一种人血液病样本的冻存优化方法及利用人血液样本建立PDX动物模型的方法

一种人血液病样本的冻存优化方法及利用人血液样本建立pdx动物模型的方法
技术领域
1.本发明属于pdx模型构建技术领域，具体涉及一种人血液病样本的冻存优化方法及利用人血液样本建立pdx动物模型的方法。


背景技术：

2.白血病是一种血液系统恶性肿瘤疾病，其发病率及致死率高居不下，具有复发难治的特点。传统的化疗治疗方法以及一些靶向药物的出现，能够提高部分白血病的治愈率，但是复发难治依旧是白血病存在的主要问题。
3.病人来源的异种移植pdx(病人来源组织异体移植，patient-derived xenograft)动物模型是指将病人来源的肿瘤组织移植到免疫缺陷动物体内，进而构建出人源化的动物模型，该模型可良好的保留肿瘤的异质性，还原病人体内的肿瘤微环境，模拟肿瘤的发展跟转移，从而真实反映出肿瘤对于药物的应答。pdx被认为是临床治疗方案选择以及药物筛选、精准治疗的重要工具。
4.第一个急性髓系白血病的pdx模型建立于40年前，近年来白血病pdx模型不断发展改进。通过使用免疫程度更高的免疫缺陷老鼠，如nsg小鼠等，以及改良的表达人源细胞因子的免疫缺陷老鼠来提高建立pdx模型的成功率。
5.白血病pdx模型的建立仍旧存在很多挑战：pdx建立成功率低、造模时间久等。例如，建立pdx小鼠模型时，通常提前2-6h使用2-2.5gy的x射线预处理免疫缺陷小鼠，在注射细胞后5-23周可完成pdx模型的建立，但成功率只有10％左右(参见，d.j.pearce et al,blood 103:1166-73(2006))。
6.由于白血病病人样本来自于临床医院，可能存在病样获取时间太晚或者医院距离动物平台很远等原因，pdx模型无法及时建立；冻存稀缺和珍贵的白血病病人样本也非常重要。同样，实现病人样本跨省的长距离运输也有很强的冻存需求。但是，目前对于人源白血病样本的保存通常使用含有二甲基亚砜的胎牛血清来保存，复苏后细胞存活率只有36％左右，且活力较低(参见，例如，p.bourgoin et al,future microbiology 16:955-966(2021))。如何能保证长期冻存人源白血病样本的高复苏存活率是当前的重要科学问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种通过优化改进人血液病样本的冻存方法并且优化改进建立pdx动物模型的方法。采用本方法，可以实现白血病病人样本长时间保存，并且经复苏后的白血病细胞能构建pdx动物模型，具有造模时间短且成模率高的特点。
8.本发明提供了一种对人血液病样本进行冻存的优化方法，包括以下步骤：将人血液病样本与不含二甲基亚砜的细胞冻存液混合，置于-80℃环境中12～16h后，转移至液氮中长期保存。
9.优选的，所述人血液病样本与不含二甲基亚砜的细胞冻存液的体积比为(2:1)～
(1:4)。
10.优选的，所述不含二甲基亚砜的细胞冻存液包括购自funakoshi的货号为cpl-a1的细胞冻存液、thermo fisher的货号为12648010的细胞冻存液或上海七纯生物科技有限公司的货号为yc0100的细胞冻存液。
11.优选的，所述人血液病样本包括白血病和白血病相关血液疾病的不经单核细胞分离的全血液样本。
12.本发明还提供了一种利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法，包括以下步骤：将利用上述对人血液病样本进行冻存的优化方法进行长期保存的冻存样本复苏，与动物骨髓内细胞混合后注射入经过抑制宿主造血系统预处理的免疫缺陷动物中，得到人血液病pdx动物模型；或将新鲜人血液病样本分离白细胞后，与动物骨髓内细胞混合后注射入经过抑制宿主造血系统预处理的免疫缺陷动物中，得到人血液病pdx动物模型。
