一种具有抗菌功能的纳米药物及其应用

1.本发明属于药物领域，具体的涉及一种抗菌纳米药物及其应用。


背景技术：

2.细菌感染是严重危害全球人类健康的一类重要疾病，2022年11月21日，全球著名医学期刊《柳叶刀》(thelancet)发表重磅系统性分析研究。研究表明，细菌感染是造成全球健康损失的重要原因，且正在变成全球第二大死因。细菌感染的治疗和抗菌药物的选择也一直是全球公共卫生领域的重点和难点问题。
3.其中，耐药菌的感染和防治是细菌感染的紧迫问题之一。临床上，耐药菌感染的主要治疗方法是全身大剂量抗生素治疗。然而，长期过量使用抗生素可能会促进细菌进化，并导致细菌对抗生素产生更强的耐药性。因此，为了实现及时控制耐药菌感染的目标，迫切需要制定新的策略，合理使用抗生素，克服耐药性，以更有效、更安全的方式治疗耐药菌感染。
4.纳米药物载体是临床治疗耐药菌感染的有效手段之一。然而，这些载体仍存在一些共性的挑战，如(1)载体主要起到药物包载作用，缺乏活性功能；(2)相关载体药物负载能力低、药物释放不完全；(3)载体本身潜在的系统毒性。因此，开发一种无需载体的药物递送系统，成为治疗耐药菌感染的新方向。
5.纳米药物是疾病治疗的新策略，它由几种药物活性成分在不使用或很少使用惰性材料的情况下制备形成纳米药物。活性成分主要包括靶向剂和不同治疗机制的药物等。纳米药物具有以下优点：一体化纳米诊疗、抑制多药耐药、协同治疗、靶向能力强、毒副作用小、药物负载能力高、药代动力学好等。然而，目前的纳米药物主要用于肿瘤治疗研究，对抗菌及耐药菌感染治疗的研究较少。
6.龙脑，又称冰片，是一种广泛存在于植物中的双环单萜醇，具有广泛的临床药用价值，如止痛、防腐、镇静。龙脑对人体几乎无毒性，也是一种非常好的渗透增强剂，具有松动细胞壁或增加其渗透性的生理功能，可以帮助一些药物渗透各种生理则屏障，达到目标组织如脑、皮肤、胃粘膜和口腔黏膜等。
7.中国专利201110147322.5涉及一种(+)-4-甲氧基苯甲酸冰片酯及其制备方法和应用，通过(+)-冰片与4-甲氧基苯甲酸在催化剂作用下进行酯化反应制备得到冰片衍生物，所述衍生物具有低细胞毒性和透血屏障作用，可促进药物穿透血脑屏障。
8.中国专利201711095399.6涉及一种缬氨酸冰片酯及其制备方法和应用，通过冰片与缬氨酸在催化剂作用下进行酯化反应，以达到抗癫痫和/或抗肿瘤的目的。该发明设计出了缬氨酸冰片酯，具有显著的抗癫痫和抗肿瘤的药理活性，同时具有毒副作用小和作用机制独特等特性。
9.中国专利201910411304.x涉及一种4-醛基苯甲酸龙脑酯及其制备方法和抗菌应用，该4-醛基苯甲酸龙脑酯以龙脑和4-醛基苯甲酸为原料，通过一步酯化反应形成龙脑酯化衍生物作为抗菌小分子物质。该4-醛基苯甲酸龙脑酯对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(如铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌)等具有较强的抗菌
作用，同时具有良好的生物相容性、无毒性等特点。
10.上述现有技术均没有提及4-醛基苯甲酸龙脑酯(即4-醛基苯甲酸冰片酯)与传统多氨基抗生素合成的纳米药物复合物，也没有提及该复合物的抑菌作用。
11.本发明人基于上述研究及现状问题，通过将含有多氨基的抗生素和合成的抗菌分子4-醛基苯甲酸龙脑酯反应形成动态亚胺键(席夫碱)键，在组装反应过程中通过调节多氨基抗生素和4-醛基苯甲酸的比例，使得药物表面带有足量正电荷，从而得到抗菌无载体纳米药物表面的正电荷利于药物与细菌相互作用或进入细菌内部，高效低毒，对耐药菌感染具有显著的治疗作用。基于上述研究，由此完成了本发明。


