复合消化液及其制备方法和在分离鹿茸干细胞中的应用

1.本发明涉及组织工程技术领域，具体是复合消化液及其制备方法和在分离鹿茸干细胞中的应用。


背景技术：

2.鹿茸是目前所知的唯一能够完全再生的哺乳动物器官，且其生长速度可达2cm/d，鹿茸完全再生和快速生长能力主要由于鹿茸干细胞的存在。经鉴定，鹿茸干细胞为介于胚胎干细胞和间充质干细胞之间的一种特殊的干细胞类型，与目前所常用的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞等干细胞相比，鹿茸干细胞更易于获取，增殖速度快，分泌大量的细胞因子和生物活性因子。鹿茸干细胞能刺激人体细胞活跃充盈，剌激造血细胞繁殖，对人体骨髓造血、加速红细胞和血红蛋白的生成有着非常显著的作用；还可以修复人体神经细胞、血管干细胞、以及人体核心的器官组织细胞修复,改善细胞缺血坏死、促进新生细胞替代老化细胞的作用；以及促使人体不断自我修复，深度、快速提高免疫力,对人体预防血液系统疾病、造血性缺陷疾病、皮肤细胞增殖疾病、骨骼细胞增殖疾病有显著作用。
3.在鹿茸干细胞的分离实验过程中，需要使用消化酶对细胞进行消化，现有技术中，常采用单一的胶原酶进行消化，如ι型胶原酶或ⅱ型胶原酶等，而采用单一的胶原酶消化的速度较慢，进而影响鹿茸干细胞的分离效率。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种复合消化液及其制备方法和在分离鹿茸干细胞中的应用，以至少达到提高消化速度以及分离效率的目的。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
6.一种复合消化液，包括ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶。
7.作为本技术的一些可实施方式，所述ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶的体积比为1:1:1。
8.作为本技术的一些可实施方式，所述ι型胶原酶的工作浓度为200u/ml，所述ⅱ型胶原酶的工作浓度为150u/ml，所述ⅳ型胶原酶的工作浓度为150u/ml。
9.此外，为实现上述目的，本发明还提供了一种复合消化液的制备方法，将所述ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶混合均匀后，即得所述复合消化液。
10.作为本技术的一些可实施方式，过滤时，采用0.22μm滤膜过滤。
11.此外，为实现上述目的，本发明还提供了一种复合消化液在分离鹿茸干细胞中的应用。
12.作为本技术的一些可实施方式，所述分离鹿茸干细胞的方法包括如下步骤：
13.s1采集鹿骨膜组织，并用含有双倍双抗的pbs反复清洗，其后将清洗后的组织切成小组织块；
14.s2将所述小组织块转移到复合消化液中，并置于37℃水浴锅中消化20～25min，其
后于显微镜下观察，直至组织块出现毛刷样毛边时，停止消化，其后离心弃上清，得到第一沉淀；
15.s3向所述第一沉淀中加入基础培养基清洗，其后离心去上清，重复两次，得到第二沉淀；
16.s4向所述第二沉淀中加入完全培养基，对复合消化液进行中和，其后离心弃上清，得到第三沉淀，吸取第三沉淀并转移到培养皿中，其后加入完全培养基，并使第三沉淀贴壁，置于培养箱；第二天沿着培养皿壁加入所述完全培养基，仍要确保组织贴壁；第三天观察状态，若污染及时丢弃，若未污染则更换培养基继续培养，直至有细胞在组织“毛边”处贴壁生长，即得所述鹿茸干细胞。
17.作为本技术的一些可实施方式，所述复合消化液体积为所述小组织块体积的3～4倍。
18.作为本技术的一些可实施方式，所述完全培养基包括dmed basic、10％fbs和1％双抗。
19.本发明的有益效果是：
20.本发明首次将ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶这三种胶原酶进行复配以制得复合消化液，并首次确定了这三种胶原酶的活力及混合比例；相较采用单一的胶原酶，复合消化液能够更高效的对鹿茸生茸区骨膜组织进行消化，在消化过程中，出现毛边时间约20分钟，复合酶细胞在2-3天时已经大量爬出，因此，采用复合消化液能够节省消化时间，提高消化速率以及提高细胞分离效率。
附图说明
21.图1：ap骨膜组织图；
22.图2：组织块出现毛边示意图；
23.图3：实施例1中的组织细胞3天爬出量；
24.图4：对比例1中的组织细胞3天爬出量；
25.图5：对比例2中的组织细胞3天爬出量；
26.图6：对比例3中的组织细胞3天爬出量。
具体实施方式
27.下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