13.优选的，复苏后的细胞与动物骨髓内细胞的混合数量比为(1
×
104～1
×
107)：(1
×
104～1
×
106)。
14.优选的，所述抑制宿主造血系统的预处理方法包括白消安预处理。
15.优选的，所述白消安预处理包括注射白消安，注射量为10mg/kg～100mg/kg。
16.优选的，所述免疫缺陷动物包括无胸腺裸鼠、ncg、nsg、scid小鼠、cba/n小鼠、nod/scid小鼠、sdrg大鼠的rag1和il-2rγ基因双敲除突变大鼠。
17.本发明还提供了上述人血液病样本进行冻存的优化方法或上述利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法在提高人血液病样本pdx动物模型建模成功率中的应用。
18.有益效果：本发明提供了一种对人血液病样本进行冻存的优化方法，利用不含二甲基亚砜的细胞冻存液，可以实现长期保存白血病以及其他血液相关疾病病人的原始样本细胞，可以解决远距离病人样本运输的问题。本发明还改进人血液病样本建立pdx动物模型的方法，且使用该方法可利用冻存样本建立pdx模型，使用该方法不仅可以解决对于白血病以及相关血液疾病病人样本的长期保存问题，而且可以使用该方法进行跨省以及国际的长距离运输；经实施例证实，使用少量冻存复苏的白血病以及其他血液相关疾病病人样本细胞就可以快速建立pdx动物模型，成模率达90％以上，并且造模时间段，一般在8-12周左右便可成功建立白血病以及其他血液相关疾病的pdx动物模型。利用本发明提供的所述pdx动物模型可以追踪同一病人不同时间段的病理特征以及肿瘤干细胞的变化特征以及转移情况。为白血病以及其他血液相关疾病药物研发以及为病人制定治疗方案提供技术基础。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为利用病人新鲜白血病样本建立小鼠pdx模型的结果图，其中a为建立pdx模型流程图；b为小鼠外周血检测图，注射1
×
106人源白血病细胞后，4周、8周、12周时小鼠尾静脉取血，裂解红细胞后用aceanovocyte流式细胞仪进行检测；c为pdx模型流式分析结果图，12周后将小鼠安乐处死，将细胞从pdx小鼠骨髓中冲出、将小鼠脾脏研磨，使用1
×
106的细
胞使用acea novocyte流式细胞仪进行检测；mcd45，鼠源白细胞；d为免疫缺陷小鼠、病人样本和pdx模型吉姆萨染色对比结果图，分别采取ncg小鼠，pdx小鼠模型的外周血，以及使用新鲜病人样本进行吉姆萨染色，箭头所指分别为病人样本白血病细胞，免疫缺陷小鼠外周血白细胞，以及pdx小鼠模型外周血白血病细胞；e为免疫缺陷小鼠、pdx模型肝脏苏木精-伊红染色对比结果图，取ncg小鼠，12周后pdx小鼠模型的肝脏，经过福尔马林固定后使用苏木精-伊红染色，箭头所指为浸润到肝脏内的白血病细胞；
21.图2为优化的病人白血病样本冻存方法流程图；
22.图3为冻存pdx脾脏细胞与新鲜pdx脾脏细胞的白细胞存活率对比结果图，将冻存12个月的细胞复苏后，使用1
×
106的细胞使用aceanovocyte流式细胞仪进行检测，与相同pdx小鼠模型来源的新鲜脾脏细胞进行对比，7-aad用于标记细胞死活；
23.图4为利用冻存一年的pdx脾脏细胞样本建立传代移植小鼠模型的结果图，其中a为小鼠外周血检测图，注射1
×
106pdx脾脏细胞后，4周、8周、12周时小鼠尾静脉取血，裂解红细胞后用aceanovocyte流式细胞仪进行检测；b为pdx模型流式分析结果图，12周后将小鼠安乐处死，将细胞从pdx小鼠骨髓中冲出、将小鼠脾脏研磨，使用1
×