技术实现要素：

12.第一方面，本发明提供一种复合物，所述复合物由含有多氨基的抗生素与4-醛基苯甲酸龙脑酯通过亚胺(席夫碱)键构成，即抗生素的氨基与4-醛基苯甲酸龙脑酯的醛基通过形成动态亚胺(席夫碱)键组装得到，所述复合物的结构如下：
[0013][0014]
其中，n代表亚胺(席夫碱)键的个数，1≤n≤抗生素活性氨基数量，其中两个圆球分别代表含有多氨基的抗生素和4-醛基苯甲酸龙脑酯。
[0015]
进一步，所述含有氨基的抗生素选自妥布霉素、多粘菌素b、阿米卡星、庆大霉素、杆菌肽、万古霉素中的一种或几种。
[0016]
第二方面，本发明提供一种复合物，所述复合物表面带正电荷，其表面氨基数量和表面正电荷呈正相关。
[0017]
进一步，所述复合物中含有相同氨基个数的抗生素反应形成亚胺键的个数(n)越少，复合物表面氨基数量越多，表面正电荷越大；
[0018]
更进一步，所述复合物的表面正电荷利于其与细菌相互作用或进入细菌内部。
[0019]
第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含有第一方面的复合物及其药学上可接受的辅料。
[0020]
进一步，所述药物组合物为纳米颗粒；
[0021]
进一步，所述药物组合物可以制备为片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂和本领域中已知的其它制剂；
[0022]
进一步，所述药物组合物还可以含有第三活性成分，所述第三活性成分是指与复合物中的多氨基抗生素和4-醛基苯甲酸龙脑酯不同的其它有活性的物质，如：维生素、矿物质、不同于复合物中的抗生素、抗肿瘤药物、荧光分子等。
[0023]
第四方面，本发明提供一种复合物的制备方法，所述制备方法包括
[0024]
s01,将4-醛基苯甲酸龙脑酯溶于有机溶剂中，妥布霉素溶于去离子水中，随后将有机相溶液与水相溶液混合，搅拌均匀，得到含纳米药物的乳液；
[0025]
s02,对含纳米药物的乳液进行分离处理，除去有机溶剂，获得纳米药物粗品乳液；
[0026]
s03,用透析袋对纳米药物粗品乳液进行透析处理，然后冷冻干燥，得到纳米药物。
[0027]
第五方面，本发明提供所述复合物在制备抗菌药物或抗菌产品中的用途。
[0028]
进一步，所述细菌包括敏感型细菌(如金黄色葡萄球菌、结核杆菌、大肠杆菌、铜绿
假单胞菌和鲍曼不动杆菌中的一种或几种)和/或耐药型细菌(如耐药型金黄色葡萄球菌、耐药型结核杆菌、耐药型大肠杆菌、耐药型铜绿假单胞菌和耐药型鲍曼不动杆菌)。
[0029]
更进一步，所述细菌优选耐药型金黄色葡萄球菌、耐药型结核杆菌、耐药型大肠杆菌、耐药型铜绿假单胞菌和耐药型鲍曼不动杆菌等。
[0030]
本发明的有益效果：本发明人研究发现，构建纳米药物治疗耐药菌感染尚存诸多局限性，主要是：(1)用于构建纳米药物的抗菌药物研究较少，需要合理的设计方案，以达到高效抗菌的治疗作用；(2)纳米药物的构建通常基于非共价相互作用，现有研究和技术很少涉及利用动态共价键组装构建纳米药物；(3)纯药组分的纳米药物较难构建，大部分纳米药物需要活性分子或少量非药用功能分子修饰，导致难以精确控制多种药物在纳米药物中的比率。
[0031]
本发明提供的新型抗菌纳米药物，由含有多氨基的抗生素和合成的抗菌分子4-醛基苯甲酸龙脑酯反应形成动态亚胺(席夫碱)键，直接组装得到，不需要额外的载体材料，避免了传统无治疗作用的载体或功能分子引入及修饰带来的潜在毒性。
附图说明
[0032]
图1：为本发明中抗菌感染的纳米药物(tbn)的制备工艺和反应过程示意图。
[0033]
图2：为本发明实施例1制备的抗菌感染的纳米药物(tbn)的粒径分布和多分散指数(pdi)图。