28.在鹿茸干细胞的分离实验过程中，需要使用消化酶对细胞进行消化，现有技术中，常采用单一的胶原酶进行消化，如ι型胶原酶或ⅱ型胶原酶等，而采用单一的胶原酶消化的速度较慢，进而影响鹿茸干细胞的分离效率。
29.基于此，本技术提供了一种复合消化液，包括ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶。
30.为了进一步提高复合消化液的消化效果，作为本技术的一些可实施方式，对每种
胶原酶的用量作出了进一步限定，即所述ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶的体积比为1:1:1。若不按照该比例混合，则在细胞培养的过程中会出现许多的组织碎片，细胞分离效率受到影响，对后续细胞分离后的生长状态也会有影响。
31.为了进一步提高复合消化液的消化效果，作为本技术的一些可实施方式，对每种胶原酶的用量作出了进一步限定，即所述ι型胶原酶的工作浓度为200u/ml，所述ⅱ型胶原酶的工作浓度为150u/ml，所述ⅳ型胶原酶的工作浓度为150u/ml。
32.此外，在配置复合消化液时，配置步骤要求简洁、高效且制备得到的复合消化液效率高，如此，在消化过程中，方能降低工作量以及节省成本。
33.基于此，本发明还提供了一种复合消化液的制备方法，将所述ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶混合均匀后，过滤，即得所述复合消化液。本发明中的复合消化液为现配现用，且制备工艺简单、快速，满足实际生产需求。
34.为了进一步提高复合消化液的消化效果，作为本技术的一些可实施方式，对复合消化液配置中的过滤孔径作出了进一步限定，即过滤时，采用0.22μm滤膜过滤。
35.此外，为实现上述目的，本发明还提供了一种复合消化液在分离鹿茸干细胞中的应用。
36.作为本技术的一些可实施方式，所述分离鹿茸干细胞的方法包括如下步骤：
37.s1采集鹿骨膜组织，并用含有双倍双抗的pbs反复清洗，其后将清洗后的组织切成小组织块；
38.s2将所述小组织块转移到复合消化液中，并置于37℃水浴锅中消化20～25min，其后于显微镜下观察，直至组织块出现毛刷样毛边时，停止消化，其后离心弃上清，得到第一沉淀；
39.s3向所述第一沉淀中加入基础培养基清洗，其后离心去上清，重复两次，得到第二沉淀；
40.s4向所述第二沉淀中加入完全培养基对复合消化液进行中和，其后离心弃上清，得到第三沉淀，吸取第三沉淀并转移到培养皿中，其后加入完全培养基，并使第三沉淀贴壁，置于培养箱；第二天沿着培养皿壁加入所述完全培养基，仍要确保组织贴壁；第三天观察状态，若污染及时丢弃，若未污染则更换培养基继续培养，直至有细胞在组织“毛边”处贴壁生长，即得所述鹿茸干细胞。
41.为了进一步提高复合消化液的消化效果，作为本技术的一些可实施方式，对复合消化液的用量作出了进一步限定，即所述复合消化液体积为所述小组织块体积的3～4倍。
42.为了进一步提高鹿茸干细胞的分离效果，作为本技术的一些可实施方式，所述完全培养基包括dmed basic、10％fbs和1％双抗。
43.下面结合具体实施方式对本技术所述鹿茸干细胞的分离步骤进行更进一步的详细说明。
44.实施例1
45.s1将新鲜鹿头组织剃毛后用保鲜膜包住，以防止毛掉落到细胞间污染操作环境；其后使用碘伏及酒精消毒后移入超净台，并使用柳叶刀及镊子取出生茸区骨膜(ap)组织，如图1所示；其后将组织移入含有双倍双抗的pbs的50毫升离心管中，经过反复清洗后，将组织块转移到小铡刀上用小案板挤压，切成条状，旋转组织条90度，按压小案板，切成大小均
匀的小组织块；
46.s2将所述小组织块转移到复合消化液中(胶原酶的体积为小组织块体积的3-4倍)，并置于37℃水浴锅中消化，每隔10min在显微镜下观察消化，直至组织块出现毛刷样毛边时，如图2所示，停止消化，并在1000r/min的条件下离心，其后弃上清，得到第一沉淀；
47.s3向所述第一沉淀中加入基础培养基(dmembasic)清洗，其后离心去上清，重复两次，
48.得到第二沉淀；
49.s4向所述第二沉淀中加入完全培养基(dmed basic+10％fbs+1％双抗)，对复合消化液进行中和，其后离心弃上清，得到第三沉淀，其后用剪去尖部的1毫升枪头吸取第三沉淀并转移到培养皿中，其后加入所述完全培养基，并使第三沉淀贴壁，置于培养箱；第二天沿着培养皿壁再加入所述完全培养基，仍要确保组织贴壁；第三天观察状态，若污染及时丢弃，若未污染则更换培养基继续培养，直至有细胞在组织“毛边”处贴壁生长，即得所述鹿茸干细胞。
50.上述复合消化液的制备方法为：将200u/ml的ι型胶原酶、150u/ml的ⅱ型胶原酶和150u/ml的ⅳ型胶原酶按照体积比为1:1:1进行混合配置，其后将配制好的混合液用0.22μm滤膜过滤，即得所述复合消化液。在整个配置过程中，需要严格控制无菌操作。