106的细胞使用aceanovocyte流式细胞仪进行检测；c)为免疫缺陷小鼠、病人样本和pdx模型吉姆萨染色对比结果图，分别采取ncg小鼠，pdx小鼠模型的外周血，以及使用新鲜病人样本进行吉姆萨染色，箭头所指分别为病人样本白血病细胞，免疫缺陷小鼠外周血白细胞，以及pdx小鼠模型外周血白血病细胞；
24.图5为利用冻存一年的病人白血病样本建立小鼠pdx模型的结果图，其中a为小鼠外周血检测图；注射1
×
106人源白血病细胞后，4周、8周、12周时小鼠尾静脉取血，裂解红细胞后用aceanovocyte流式细胞仪进行检测；b为pdx模型流式分析结果图；12周后将小鼠安乐处死，将细胞从pdx小鼠骨髓中冲出、将小鼠脾脏研磨，使用1
×
106的细胞使用aceanovocyte流式细胞仪进行检测；c为免疫缺陷小鼠、病人样本和pdx模型吉姆萨染色对比结果图；分别采取ncg小鼠，pdx小鼠模型的外周血，以及使用新鲜病人样本进行吉姆萨染色；箭头所指分别为病人样本白血病细胞，免疫缺陷小鼠外周血白细胞，以及pdx小鼠模型外周血白血病细胞；
25.图6为对比直接冻存复苏细胞和白细胞分离后冻存复苏细胞建立pdx动物模型结果图，a为使用不同方法冻存流程图；b为全血样本冻存方法与分离白细胞冻存方法建立pdx模型的差异结果图；12周后分别采取小鼠外周血，使用1
×
106的细胞使用aceanovocyte流式细胞仪进行检测；
26.图7为对比不同小鼠移植前预处理方法建立pdx模型流程图。
具体实施方式
27.本发明提供了一种对人血液病样本进行冻存的优化方法，流程如图2所示，包括以下步骤：将人血液病样本与不含二甲基亚砜的细胞冻存液混合，置于-80℃环境中12～16h后，转移至液氮中长期保存。
28.本发明所述人血液病样本优选包括白血病和白血病相关血液疾病的样本，更优选包括髓系白血病、淋系白血病和骨髓增生异常综合症等的样本，来源于人类的全血液病样本、全脾脏样本或全骨髓样本以及pdx动物模型中取出的全血液病样本、全脾脏样本或全骨
髓样本。实施例中以白血病样本为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述不含二甲基亚砜的细胞冻存液优选为本领域的常见细胞冻存液，只需要满足不包含二甲基亚砜这一要求即可，优选包括购自funakoshi的货号为cpl-a1的细胞冻存液、thermo fisher的货号为12648010的细胞冻存液或上海七纯生物科技有限公司的货号为yc0100的细胞冻存液。为保证病人样本长期保存以及长时间保存复苏的细胞活力，病人样本在离体后立即与冻存液混合后放入冻存盒中，置于-80℃冰箱中冻存；如不能立即冻存应将病人样本放在含edta抗凝管中4℃保存，不应过夜。如出现凝血、血块等现象，会影响病人样本的保存以及冻存复苏后的细胞活力。利用本发明所述冻存的优化方法，无需对离体样本进行纯化，也无需去除红细胞。
29.本发明将上述人血液病样本与不含二甲基亚砜的细胞冻存液混合，且所述人血液病样本与不含二甲基亚砜的细胞冻存液的混合体积比优选为(2：1)～(1：4)，本发明优选将其混合后放于冻存盒中，-80℃冰箱中过夜(12～16小时)后，放入液氮保存，使用该冻存方法可以将白血病以及其他血液相关疾病病人样本细胞进行长期保存。利用本发明所述冻存方法可对人血液病样本保存1年以上。
30.本发明还提供了一种利用冻存后复苏的人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法，包括以下步骤：将利用上述对人血液病样本进行冻存的方法进行长期保存的冻存样本复苏后，与骨髓内细胞混合后注射免疫缺陷小鼠，得到人血液病pdx动物模型；