[0034]
图3：为本发明实施例1制备的抗菌感染的纳米药物(tbn)的扫描电子显微镜(sem)图。
[0035]
图4：为本发明实施例1制备的纳米药物(tbn)的细胞相容性分析图；
[0036]
图5：为本发明实施例1制备的纳米药物(tbn)对多药耐药型金黄色葡萄球菌(mdrsa)造成的小鼠皮肤感染的治疗效果，其中图5a为不同治疗后，小鼠皮肤感染照片，图5b为治疗后感染部位皮肤组织的平板菌落照片，图5c为治疗后感染部位皮肤组织的细菌定量结果。
具体实施方式：
[0037]ⅰ、术语
[0038]
本发明中所述用语“纳米药物”是指利用纳米制备技术将原料药等制成具有纳米尺度的颗粒，其尺寸界定于1～1000nm之间。
[0039]
所述用语“含有多氨基的抗生素”是指妥布霉素、多粘菌素b、阿米卡星、庆大霉素、杆菌肽、万古霉素。
[0040]
所述用语“抗菌活性分子”与“抗菌分子”可以互换使用。
[0041]
本发明中所述用语“抗菌”包括“抑菌”和“杀菌”。
[0042]
在本发明的一些实施方式中，对于有机相溶液没有特别的限制，只要能够使原料溶解，且不会妨碍反应进行即可，本发明所用有机溶剂包括甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和环己烷中的一种或几种，优选为二氯甲烷(ch2cl2)。
[0043]
在本发明的一些实施方式中，步骤a中所述水相溶液包括去离子水、生理盐水和磷酸盐缓冲溶液中的一种或几种，优选为去离子水。
[0044]
在本发明的一些实施方式中，步骤a中所述有机相溶液(含4-醛基苯甲酸龙脑酯的有机相溶液)和水相溶液(含妥布霉素的水相溶液)的体积比为1:(5～20)，优选为1:(5～10)。
[0045]
在本发明的一些实施方式中，步骤a中所述多氨基抗生素与4-醛基苯甲酸龙脑酯的摩尔比为1:(1～8)，优选为1:(1～5)。
[0046]
在本发明的一些实施方式中，步骤a中所述搅拌的转速为1000～10000rpm，优选为1000～8000rpm，进一步优选为1000～5000rpm；和/或，搅拌的时间为3～10h，优选为4～8h，进一步优选为6h。
[0047]
在本发明的一些实施方式中，步骤b中所述分离处理包括透析法、超滤法、缓慢搅拌法和离心法的一种或几种。
[0048]ⅱ、实施例：
[0049]
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
[0050]
实施例1：纳米药物的制备
[0051]
本实施例中分子结构如式(ⅰ)所示的抗菌感染的纳米药物的设计制备如图1所示。
[0052][0053]
其中，n代表亚胺(席夫碱)键的个数，1≤n≤5，抗生素选用妥布霉素。
[0054]
具体制备方法如下：
[0055]
步骤a，将1mmol4-醛基苯甲酸龙脑酯溶于二氯甲烷(ch2cl2，1ml)中，1mmol妥布霉素溶于去离子水(5ml)中，随后将有机相溶液与水相溶液混合，以3000rpm搅拌6h，得到含纳米药物的乳液；
[0056]
步骤b，对含纳米药物的乳液进行分离处理，通过超滤法和缓慢搅拌法除去二氯甲烷(ch2cl2)，获得纳米药物粗品乳液；
[0057]
步骤c，用mwco，1000da的透析袋对纳米药物粗品乳液进行透析处理，透析时间为48h，冷冻干燥，得到纳米药物。
[0058]
实施例2：纳米药物的制备
[0059]
步骤a，将5mmol4-醛基苯甲酸龙脑酯溶于二氯甲烷(ch2cl2，1ml)中，1mmol妥布霉素溶于去离子水(5ml)中，随后将有机相溶液与水相溶液混合，以2000rpm搅拌8h，得到含纳米药物的乳液；
[0060]
