玉米粒型基因及其应用

1.本发明涉及玉米粒型基因zmkw7，与粒型相关的分子标记，及其在筛选粒型性状和增加玉米粒重中的应用，属于分子遗传学领域。


背景技术：

2.玉米是我国重要的粮食和饲料作物，除此之外，还是医疗、化工和酿造等许多行业的不可或缺的原料，在我国国民经济中发挥重要的作用。玉米高产是单位面积穗数、穗粒数和粒重三个产量要素协调发展的结果，其中粒重是决定产量的最后一个因素，而且由于粒重的降低无法得到另外两个产量要素的补偿，因此在高产育种中具有意义。因此，对玉米粒重遗传机制的剖析不仅有助于理解玉米产量遗传基础，而且对玉米高产遗传改良具有重要的现实意义。
3.粒重性状的遗传基础备受关注，尽管国内外许多科学家已对玉米粒重进行了大量qtl定位研究，但大部分已初定位的粒重qtl遗传稳定性差，受环境稳影响较大，对粒重贡献率低，难以利用。据统计目前玉米中已公布的qtl共有1735个，其中粒重相关qtl不到10％(maizegdb，http://www.maizegdb.org)。玉米粒型，包括粒长、粒宽、粒厚等性状，是决定粒重的重要因素。定位控制粒型的遗传位点和基因对于研究粒型的调控机制、改良粒型性状、提高产量具有重要意义。虽然已经有一些影响玉米粒型的基因(如zmgs3、zmgw2等)被鉴定出来，但是由于粒型性状调控机制的复杂性，更多的能够影响粒型和粒重的遗传位点或基因有待被鉴定，并应用于玉米遗传改良。
4.为解决上述问题，本发明提供了一个通过精细定位克隆的、影响玉米粒型和粒重的基因zmkw7，并鉴定到与粒型或粒重相关的分子标记，利用上述基因、标记可以筛选玉米粒型或粒重性状，并培育粒重增加的玉米品种，从而提高玉米产量。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一个影响玉米粒型性状的基因zmkw7的核酸序列及其编码的氨基酸序列。
6.本发明的目的之二在于提供了一个与玉米粒型性状相关的分子标记。
7.本发明的目的之三在于公开一种利用分子标记鉴定和筛选玉米粒型性状的方法。
8.本发明的目的之四在于公开一种改良玉米粒型，增加玉米粒重的方法。
9.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.本发明提供了一种基因在调控玉米粒型性状中的应用，其特征在于：上述基因序列如seq id no.2-seq id no.3任意一个所示。
11.本发明还提供了一种分子标记，其特征在于，上述标记位于seq id no.2所示序列第5197位碱基，呈t[c]多态性。
[0012]
本发明还提供了上述分子标记的检测方法，其特征在于，上述的分子标记的检测方法采用竞争性等位基因特异性pcr方法。
[0013]
在一些实施方案中，上述竞争性等位基因特异性pcr扩增采用的引物对由引物f1、f2和引物r组成，其中引物f1的核苷酸序列为5'-gaaggtgaccaagttcatgcttcagggatagatccaattgg-3'，引物f2的核苷酸序列为5'-gaaggtcggagtcaacggatttcagggatagatccaattga-3'，引物r的核苷酸序列为5'-ttttgagatgtcgcaggttt-3'。
[0014]
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定玉米粒型性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测待测材料中上述的分子标记；(2)如果检测结果为t，待测材料将表现大粒型性状；如果检测结果为c，待测材料将表现小粒型性状。
[0015]
本发明还提供了增加玉米粒重的方法，其特征在于，在待改良玉米材料中提高seq id no.1所示蛋白的表达和/或活性，选择玉米粒重增加的植株。
[0016]
在一些实施方案中，上述增加蛋白表达的方法为使用高活性启动子(例如，ubiquitin、actin、35s等组成型启动子)驱动编码蛋白的核酸分子表达。
[0017]
在一些实施方案中，上述的高活性启动子为玉米ubiquitin启动子。
[0018]
在一些实施方案中，上述的玉米ubiquitin启动子序列如seq id no.4所示，上述的核酸分子序列如seq id no.2所示。
[0019]
本发明还提供了上述的分子标记、方法在玉米粒型育种中的应用。
[0020]
与现有的技术相比，本发明的有益效果是，本发明提供的zmkw7基因及其编码的蛋白具有调控玉米粒型性状的功能，该基因的功能是之前的公开资料中未报道的。本发明提供了与粒型性状相关的zmkw7基因上的功能性分子标记，以及标记的检测方法，能够从玉米群体中特异地鉴定出具有不同粒型表现的基因型，并对玉米品种的粒型性状进行辅助鉴定和改良。本发明还提供了利用基因工程手段增加玉米粒重，提高产量的方法。
附图说明
[0021]
图1玉米粒型qtl的定位结果。上部：在玉米第7号染色体上的全基因组关联信号。黑色虚线代表全基因关联分析显著性的阈值；hkw：百粒重；kl：粒长。下部：snp标记对群体重组单株的基因型鉴定结果及据此精细定位的区间和基因位置。p12～snp21：snp标记位置；r-1～r-5：重组株系；sk：sk材料的基因型；zheng58：郑58材料的基因型；heterozygous：杂合基因型。
具体实施方式
[0022]
提供以下定义和方法用以更好地界定本技术以及在本技术实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