31.或将新鲜人血液病样本分离白细胞后，与动物骨髓内细胞混合后注射入经过抑制宿主造血系统预处理的免疫缺陷动物中，得到人血液病pdx动物模型。
32.本发明首先对所述冻存样本进行复苏，所述复苏优选包括将长期保存的冻存样本置于37℃环境中融化，融化后利用细胞培养基进行清洗，并使用含血清的细胞培养基重悬，对重悬后的细胞进行培养。本发明所述融化优选在37℃的水浴中融化，使用细胞培养基将冻存液进行清洗后用含血清的细胞培养基将细胞进行重悬，冻存复苏后的细胞活细胞比例在95％以上。本发明所述细胞培养基优选为dmem培养基。
33.本发明所述复苏后细胞与骨髓内细胞的混合数量比优选为(1
×
104～1
×
107)：(1
×
104～1
×
106)，且所述动物骨髓内细胞优选来源于免疫缺陷小鼠骨髓内细胞。在本发明实施例中优选将100μl 1
×
104～1
×
107个复苏样本细胞与100μl1
×
104～1
×
106个免疫缺陷小鼠骨髓细胞进行混合，而后注射入免疫缺陷小鼠中。本发明所述免疫缺陷小鼠优选包括但不限于无胸腺裸鼠、ncg、nsg、scid小鼠、cba/n小鼠、nod/scid小鼠、sdrg大鼠(rag1和il-2rγ基因双敲除)等。且在被注射前优选还包括被白消安(10mg/kg～100mg/kg)处理。本发明所述注射优选包括尾静脉注射，所述注射的病人细胞总数量为1
×
104～1
×
107细胞。本发明在所述注射后，每4周进行监控，根据样本本身的差异及注射细胞量的差异，一般在12周左右的时间便可成功建立白血病以及其他血液相关疾病的pdx动物模型。
34.本发明还提供了上述人血液病样本进行冻存的优化方法或上述利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法在提高人血液病样本pdx动物模型建模成功率中的应用。
35.本发明基于对现有血液病样本的冻存方法的优化，以及基于该技术冻存并复苏后的血液病样本进行pdx建模，建模成功率高，可达到90％，且建模时间短，在8～12周即可使pdx白血病发生(表1)。
36.表1冻存细胞建立pdx模型汇总
[0037][0038]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种人血液病样本冻存复苏后建立pdx动物模型的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0039]
本发明实施例以急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)m2亚型为例，建立白血病pdx模型，并使用冻存复苏的细胞建立pdx模型。
[0040]
本发明实施例中，所用的试剂如非特别说明均为本领域的常见试剂，可通过市售手段得到。
[0041]
表2hbss+:(1000ml)
[0042]
溶液组成体积终浓度10xhbss100ml1x胎牛血清20ml2％1mhepesph＝7.210ml10mm抗生素10ml1％h2o900ml [0043]
表310
×
ack lysis buffer
[0044][0045][0046]
实施例1、采用新鲜人源白血病样本建立pdx小鼠
[0047]
为了优化白血病pdx模型的构建技术，我们先采用了新鲜人源白血病样本。并且为了提高新鲜病人样本的移植成功率，采用化疗药物白消安预处理部分清除受体小鼠的造血干细胞，而不是采用常用的x-ray照射或者γ-ray射线照射。常用的x-ray照射或者γ-ray照射对小鼠机体损伤较大，不利于受体小鼠的支撑功能。
[0048]
1.1.移植前处理临床人源白血病样本
[0049]
1)从抗凝管中取白血病病人骨髓或外周血样本(2～3ml)室温下(20～22℃)与pbs 1:1-1：3混合稀释；