步骤b，对含纳米药物的乳液进行分离处理，通过超滤法和缓慢搅拌法除去二氯甲烷(ch2cl2)，获得纳米药物粗品乳液；
[0061]
步骤c，用mwco，1000da的透析袋对纳米药物粗品乳液进行透析处理，透析时间为40h，冷冻干燥，得到纳米药物。
[0062]
实施例3：纳米药物的制备
[0063]
步骤a，将8mmol4-醛基苯甲酸龙脑酯溶于二氯甲烷(ch2cl2，1ml)中，1mmol妥布霉素溶于去离子水(5ml)中，随后将有机相溶液与水相溶液混合，以3500rpm搅拌5h，得到含纳米药物的乳液
[0064]
步骤b，对含纳米药物的乳液进行分离处理，通过超滤法和缓慢搅拌法除去二氯甲
烷(ch2cl2)，获得纳米药物粗品乳液；
[0065]
步骤c，用mwco，1000da的透析袋对纳米药物粗品乳液进行透析处理，透析时间为48h，冷冻干燥，得到纳米药物。
[0066]
实施例4：纳米药物的制备
[0067]
步骤a，将8mmol4-醛基苯甲酸龙脑酯溶于二氯甲烷(ch2cl2，1ml)中，5mmol多粘菌素b溶于去离子水(5ml)中，随后将有机相溶液与水相溶液混合，以2000rpm搅拌6h，得到含纳米药物的乳液；
[0068]
步骤b，对含纳米药物的乳液进行分离处理，通过超滤法和缓慢搅拌法除去二氯甲烷(ch2cl2)，获得纳米药物粗品乳液；
[0069]
步骤c，用mwco，1000da的透析袋对纳米药物粗品乳液进行透析处理，透析时间为48h，冷冻干燥，得到纳米药物。
[0070]
实施例5：纳米药物的制备
[0071]
步骤a，将2mmol4-醛基苯甲酸龙脑酯溶于二氯甲烷(ch2cl2，1ml)中，1mmol阿米卡星溶于去离子水(5ml)中，随后将有机相溶液与水相溶液混合，以1500rpm搅拌7h，得到含纳米药物的乳液；
[0072]
步骤b，对含纳米药物的乳液进行分离处理，通过超滤法和缓慢搅拌法除去二氯甲烷(ch2cl2)，获得纳米药物粗品乳液；
[0073]
步骤c，用mwco，1000da的透析袋对纳米药物粗品乳液进行透析处理，透析时间为36h，冷冻干燥，得到纳米药物。
[0074]
实施例6：纳米药物的理化性质表征
[0075]
采用动态光散射(dls，malvernnanosizerzs2000)测定实施例1中制备的纳米药物(tbn)的粒径分布、多分散指数(pdi)和表面zeta电位。利用扫描电子显微镜(sem，jeoljsm-7800f)对实施例1制备的纳米药物(tbn)的形貌进行表征。
[0076]
结果如图2和图3所示，tbn呈现球形结构，粒径为78.8～615.3nm，pdi为0.213，表面zeta电位在为～24.6mv，纳米药物中bf与tob的实际摩尔比为2:1。
[0077]
按照实施例6中的实验方法对实施例2-5制备的纳米药物的粒径分布、pdi、zeta电位和形貌进行表征，测定结果如表1所示。
[0078]
表1：实施例2-5制备的纳米药物的理化性质参数
[0079]
[0080]
实施例7：纳米药物的体外抗菌评价
[0081]
采用标准的肉汤稀释法(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，clsi，2017)和平板涂布法检测纳米药物对敏感型金黄色葡萄球菌(s.aureus)和多药耐药型金黄色葡萄球菌(mdrsa)的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)，以评价本发明实施例1制备的纳米药物(tbn)的高效抗菌活性。检测不同样品对各待测菌株的mic和mbc的步骤如下：
[0082]