[0023]
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常
接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
[0024]
术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。
[0025]“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组dna构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。
[0026]“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。
[0027]
在本技术中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。
[0028]
阴性或对照植物可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。
[0029]
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，
wahl(1984)anal.biochem.138:267-284的公式：tm＝81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％甲酰胺)-500/l；其中m是一价阳离子的克分子浓度，％gc是dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而l是杂合体的碱基对长度。tm是(确定的离子强度和ph下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使tm降低约1℃；因而，可以调节tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和ph下的特异序列及其互补序列的tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述tm低11℃下进行杂交和/或清洗。
[0031]
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本技术涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本技术还包括源于本技术的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本技术的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。
[0032]
在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(pcr)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(lcr)以及基于rna聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。
[0033]
当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“关联”。
[0034]
本文所用术语“数量性状基因座”或“qtl”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。qtl能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。
[0035]
本文所用术语“qtl定位”指采用类似单基因定位的方法将qtl定位在遗传图谱上，确定qtl与遗传标记间的距离(以重组率表示)。根据标记数目的不同，可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同，可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及最大似然法等。根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作
图。此外，还有将不同方法结合起来的综合分析方法，如qtl复合区间作图(cim)多区间作图(mim)、多qtl作图、多性状作图(mtm)等。
[0036]
本文所用术语“分子标记”指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性dna片段。
[0037]
本文所用术语“主效基因”指由单个基因决定某一性状的基因称为主效基因，本文所述术语“微效基因”指对于同一性状的表型来讲，几个非等位基因中的每一个都只有部分的影响，这样的几个基因称为累加基因或多基因。在累加基因中每一个基因只有较小的一部分表型效应，所以又称为微效基因。
[0038]
本文所用术语“自交系”指在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系。
[0039]
本文所用术语“回交”指子一代和两个亲本的任一个进行杂交的方法。
[0040]
本文所用术语“杂交”或“杂交的”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。