[0050]
2)取2～5mlficoll液于管中，后将稀释过的样品贴壁轻轻加入ficoll液；
[0051]
3)室温下(20～22℃)通过密度梯度离心的方法，400g，10min，离心结束后将白环层转移至新的管中，加2～5ml清洗液清洗；
[0052]
4)室温下离心450g，5min，弃上清，使用1ml hbss+重悬。
[0053]
1.2.开展白血病异体移植实验
[0054]
1)将免疫缺陷ncg小鼠提前两天进行预处理，每天注射25mg/kg白消安，共两次。
[0055]
2)取100μl 1
×
106病人白血病细胞与100μl 2
×
105carrier免疫缺陷小鼠骨髓细
胞进行混合，通过尾静脉注射的方法移植到受体鼠中。
[0056]
1.3.检测pdx模型的白血病发生
[0057]
1)每四周取受体鼠的外周血20μl进行流式检测；
[0058]
2)室温下将10
×
ack裂解缓冲液使用无菌水稀释为1
×
ack裂解缓冲液，将外周血与1
×
ack裂解缓冲液混合，不断颠倒混匀充分裂解10min；
[0059]
3)室温下离心450g，10min，弃上清，加1ml预冷的hbss+重悬，将细胞通过细胞滤膜(70μm)过滤；
[0060]
4)4℃离心450g，10min，弃上清，加200μl预冷的hbss+重悬，加入抗体，避光置于4℃孵育10min；
[0061]
5)4℃离心450g，5min，弃上清，加200μl预冷的hbss+清洗，4℃离心450g，5min，弃上清，加200μl预冷的hbss+重悬，加入死活染液，避光置于4℃孵育10min，使用流式分析仪进行检测。
[0062]
1.4.实施例1实验结果分析
[0063]
在移植后8周，在pdx白血病小鼠模型外周血中，检测到1.9％人源cd45+细胞，12周后在外周血检测到37.8％人源细胞(图1中b)。进行安乐处死小鼠，收集骨髓、脾脏和外周血细胞，进行细胞生物学分析。流式细胞技术分析发现，pdx小鼠模型外周血中存在40.3％的人源cd45+白细胞。人源cd45+细胞不表达人源淋系b细胞抗原cd19和t细胞抗原cd3，但却包括79.1％为分化程度较高的cd33+cd13-髓系白血病细胞，4.2％为分化程度较低的cd33+cd13+髓系白血病细胞。类似的情况也存在于骨髓和脾脏中。骨髓和脾脏中分别存在74.1％和77.1％的人源cd45+白细胞。这些人源cd45+白细胞不表达淋系抗原cd19和cd3。其中，82.6％和85.0％为分化程度较高的cd33+cd13-髓系白血病细胞，而12.6％和11.5％为分化程度较低的cd33+cd13+髓系白血病细胞(图1中c)。
[0064]
为了进一步确定人源细胞为白血病细胞，对白血病病人样本、ncg小鼠外周血、pdx小鼠模型外周血细胞进行吉姆萨染色，开展形态学对比分析。观察发现，ncg小鼠外周血的宿主鼠源白细胞较小。而白血病病人样本中的白血病细胞较大，且有一个不规则的、巨大的细胞核。在pdx小鼠模型外周血中也可以观察到大量具有该形态特征的白血病细胞(图1中d)。同时，对ncg小鼠以及pdx小鼠模型的肝脏进行苏木素-伊红染色分析，我们也观测到pdx小鼠模型中，白血病细胞浸润侵袭到肝脏血管周边组织中(图1中e)。综合上述结果，我们建立了高效pdx白血病模型。这个技术确保了新鲜的或者冻存后临床白血病样本的pdx重建效率。
[0065]
实施例2、优化白血病样本的冻存技术
[0066]
临床白血病样本比白血病细胞系更为脆弱，提高临床白血病样本冻存复苏后的细胞存活率，才有利于提高pdx移植成功率。所以，我们尝试使用不含二甲基亚砜(有细胞毒性)的细胞冻存液，期望提高临床样本冻存与复苏后的细胞存活率。