将各待测细菌接种在tsb液体培养基中，在37℃的恒温摇床中培养至对数生长期，收集细菌，用tsb液体培养基稀释至106cfu/ml。在96孔板的a1-c1孔分别加入180μltsb液体培养基，a2-a10、b2-b10和c2-c10孔分别加入
[0083]
100μltsb液体培养基。然后，在a1-c1孔中分别加入20μl一定浓度的纳米药物样品溶液，混匀后分别加入a2-c2孔，再次混匀后取100μl加入a3-c3孔，按照二倍稀释法依次稀释至a10-c10孔，a10-c10孔混匀后弃去100μl溶液，然后a1-a10孔、b1-b10和c1-c10孔分别加入100μl菌悬液。最后两列设置阴性和阳性对照组，阴性对照组每孔加入200μl的tsb液体培养基，阳性对照组每孔加入100μl的tsb液体培养基和100μl菌悬液。将96孔板置于37℃培养箱培养24h，采用酶标仪测量600nm波长处的吸光度值。与对照组相比，细菌无明显生长的最低浓度定义为mic。
[0084]
mic和mbc结果如表2所示，实施例1制备的纳米药物(tbn)对s.aureus和mdrsa均具有高效抗菌活性，对s.aureus的mic为0.5μg/ml，对mdrsa的mic为2.0μg/ml。
[0085]
按照实施例7中的mic和mbc实验方法对实施例2-5制备的纳米药物进行体外抗菌试验，结果表明，实施例2-5制备的纳米药物对s.aureus和mdrsa均表现出一定的抗菌活性。
[0086]
表2：实施例1-5制备的纳米药物对各待测细菌的最小抑菌浓度(mic)
[0087][0088]
实施例8：纳米药物的细胞相容性评价
[0089]
在湿润培养箱条件下(37℃，5％co2)，将小鼠成纤维细胞(l929，购自中国北京协和细胞资源中心(crc/pumc))在rpmi1640完全培养基(10％fbs，100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)中培养至对数生长期，收集细胞。将l929细胞接种在96孔板中(每孔5000个细胞)，在湿润培养箱(37℃，5％co2)中温育24h。将实施例1中制备的纳米药物(tbn)用rpmi16406培养基配制成一系列浓度的溶液，弃去96孔板中的培养基，并加入100μl含有不同浓度的tbn的新鲜培养基继续培养24h。96孔板中tbn的最终浓度为4、8、16、32和64μg/ml。通过mtt比色法测定细胞活力，每孔分别加入20μlmtt溶液(5mg/ml)测定细胞活力，37℃下
温育4h，移去孔板中的溶液后，向各孔中加入150μldmso，并轻轻摇动以溶解每孔中的甲臜晶体。将孔板置于酶标仪中，在570nm波长处测定甲臜液体的吸光度，按以下公式计算相对细胞活力(n＝6)：
[0090]
细胞活性(％)＝(od570样品﹣od570对照)/(od570细胞﹣od570对照)
×
100％。
[0091]
其中，od570样品代表用不同浓度样品处理的细胞吸光度，od570对照代表空白培养基的吸光度，od570对照代表未用样品处理的细胞吸光度。
[0092]
检测结果如图4所示，实施例1制备的纳米药物(tbn)对小鼠成纤维细胞l929具有良好的生物相容性(细胞存活率》89％)。
[0093]
按照实施例8中的实验方法对实施例2-5制备的纳米药物进行细胞相容性测试，结果表明，实施例2-5制备的纳米药物具有良好的生物相容性。
[0094]
实施例9：纳米药物根除多药耐药细菌感染评价
[0095]
建立多药耐药型金黄色葡萄球菌(mdrsa)造成的小鼠皮肤感染模型，以评价实施例1制备的纳米药物(tbn)根除皮肤感染的效果。在雄性balb/c小鼠(6周龄，～20g)背部皮下接种mdrsa细菌悬液(～1
×
108cfu/ml，100μl)，24h后即可建立皮肤感染模型。