[0041]
本文所用术语“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。初始杂交产生f1代；然后，术语“bc
1”指轮回亲本的第二次使用，“bc
2”指轮回亲本的第三次使用等。
[0042]
本文所用术语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cm)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低、优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。
[0043]
厘摩(“cm”)是重组频率的量度单位。1cm等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。
[0044]“有利等位基因”是在特定位点的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如提高的玉米粒型，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的“有利”等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。
[0045]“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。就每个基因图谱而言，基因座之间的距离通过它们间的
重组频率进行测量，并且基因座之间的重组可使用多种标记进行检测。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的基因座。
[0046]“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。
[0047]“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。
[0048]“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。
[0049]
术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。
[0050]“种质”指个体(例如植株)、一组个体(例如植株品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。
[0051]“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异或多态性。对于分子标记，这意味着dna水平的差异是由于多核苷酸序列差异(例如ssr、rflp、flp和snp)。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件或转座因子的存在和序列。分子标记可来源于基因组或表达的核酸(例如est)，并且也可指用作探针或引物对的核酸，所述引物对能够通过使用基于pcr的方法扩增序列片段。
[0052]
对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如dna测序、基于pcr的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(rflp)、同工酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ash)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(ssr)、单核苷酸多态性检测(snp)或扩增片段长度多态性检测(aflp)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(est)和来源于est序列的ssr标记以及随机扩增的多态性dna(rapd)。
[0053]“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。
[0054]“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另一种选择，在某些方
snp50 beadchip获得的56110个snps(pan et al,2016)，使用winqtlcart2.5中的复合区间作图法(composite interval mapping,cim)进行数据分析，步速为0.5cm，阈值为2.5。分析结果显示，玉米第7染色体上存在着信号峰值，可能是影响玉米粒型的遗传位点。
[0064]
(2)关联分析。
[0065]
进一步对玉米粒型qtl进行关联分析和精细定位。关联分析的基因型数据使用已有的1.25m snps(详见：liu h,luo x,niu l,et al.distant eqtls and non-coding sequences play critical roles in regulating gene expression and quantitative trait variation in maize[j].molecular plant,2017,10(3):414-426.)。关联分析所用表型数据为每年2个重复的均值(见表1)，所用模型为tassel3.0软件中的混合线性模型，该模型可同时控制群体结构和亲缘关系对关联结果的影响。所用标记最小等位基因频率(minor allele frequency,maf)≥0.05。通过对5个重组近等基因系(r-1～r-5)的基因型分析结果显示，候选基因位于第7染色体位于160.60-163.97mb的11kb区间内，在近等基因系nil