[0067]
2.1.移植前病人样本冻存及复苏
[0068]
1)采用图2所示的冻存方法，将人源白血病pdx小鼠脾脏样本(含大量人源白血病细胞)与不含二甲基亚砜的funakoshi冻存液按照3：10的比例混合，然后放入梯度冻存盒并置于-80℃冰箱中过夜后，移入液氮中长期保存。
[0069]
2)取10ml细胞培养基，37℃水浴加热。
[0070]
3)将保存时间1年的人源白血病pdx小鼠脾脏样本从液氮中取出后放入37℃水浴锅中解冻。
[0071]
4)解冻后，将细胞转入细胞培养液(dmem)中，450g离心10min，弃去上清液，将细胞重悬于200μl含有fbs的细胞培养液中。
[0072]
2.2.实施例2实验结果分析
[0073]
为了检测新的冻存技术的效果，我们将冻存一年的pdx小鼠脾脏细胞进行复苏，并与新鲜的pdx小鼠脾脏细胞进行对比分析。如图3所示，保存一年的细胞进行复苏后7-aad阴性的活细胞占比为92.8％。对比活细胞比例为95.4％的新鲜pdx小鼠脾脏细胞，两者的活细胞比例基本一致。更重要的是，经过冻存复苏，人源cd45+细胞比例为90.6％，说明冻存新技术不会导致人源细胞损失。
[0074]
实施例3、采用人源白血病pdx的冻存脾脏细胞建立传代的移植小鼠
[0075]
基于以上两个实施例中优化的pdx移植技术和细胞冻存技术，我们期望能获得更好的临床冻存白血病样本的pdx移植效果。因而先采用更易于获得的冻存pdx白血病细胞完成整合测试。
[0076]
3.1.移植前人源白血病pdx小鼠的脾脏细胞冻存及复苏
[0077]
开展冻存流程同实施例2。人源白血病pdx小鼠的脾脏样本冻存1年后用于pdx传代构建。
[0078]
3.2.开展白血病异体移植实验和检测人源白血病发生
[0079]
开展移植流程同实施例1的1.2，1.3。这个实施例中，通过尾静脉注射复苏的5
×
106人源白血病pdx小鼠的脾脏细胞，到白消安预处理的免疫缺陷小鼠体内。
[0080]
3.3.实施例3实验结果分析
[0081]
移植后，每4周检测小鼠外周血中人源白血病重建情况。流式细胞技术检测发现，8周后可以在pdx小鼠模型的外周血检测到4.3％人源cd45+细胞，12周后在外周血检测到92.5％人源cd45+细胞(图4中a和b)。这些人源cd45+细胞，不表达人源淋系抗原cd19和cd3；其中80.2％为分化程度较高的cd33+cd13-成熟髓系白血病细胞，10.0％为分化程度较低的cd33+cd13+髓系白血病细胞(图4中b)。吉姆萨染色进一步确定为类似于原始病人样本的白血病细胞，与新鲜样本建立的pdx小鼠模型白血病细胞形态特征相似(图4中c)。
[0082]
实施例4、采用来自人源白血病冻存样本建立pdx移植小鼠
[0083]
基于实施例1和2中良好的pdx移植技术和冻存技术，以及实施例3中较好的细胞冻存复苏后建立pdx模型，我们在此实施例中采用冻存1年的急性髓系白血病骨髓样本开展实验。
[0084]
4.1.移植前人源白血病冻存及复苏
[0085]
开展冻存流程同实施例2。急性髓系白血病骨髓样本冻存1年后用于pdx构建。
[0086]
4.2.开展白血病异体移植实验和检测人源白血病发生
[0087]
开展移植流程同实施例1的1.2，1.3。通过尾静脉注射复苏的1
×
106人源白血病细胞后，到白消安预处理的免疫缺陷小鼠体内。
[0088]
4.3.实施例4实验结果分析
[0089]
移植后，每4周检测小鼠外周血中人源白血病重建情况。检测发现，8周后可以在pdx小鼠模型的外周血检测到1.3％人源cd45+细胞，12周后在外周血检测到7.1％人源cd45