[0096]
当balb/c小鼠背部出现明显的皮肤感染时(记录为第0天)，将感染的小鼠随机分为3组(n＝12)。第0天开始，在小鼠皮下脓肿部位原位注射给药，每天治疗一次：(1)pbs(200μl)；(2)tbn(32.0μg/ml，200μl)。治疗期间，拍照记录小鼠皮肤感染区域的恢复情况。为了确定小鼠皮下感染部位的细菌数量，治疗结束后，收集小鼠感染部位皮肤组织进行匀浆处理。将得到的组织匀浆样品涂布在tsa固体培养基上，37℃培养24h后，采用标准平板计数法进行菌落计数(n＝3)。
[0097]
实验结果如图5所示，治疗10天后，实施例1制备的纳米药物(tbn)治疗组的感染小鼠几乎完全恢复健康。小鼠感染皮肤组织中细菌菌落拍照和定量结果如图5b和5c所示，tbn治疗组菌落数量显著低于其他对照组，具有显著统计学差异(****p《0.0001)，进一步验证了tbn高效杀菌效果。上述结果表明，tbn能够在10天内快速高效根除多药耐药金黄色葡萄球菌造成的小鼠皮肤感染。
[0098]
按照实施例9中的实验方法对实施例2-5制备的纳米药物进行根除多药耐药菌造成的皮肤感染试验，结果表明，实施例2-5制备的纳米药物均表现出一定地根除多药耐药金黄色葡萄球菌造成的小鼠皮肤感染的效果。
[0099]
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

技术特征：
1.一种复合物，所述复合物由含有多氨基的抗生素与4-醛基苯甲酸龙脑酯通过亚胺(席夫碱)键构成，所述复合物的结构如下：其中，n代表亚胺键的个数，1≤n≤抗生素活性氨基数量，其中两个圆球分别代表含有多氨基的抗生素和4-醛基苯甲酸龙脑酯。2.如权利要求1所述的复合物，所述含有多氨基的抗生素选自妥布霉素、多粘菌素b、阿米卡星、庆大霉素、杆菌肽、万古霉素中的一种或几种。3.如权利要求1-2所述的复合物，所述复合物表面带正电荷，其表面氨基数量和表面正电荷呈正相关，有利于与细菌相互作用或进入细菌内部。4.一种药物组合物，所述药物组合物含有如权利要求1所述的复合物和药学上可接受的辅料。5.如权利要求4所述的药物组合物，所述药物组合物为纳米颗粒。6.如权利要求4所述的药物组合物，所述药物组合物可以制备为片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂和本领域中已知的其它制剂。7.如权利要求4-6任一项所述的药物组合物，所述药物组合物含有第三活性成分，所述第三活性成分是指与复合物中的抗生素和4-醛基苯甲酸龙脑酯不同的其它有活性的物质。8.如权利要求7所述的药物组合物，所述第三活性成分选自维生素、矿物质、不同于复合物中的抗生素、抗肿瘤药物、荧光分子中的一种或几种。9.权利要求1所述的复合物在制备抗菌药或抗菌产品中的用途，所述细菌包括敏感型细菌和/或耐药型细菌。10.如权利要求10所述的用途，其中所述耐药型细菌选自耐药型金黄色葡萄球菌、耐药型结核杆菌、耐药型大肠杆菌、耐药型铜绿假单胞菌和耐药型鲍曼不动杆菌中的一种或几种。

技术总结
本发明涉及具有抗菌功能的纳米药物及其应用，所述纳米药物由含有多氨基的抗生素与4-醛基苯甲酸龙脑酯反应得到，并且在组装过程中容易调节多氨基抗生素和4-醛基苯甲酸的比例，纳米药物表面带正电荷，其表面氨基数量和表面正电荷呈正相关，利于其与细菌相互作用或进入细菌内部。本发明的纳米药物具有智能响应、抗菌、良好的生物安全性等优势。对敏感型细菌和/或耐药型细菌均具有高效的抗菌作用。或耐药型细菌均具有高效的抗菌作用。


技术研发人员：王兴 付雅南
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/7/20