sk
和nil
zheng58
中对11kb的候选区段进行重测序分析，并查询玉米参考基因组数据库，发现该区间内仅有一个有功能注释的基因zm00001d021956(基因定位过程示意图见图1，定位时使用的标记信息见表2)。根据玉米参考基因组上的注释信息，zm00001d021956(命名为zmkw7)编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，基因组序列如seq id no.2所示，cds编码区序列如seq id no.3所示，基因功能注释为gnat-transcription factor33。gnat是生物体中一个非常庞大的转录因子家族，并无公开资料显示该基因与玉米粒型性状相关。
[0066]
表1关联分析使用的不同基因型株系的性状数据
[0067][0068]
表2基因定位过程中使用的分子标记信息
[0069][0070][0071]
实施例2玉米粒型基因的功能验证
[0072]
为了进一步验证候选基因的功能，利用crispr-cas9基因编辑系统，对定位到的zmkw7进行敲除，并通过敲除后玉米的粒型表型判断基因和性状的关系。利用在线软件crispr-p 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)在基因上选取两个靶标tcgtggtggtcatctccagc和
[0073]
gtatttattctggcgagcaa编辑位点设计grna。合成“u6promoter1-grna1-sgrna-u6 promoter2-grna2-sgrna”融合单元序列，利用双酶切体系将其从中间载体puc57上切下，并通过同源重组的方法将酶切片段连接到骨架载体cpb-zmubi-hspcas9上(使用的编辑载体骨架与cn112375130a专利中的编辑载体骨架相同)。将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞dh5α，检测目标序列，序列检测无误后进行基因遗传转化玉米自交系kn5585。对获得的t0代转化植株，检测两个靶标位点，根据测序序列分析编辑类型。分析结果表明，zmkw7有两种编辑类型，一种缺失3个碱基，导致一个氨基酸缺失(ko1)；另一种一个碱基缺失，导致翻译提前终止(ko2)。分析两个编辑材料的粒型性状发现，基因敲除后粒长、粒宽、百粒重等粒型相关性状均降低(表3)。以上结果表明，zmkw7正向调控玉米籽粒大小。
[0074]
表3基因编辑材料的粒型鉴定结果
[0075][0076]
实施例3通过超表达方式改良玉米粒型性状
[0077]
由于zmkw7是一种正向调控玉米籽粒大小的基因，因此可以通过超表达基因的方式改良玉米粒型性状，提高玉米产量。具体方法如下：
[0078]
首先分段扩增全长基因序列(如seq id no.2所示)，再利用clonexpress ii试剂盒(www.vazyme.com)将扩增序列重组到载体pcambia上，构建好的载体目标全长基因序列前是玉米泛素基因启动子ubiquitin(序列如seq id no.4所示)，使用的终止子是常用的nos终止子。重组载体转化至大肠杆菌感受态dh5α菌株，获得阳性克隆，目标序列检测无误后转化玉米自交系kn5585。确认转基因植株zmkw7基因表达量比受体对照提升后，通过调查超表达材料的百粒重性状，发现zmkw7基因超表达能够显著增加玉米百粒重。因此，超表达zmkw7基因可以用来提高玉米产量。
[0079]
实施例3分子标记开发及检测
[0080]
本发明进一步分析了zmkw7基因在郑58和sk材料中的表达和序列差异，结果显示，该基因在两个材料不同组织中的表达量没有显著差异，表明该基因不是通过表达量来调控表型；然而，这个基因在最后一个外显子上(seq id no.2所示序列第5197位)存在单个snp的差异(t》c)，导致该编码位置氨基酸由丝氨酸变成脯氨酸(ser》pro)，这是两个材料粒型存在差异的直接原因。
[0081]
由于目标基因最后一个外显子单个snp变异(命名为s1)会显著影响玉米百粒重性状，因此可以开发为分子标记检测方法以用于辅助筛选玉米自交系百粒重性状。
[0082]
基于单个snp变异的序列，本发明开发了一个可用的竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele-specific pcr，kasp)标记检测方法。kasp标记检测以s1所在碱基处上游20bp序列作为左引物s1f，s1的碱基分别作为左引物的第20个碱基，该snp位点获得2条左引物s1f1/s1f2。再使用引物设计网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在固定左引物f的情况下，通过primer blast获得右引物r，产物大小控制在60-80bp之间；左引物f1、f2前段分别需要加上接头序列a1、a2(a1：gaaggtgaccaagttcatgct，a2：gaaggtcggagtcaacggatt)序列获得扩增引物f1、f2。具体地，检测s1位点的f1、f2和r引物序列分别是：f1：5'-gaaggtgaccaagttcatgcttcagggatagatccaattgg-3'，f2：5'-gaaggtcggagtcaacggatttcagggatagatccaattga-3'，r：5'-ttttgagatgtcgcaggttt-3'。
