β-丙氨酸连接酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及β-丙氨酸连接酶突变体及其应用。


背景技术：

2.β-丙氨酸是一种天然存在的β氨基酸，其氨基连接至丙氨酸的β-碳，而不是更常见的α-碳。β-丙氨酸通常被用作运动补充剂和耐力辅助剂，它可以提高运动表现并促进整体健康，与此同时，β-丙氨酸也是脱羧肌肽等很多其它短肽的组成部分。脱羧肌肽(decarboxy carnosine)是一种仿生肽，其具有抗氧化能力和抗衰老作用。
3.目前市面上报道的脱羧肌肽制备方法主要是化学合成法。
4.传统的化学合成法是目前该类二肽产品主要的生产工艺，制备过程为利用boc保护的β-丙氨酸与boc保护的组织胺进行缩合，最后再脱boc保护基，或以氯丙酰氯和组胺盐酸盐为原料，分布合成制备。两种方案都需要用到大量有机溶剂，生产步骤多，不满足绿色生产的要求。
5.综上所述，利用化学合成法进行脱羧肌肽的制备，存在制备路线长，有机溶剂用量大，最终收率低且产品质量差的问题。探索改造l-氨基酸连接制备二肽具有很大的竞争优势及实际应用价值，开发新的、更优的生产工艺是目前生产二肽产品比较现实的需求。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供的β-丙氨酸连接酶突变体及其应用，制备路线精简、收率高、产品品质好、生产中绿色指数高且易规模化生产。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了uniprot id为b0btg0的氨基酸连接酶的突变体，突变位点包括：
9.第13位氨基酸残基突变为苏氨酸；和/或
10.第14位氨基酸残基突变为苯丙氨酸；和/或
11.第87位氨基酸残基突变为谷氨酰胺；和/或
12.第91位氨基酸残基突变为丙氨酸；和/或
13.第239位氨基酸残基突变为天冬酰胺；和/或
14.第287位氨基酸残基突变为缬氨酸；和/或
15.第291位氨基酸残基突变为色氨酸；和/或
16.第317位氨基酸残基突变为甲硫氨酸。
17.在本发明的一些具体实施方案中，上述突变体的突变位点还包括：
18.第107位氨基酸残基突变为天冬酰胺；和/或
19.第170位氨基酸残基突变为半胱氨酸；和/或
20.第192位氨基酸残基突变为脯氨酸；和/或
21.第243位氨基酸残基突变为异亮氨酸。
22.在本发明的一些具体实施方案中，上述突变体具有：
23.(1)、如seq id no:2所示的氨基酸序列；或
24.(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
25.(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
26.所述多个为2个至60个。
27.本发明还提供了编码上述突变体的核酸分子，具有：
28.(4)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或
29.(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
30.(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
31.所述多个为2个至200个。
32.本发明还提供了表达载体，包括上述核酸分子，以及可接受的基因元件。
33.本发明还提供了宿主细胞，包括上述核酸分子或上述表达载体。
34.本发明还提供了组合物，包括上述突变体和三磷酸腺苷。
35.在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物还包括多聚磷酸激酶和多聚磷酸；
36.所述多聚磷酸包括偏六磷酸。
37.在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中所述多聚磷酸激酶具有：
38.(7)、如seq id no.1所示的氨基酸序列；或
39.(8)、如(7)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或
40.(9)、与如(7)或(8)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
41.所述多个为2个至30个。
42.本发明还提供了如下任意项在脱羧肌肽合成中的应用：
43.(i)、上述突变体；
44.(ii)、上述核酸分子；
45.(iii)、上述表达载体；
46.(iv)、上述宿主细胞；
47.(v)、上述组合物。
48.本发明还提供了脱羧肌肽的制备方法，包括：
49.(a)、取原料与上述突变体混合，获得所述脱羧肌肽；或
50.(b)、表达上述核酸分子，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述脱羧肌肽；或
51.(c)、表达上述表达载体，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述脱羧肌肽；或
52.(d)、培养上述宿主细胞，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述脱羧肌肽；或
53.(e)、取原料与上述组合物混合，获得所述脱羧肌肽；
54.所述原料包括β-丙氨酸和组胺。
55.本发明的连接酶突变体及其应用有如下效果：
56.本发明利用放线杆菌体内的一个l-氨基酸连接酶能催化连接β-丙氨酸与其他氨基酸的特点，通过对l-氨基酸连接酶的催化活性口袋以及其他相关部位氨基酸残基进行突变，最终获得高催化活性生产脱羧肌肽。该方法大大优于化学合成制备工艺，在生产成本、
能耗、产品品质以及绿色指数方面都表现出突出的优势。因此该方法的规模化生产将是脱羧肌肽生产的优先选项。
附图说明
57.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
58.图1示ligase adh2反应3小时的hplc图；
59.图2示实施例1中产物脱羧肌肽的核磁谱图；
60.图3示实施例1中产物脱羧肌肽的质谱图；
61.图4示野生b0btg0改造成中间突变体b0btg0-130酶反应3小时的hplc图谱。
具体实施方式
62.本发明公开了β-丙氨酸连接酶突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
63.本专利拟公开采用一种新颖简便的β-丙氨酸连接酶方案廉价高效制备脱羧肌肽。
64.通过大量的氨基酸连接酶催化底物活性筛选结果显示，放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae)体内存在的一个l-氨基酸连接酶(uniprot：b0btg0)具有连接β-丙氨酸与其他多种氨基酸的能力，如β-丙氨酸、l-半胱氨酸、l-组氨酸等。然而其催化活力仍然太弱，催化底物还是太窄，因此无法直接应用于工业化生产。本技术以该酶作为改造模板，结合利用理性的定点突变以及非理性的随机突变，最终从6000个突变体库中筛选到对β-丙氨酸与组胺高催化活性的连接酶，再结合实际的催化工艺优化，最终成功实现脱羧肌肽的放大生产。
65.本专利氨基酸连接酶法制备路线：
[0066][0067]