+细胞(图5中a和b)。这些人源cd45+细胞，不表达人源淋系抗原cd19和cd3；其中80.2％为分化程度较高的cd33+cd13-成熟髓系白血病细胞，10.0％为分化程度较低的cd33+cd13+髓系白血病细胞(图5中b)。吉姆萨染色进一步确定为类似于原始病人样本的白血病细胞，与新鲜样本建立的pdx小鼠模型白血病细胞形态特征相似(图5中c)。总之，由于利用本发明冻存方法冻存一年的人源白血病细胞通过与新鲜白血病细胞相似的12周白血病发生过程，所以利用本发明冻存方法冻存的白血病细胞的pdx重建活性基本没有改变。
[0090]
实施例5、对比人源白血病样本的不同冻存方式对pdx移植小鼠构建的影响
[0091]
该实施例是为了研究对比图6方法一不分离白细胞的原始组织样本直接冻存方式与方法二分离白血病白细胞然后冻存的方式，对白血病细胞pdx移植率的影响。
[0092]
5.1.移植前人源白血病冻存及复苏
[0093]
1)采用图2所示的冻存方法，将人源血液病骨髓穿刺样本与funakoshi冻存液按照3：10的比例混合(注：为了对比，从实施例4中抽出数据)，或者人源血液病透析后富集白细胞样本(富含白血病细胞)与funakoshi冻存液按照3：10的比例混合然后放入梯度冻存盒并置于-80℃冰箱中过夜后，移入液氮中长期保存。
[0094]
2)取10ml细胞培养基，37℃水浴加热。
[0095]
3)将保存时间1年的人源血液病样本从液氮中取出后放入37℃水浴锅中解冻。
[0096]
4)解冻后，将细胞转入细胞培养液(dmem)中，450g离心10min，弃去上清液，将细胞重悬于200μl含有fbs的细胞培养液中。
[0097]
5.2.开展白血病异体移植实验和检测人源白血病发生
[0098]
开展移植流程同实施例1的1.2，1.3。通过尾静脉注射复苏的1
×
106全骨髓来源白血病细胞或者透析后富集白血病细胞到白消安预处理的免疫缺陷小鼠体内。
[0099]
5.3.实施例5实验结果分析
[0100]
分别在12周后提取两种不同pdx受体小鼠的外周血细胞，开展流式细胞技术检测，人源白血病细胞的重建情况。我们发现，在注射了白血病病人全骨髓冻存样本的pdx受体小鼠的外周血中检测到7.1％人源cd45+细胞，但在注射了源于白血病病人的血液透析分离的白细胞冻存样本的pdx小鼠模型外周血中不存在人源细胞(图6中b)，意味使用分离白细胞后冻存的细胞构建pdx模型失败。注：全骨髓冻存人源白血病细胞的pdx小鼠数据来自实施例4。
[0101]
实施例6、对比采用不同预处理受体小鼠方式建立人源白血病细胞的pdx移植小鼠的成功率
[0102]
该实施例是研究对比图7(1)白消安预处理和(2)常用x-ray预处理，对pdx小鼠模型构建成功率的影响。
[0103]
6.1.根据图7所示开展白血病异体移植实验
[0104]
1)将免疫缺陷ncg小鼠提前两天进行预处理，每天注射25mg/kg白消安，共2次；或者使用提前2小时使用2gy的x-ray射线辐照。
[0105]
2)取100μl 1x10
5-1x107人源白血病细胞与100μl 1
×
105carrier免疫缺陷小鼠骨髓细胞进行混合，通过尾静脉注射的方法移植到受体鼠中。
[0106]
6.2.开展白血病异体移植实验和检测人源白血病发生
[0107]
开展移植流程同实施例1的1.2，1.3。通过尾静脉注射不同病人外周血或者骨髓样
本细胞到白消安预处理的免疫缺陷小鼠体内。每4周取受体鼠的外周血20μl进行流式检测。
[0108]
6.3.实施例6实验结果分析
[0109]
对比使用传统常用的x-ray预处理，使用白消安进行预处理的免疫缺陷小鼠建成pdx模型成功率更高(表4)。
[0110]
表4不同预处理方式建成pdx动物模型对比