51.其中，第三天组织细胞爬出量如图3所示；步骤s2中消化时，出现“毛边”的时间为20-25min。
52.对比例1
53.相较实施例1，将复合消化液更改为ι型胶原酶，其余步骤及参数同实施例1。
54.其中，第三天组织细胞爬出量如图4所示；步骤s2中消化时，出现“毛边”的时间为40-45min。
55.对比例2
56.相较实施例1，将复合消化液更改为ⅱ型胶原酶，其余步骤及参数同实施例1。
57.其中，第三天组织细胞爬出量如图5所示，出现“毛边”的时间为40-45min。
58.对比例3
59.相较实施例1，将复合消化液更改为ⅳ型胶原酶，其余步骤及参数同实施例1。
60.其中，第三天组织细胞爬出量如图6所示，出现“毛边”的时间为40-45min。
61.通过实施例1、对比例1-4中的数据，以及图4-6比较可知：单纯采用一种胶原酶进行消化时，消化至出现毛边的时间较长，约40分钟，细胞爬出时间也延长，3-4天才少量爬出；而复合消化液消化过程中，出现毛边时间约20分钟，复合酶细胞在2-3天时已经大量爬出。以此可以获知：相较采用单一胶原酶，通过复合消化液进行消化的鹿茸干细胞用时短、细胞爬出速度快、效率高。
62.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种复合消化液，其特征在于，包括ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶。2.根据权利要求1所述的一种复合消化液，其特征在于，所述ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶的体积比为1:1:1。3.根据权利要求1所述的一种复合消化液，其特征在于，所述ι型胶原酶的工作浓度为200u/ml，所述ⅱ型胶原酶的工作浓度为150u/ml，所述ⅳ型胶原酶的工作浓度为150u/ml。4.一种如权利要求1-3任一项所述的复合消化液的制备方法，其特征在于，将所述ι型胶原酶、ⅱ型胶原酶和ⅳ型胶原酶混合均匀后、过滤，即得所述复合消化液。5.根据权利要求4所述的复合消化液的制备方法，其特征在于，过滤时，采用0.22μm滤膜过滤。6.一种如权利要求1-3任一项所述的复合消化液在分离鹿茸干细胞中的应用。7.根据权利要求6所述的复合消化液在分离鹿茸干细胞中的应用，其特征在于，所述分离鹿茸干细胞的方法包括如下步骤：s1采集鹿骨膜组织，并用含有双倍双抗的pbs反复清洗，其后将清洗后的组织切成小组织块；s2将所述小组织块转移到复合消化液中，并置于37℃水浴锅中消化20～25min，其后于显微镜下观察，直至组织块出现毛刷样毛边时，停止消化，其后离心弃上清，得到第一沉淀；s3向所述第一沉淀中加入基础培养基清洗，其后离心去上清，重复两次，得到第二沉淀；s4向所述第二沉淀中加入完全培养基对复合消化液进行中和，其后离心弃上清，得到第三沉淀，吸取第三沉淀并转移到培养皿中，其后加入完全培养基，并使第三沉淀贴壁，置于培养箱；第二天沿着培养皿壁加入所述完全培养基，仍要确保组织贴壁；第三天观察状态，若污染及时丢弃，若未污染则更换培养基继续培养，直至有细胞在组织“毛边”处贴壁生长，即得所述鹿茸干细胞。8.根据权利要求7所述的复合消化液在分离鹿茸干细胞中的应用，其特征在于，所述复合消化液体积为所述小组织块体积的3～4倍。9.根据权利要求7所述的复合消化液在分离鹿茸干细胞中的应用，其特征在于，所述完全培养基包括dmed basic、10％fbs和1％双抗。

技术总结
本发明公开了复合消化液及其制备方法和在分离鹿茸干细胞中的应用，属于组织工程技术领域；所述复合消化液包括Ι型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶；制备时，将Ι型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶混合均匀后过滤即可；本发明首次将Ι型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶这三种胶原酶进行复配以制得复合消化液，并首次确定了这三种胶原酶的活力及混合比例；相较采用单一的胶原酶，复合消化液能够更高效的对鹿茸生茸区骨膜组织进行消化，在消化过程中，出现毛边时间约20分钟，复合酶细胞在2-3天时已经大量爬出，因此，采用复合消化液能够节省消化时间，提高消化速率以及提高细胞分离效率。率。


技术研发人员：李吉萍 胡鹏飞
受保护的技术使用者：长春科技学院
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/19