性淀粉含量为5％的混合液。用蠕动泵将混合液导入喷雾干燥机中，设置进风温度为115～130℃，控制出风温度为80～90℃，收取的喷雾干燥粉末为易结块的淡黄色粉末。在辅料配方中加入1～2％的磷酸三钙为抗凝结剂，设置进风温度为120～140℃，控制出风温度为85～95℃，所得喷雾干燥粉末为淡黄～棕黄色流动性良好的粉末。将该粉末按不同比例(m/m)溶解于水中，溶解度如下表：
[0112]
表7不同粉末比例的溶解度
[0113][0114]
由表7可见，粉末质量在20g/100ml以下时，粉末均可完全溶解，静置过夜不产生沉淀；粉末质量为40g/100ml时溶解不完全，出现沉淀。静置过夜后的沉淀经离心干燥后称重，计算得常温下粉末溶解度为25％，说明经上述喷雾干燥工艺生产的粉末溶解度良好，具备水溶性产品高溶解度特特征。
[0115]
由以上试验例可表明本发明所获得的mccj25既可以开发成稳定保存的水剂产品，又可以开发成便于运输的水溶型粉剂和非水溶型粉剂产品，满足现在市场对于饲料添加剂类产品剂型的普遍要求，具有非常强的产品可塑性。上述试验例所述的应用工艺，为mccj25的产品开发奠定了基础。

技术特征：
1.一种获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：获取mccj25中mcjabcd基因簇的初始基因序列，对其mcja基因进行优化，之后将mcja基因和mcjbcd基因分别引入由诱导型强启动子介导和组成型启动子介导的大肠杆菌双表达框质粒中，获得重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌工程菌株中表达，即获得高效表达mccj25的重组菌株。2.根据权利要求1所述的获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法，其特征在于，所述经密码子优化之后的mcja基因的核酸序列如seq id no.1所示，其导入质粒之后为通过诱导型强启动子介导；所述诱导型强启动子包括能被乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖等在内的廉价的工业原料诱导的启动子，包括t7启动子、arabad启动子。3.根据权利要求1所述的获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法，其特征在于，所述mcjbcd基因导入质粒之后通过组成型启动子介导，所述组成型启动子为不需特殊条件便能使基因持续表达的启动子，包括j23119、ptac、p46。4.根据权利要求1所述的获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌双表达框质粒包括petduet-1、pcoladuet-1、pcdfduet-1、prsfduet-1的一种，优选prsfduet-1。5.根据权利要求1所述的获取高效表达mccj25重组菌株的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株包括bl21(de3)、rosseta(de3)、top10的一种。6.一种获取高效表达mccj25重组菌株的发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：1)发酵：将权利要求1所述构建方法获得的高效表达mccj25的重组菌株接种到摇瓶培养基，获得摇瓶种子液，将其分别经过一级、二级发酵，之后放入发酵罐中进行诱导表达生产；所述摇瓶培养基采用lb培养基；所述一级、二级发酵所采用的培养基组分包括酵母提取物5～10g/l、蛋白胨10～20g/l、kh2po
4 3～5g/l、k2hpo
4 7～15g/l、一水葡萄糖10～20g/l；所述发酵罐的发酵组分包括酵母提取物5～10g/l、蛋白胨10～20g/l、kh2po
4 3～5g/l、k2hpo
4 7～15g/l、一水葡萄糖20～35g/l、硫酸铵3～5g/l、硫酸镁1～1.5g/l、硫酸钙3～5mg/l以及诱导剂；所述诱导剂包括乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖的一种，其用量分别为乳糖20～50g/l、低蛋白乳清粉30～60g/l、阿拉伯糖0.5～4g/l；2)浓缩：将发酵罐中获取的发酵液经陶瓷膜设备去除菌体及大分子杂蛋白，之后经纳滤膜截留，去除多余的水和离子等小分子杂质，获取高浓度mccj25的浓缩液。7.一种权利要求6所述的高效表达mccj25重组菌株的发酵产物的应用，其特征在于，所述发酵产物用于制备液体剂型、可溶粉末剂型和不可溶粉末剂型。8.根据权利要求7所述的高效表达mccj25重组菌株的发酵产物的应用，其特征在于，所述液体剂型的制备包括：往浓缩液中加入气相二氧化硅，进行高速分散处理，得到mccj25水剂产品；所述气相二氧化硅的比表面积为200～400m2/g。9.根据权利要求7所述的高效表达mccj25重组菌株的发酵产物的应用，其特征在于，所述不可溶粉末剂型的制备包括：将浓缩液与二氧化硅和/或玉米芯粉以质量比为1：(2～3)混合，经干燥获得不溶产品。
10.根据权利要求7所述的高效表达mccj25重组菌株的发酵产物的应用，其特征在于，所述可溶粉末剂型的制备包括：将浓缩液与可溶性粉末混合，经干燥获得可溶产品，所述可溶性粉末包括扶态粉、元明粉、β-环糊精、可溶性淀粉的一种以上，其用量分别占浓缩液的10～25wt％、10～20wt％、1～5wt％、2～10wt％。

技术总结
本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一种获取高效表达Mccj25重组菌株的构建方法及其发酵工艺。将Mccj25中的mcjA基因优化，利用诱导型启动子与组成型启动子的结合，将mcjA和mcjBCD基因同时引入同一个双表达框质粒中，使mcjA基因和mcjBCD基因在同一个质粒和同一个宿主菌中的同时呈现不同水平表达，解决了现有技术中双质粒表达存在质粒干扰的问题，或者两段基因表达水平出现差异以及表达量偏低的问题；本发明通过对mcjABCD基因簇的强+弱启动调控，获取高效表达Mccj25重组菌株，实现Mccj25的高水平表达，利用乳糖、低蛋白乳清粉、阿拉伯糖等诱导剂，实现对重组菌株的高水平诱导表达。导表达。导表达。


技术研发人员：钟泽民 华国良 刘德辉
受保护的技术使用者：广东中山市茂辉生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/19