[0083]
选用ultrpage纯化方式对引物进行纯化。使用上述引物进行kasp标记检测的步骤如下：
[0084]
(1)玉米基因组dna提取：
[0085]
1.取玉米叶片1.5g左右于液氮中研磨，转入2ml离心管中。
[0086]
2.加预热至65℃的ctab提取缓冲液750μl，迅速混匀。在65℃水浴锅内水浴30分钟左右，中途不时小心柔和摇动2-3次离心管。
[0087]
3.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，在摇床上摇动试管10分钟，直到
溶液分层，下层为墨绿色，上层为浅黄色。
[0088]
4.室温12000rpm离心10分钟，将上清转移到1.5ml离心管中。
[0089]
5.向上清液中加入2/3体积预冷的异丙醇，小心混匀。放入-20度冰柜中放置30分钟。
[0090]
6.然后4℃，12000rpm离心10分钟。
[0091]
7.倒去上清液体，再加入1ml的75％乙醇，浸泡5分钟。再重复洗涤一次。然后将液体倒去，将离心管子放置30min，在常温吹干，加200μl水溶解dna。
[0092]
8.用1％琼脂糖检测dna质量，并测定dna浓度。dna放置在-20℃冰箱备用。
[0093]
(2)pcr反应：
[0094]
将引物干粉溶解，f1、f2引物浓度为36μm，r引物浓度为90μm，将三种引物按体积比1:1:1混匀作为primer mix备用。pcr扩增体系：模板dna 5μl，kasp pcr mix 5μl，primer mix 0.14μl，补水至10μl。pcr扩增程序：94℃15min 1cycle；94℃20s；61-55℃60s(-0.6℃/cycle)10cycles；94℃20s 1cycle；55℃60s，30cycles。
[0095]
(3)结果分析：
[0096]
扩增结束后使用荧光定量仪读取信号，程序如下：25℃5s+plate read。读带完成后，选定荧光类型fam、hex、rox，选择allelic discrimination进行分析。
[0097]
对532份关联群体材料使用s1-kasp标记引物(f1、f2和r引物序列如上所示)，利用上述方法对这些自交系材料的s1位点进行检测。结果显示，s1位点的检测结果能够很好地区分这些材料的粒型和百粒重性状(表5)，可以用于粒型性状的辅助选择。
[0098]
表5对部分材料的s1标记分型结果
[0099][0100]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种基因在调控玉米粒型性状中的应用，其特征在于：所述基因序列如seq id no.2-seq id no.3任意一个所示。2.分子标记，其特征在于，所述标记位于seq id no.2所示序列第5197位碱基，呈t[c]多态性。3.权利要求2所述分子标记的检测方法，其特征在于，所述的分子标记的检测方法采用竞争性等位基因特异性pcr方法；任选地，所述竞争性等位基因特异性pcr扩增采用的引物对由引物f1、f2和引物r组成，其中引物f1的核苷酸序列为5'-gaaggtgaccaagttcatgcttcagggatagatccaattgg-3'，引物f2的核苷酸序列为5'-gaaggtcggagtcaacggatttcagggatagatccaattga-3'，引物r的核苷酸序列为5'-ttttgagatgtcgcaggttt-3'。4.一种鉴定或辅助鉴定玉米粒型性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测待测材料中权利要求2所述的分子标记；(2)如果检测结果为t，待测材料将表现大粒型性状；如果检测结果为c，待测材料将表现小粒型性状。5.增加玉米粒重的方法，其特征在于，在待改良玉米材料中seq id no.1所示蛋白的表达和/或活性，选择玉米粒重增加的植株；任选地，所述增加蛋白表达的方法为使用高活性启动子驱动编码蛋白的核酸分子表达；任选地，所述的高活性启动子为玉米ubiquitin启动子；任选地，所述的玉米ubiquitin启动子序列如seq id no.4所示，所述的编码蛋白的核酸分子序列如seq id no.2所示。6.权利要求2至权利要求5所述的分子标记、方法在玉米粒型育种中的应用。

技术总结
本发明涉及玉米粒型基因ZmKW7，与粒型相关的分子标记，及其在筛选粒型性状和增加玉米粒重中的应用，属于分子遗传学领域。本发明公开了玉米粒型基因ZmKW7，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3任意一个所示；所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时，本发明还公开了与粒型性状相关的分子标记以及该标记的检测方法。进一步地，本发明提供了鉴定或辅助鉴定玉米粒型性状和增加玉米粒重的方法。加玉米粒重的方法。加玉米粒重的方法。


技术研发人员：李会楠 刘杰 罗芸 姜程淋 卢刚 蓝柳 郭欢 严建兵
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.02.24
技术公布日：2023/7/19