[0111][0112]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种对人血液病样本进行冻存的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：将人血液病样本与不含二甲基亚砜的细胞冻存液混合，置于-80℃环境中12～16h后，转移至液氮中长期保存。2.根据权利要求1所述对人血液病样本进行冻存的优化方法，其特征在于，所述人血液病样本与不含二甲基亚砜的细胞冻存液的体积比为(2:1)～(1:4)。3.根据权利要求1或2所述对人血液病样本进行冻存的优化方法，其特征在于，所述不含二甲基亚砜的冻存液包括购自funakoshi的货号为cpl-a1的细胞冻存液、thermo fisher的货号为12648010的细胞冻存液或上海七纯生物科技有限公司的货号为yc0100的细胞冻存液。4.根据权利要求1所述对人血液病样本进行冻存的优化方法，其特征在于，所述人血液病样本包括白血病和白血病相关血液疾病的不经单核细胞分离的全血液样本。5.一种利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：将利用权利要求1～3任一项所述对人血液病样本进行冻存的优化方法进行长期保存的冻存样本复苏，与动物骨髓内细胞混合后注射入经过抑制宿主造血系统预处理的免疫缺陷动物中，得到人血液病pdx动物模型；或将新鲜人血液病样本分离白细胞后，与动物骨髓内细胞混合后注射入经过抑制宿主造血系统预处理的免疫缺陷动物中，得到人血液病pdx动物模型。6.根据权利要求4所述利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法，其特征在于，复苏后的细胞与动物骨髓内细胞的混合数量比为(1
×
104～1
×
107)：(1
×
104～1
×
106)。7.根据权利要求4所述利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法，其特征在于，所述抑制宿主造血系统的预处理方法包括白消安预处理。8.根据权利要求7所述利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法，其特征在于，所述白消安预处理包括注射白消安，注射量为10mg/kg～100mg/kg。9.根据权利要求4所述利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法，其特征在于，所述免疫缺陷动物包括无胸腺裸鼠、scid小鼠、ncg、nsg、cba/n小鼠、nod/scid小鼠、sdrg大鼠(rag1和il-2rγ基因双敲除突变大鼠)。10.权利要求1～3任一项所述人血液病样本进行冻存的优化方法或权利要求4～9任一项所述利用人血液病样本建立pdx动物模型的优化方法在提高人血液病样本pdx动物模型建模成功率中的应用。

技术总结
本发明提供了一种人血液病样本的冻存优化方法及利用人血液样本建立PDX动物模型的方法，涉及PDX模型构建技术领域。本发明具体涉及一种通过优化改进长期冻存人源血液病样本的方法，并且优化改进建立血液病PDX模型方法，从而大幅度提高冻存并复苏后的临床血液病样本构建PDX动物模型成功率。本发明所述方法可以用于长期保存血液病病人样本，以及保存耐药、复发等稀缺且具有研究价值的样本；同时可以解决长距离病人样本运输困难等现存的临床问题，造模时间短且成模率高。造模时间短且成模率高。造模时间短且成模率高。


技术研发人员：郭伟 王彦雯 郑雯 吴雪薇 张艳梅
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.02.17
技术公布日：2023/7/19