该路线利用廉价的、无需保护基团的氨基酸作为原料，在等当量的三磷酸腺苷(atp)以及对应的氨基酸连接酶作用下高收率的转化成对应的二肽产物。为进一步节省成本，反应体系中引入atp循环再生体系则可以进一步降低atp使用量。因此，该制备路线精简、收率高、产品品质好、生产中绿色指数高且易规模化生产。
[0068]
本发明利用相应的氨基酸连接酶在缓冲液中可一步直接将两个目标氨基酸原料连接转化成对应的二肽产品。反应过程中所需要的三磷酸腺苷(atp)可以是等当量的，或者催化剂量的(通过配上atp再生体系，采用的是多聚磷酸激酶ppk与偏六磷酸)。
[0069]
酶相关信息：
[0070]
氨基酸连接酶(ligase adh2)：模板基因来源于放线杆菌(actinobacillus pleuropneu moniae)体内存在的一个l-氨基酸连接酶(uniprot：b0btg0)；以它为模板进行
改造。ligase adh2具体突变位点信息：h13t，f14l，n87q，l91a，k107n，v170c，e192p，p239n，s243i，p287v，t291w，y317m。
[0071]
多聚磷酸激酶(ppk)：来源于红色亚栖热菌(meiothermus ruber)(uniprotid：m9xb82)。
[0072]
酶的序列信息如表1、表2所示。
[0073]
表1
[0074][0075]
表2
[0076][0077]
附酶的发酵生产：本发明所需的酶都是通过商业公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得，具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后再下单到通用生物公司合成(安徽滁州)，再引进ndei/xhoi酶切位点并亚克隆到pet-28a表达载体上；确认序列正确的质粒转入e.coli(bl21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。具体包括将单菌落转入5ml含50μm卡那霉素的lb培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的lb培养液中，同样生长到对数期时转入5l培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5l发酵罐培养中，当细胞od～20时加入0.5mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm，20min)获得酶过量表达湿细胞25～50g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)缓冲液(50mm，ph 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心
除细胞壁后清液跑sds-page凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与tris.hcl缓冲液(50mm，ph 8.0)在低温混合均匀(以～10克湿细胞：200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm，45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在500～1000u/ml，u是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。lb培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％nacl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
[0078]
附酶活统计表如表3所示。
[0079]
表3
[0080]
性质ligase adh2ppk单位活力850～1000u/mg950～1400u/mg热稳定性(30℃)t
1/2
＝35mint
1/2
＝80min酶的表达量mg纯蛋白/升培养液400～600700～900
[0081]
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
[0082]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0083]
实施例1：利用连接酶(ligase adh2)制备脱羧肌肽(decarboxy carnosine)
[0084][0085]
在1l 100mm ph 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)溶液中加入16.6克组胺(150mm)，16克β-丙氨酸(180mm)，87.5克三磷酸腺苷单钠盐(atp，165mm)，然后通过naoh水溶液将反应体系ph值调节到7.5后，加入连接酶ligase adh2 2000u启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系ph在6.5～8.5之间，3小时后通过hplc检测到组胺原料基本反应完全，图1示hplc图。然后用hcl水溶液调节ph到2.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去蛋白固体，再将反应溶液ph调至7.0后，直接上样d201阴离子交换树脂纯化柱，去除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，3:1，v:v)得24.8克脱羧肌肽(收率91％)。经送样核磁和质谱，确认产物为脱羧肌肽。核磁图谱和质谱结果分别见图2、图3。1h nmr(400mhz,d2o)δ8.66(s,1h),7.34(s,1h),3.56(t,j＝6.5hz,2h),3.28(t,j＝6.5hz,2h),3.00(t,j＝6.5hz,2h),2.70(t,j＝6.5hz,2h).esi+:[m+h]
+
:183.1；[2m+h]
+
:365.3。
[0086]
实施例2：利用连接酶(ligase adh2)及atp再生系统制备脱羧肌肽(decarboxy carnosine)
[0087][0088]
在1l 100mm ph 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)溶液中加入16.6克组胺
(150mm)，16克β-丙氨酸(180mm)，2.7克三磷酸腺苷单钠盐(atp，5mm)，33.6克偏六磷酸钠(55mm)，调节溶液ph值到7.5后加入多聚磷酸激酶ppk酶3000u，加入连接酶ligase adh2 2000u启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系ph在6.5～8.5之间，3小时后通过hplc检测到组胺原料基本反应完全。然后用hcl水溶液调节ph到2.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去蛋白固体，再将反应溶液ph调至7.0后，直接上样d201阴离子交换树脂纯化柱，去除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，3:1，v:v)得25.9克脱羧肌肽(收率95％)。
[0089]
对比例：利用野生连接酶(b0btg0)、野生连接酶突变体(b0btg0-130)制备脱羧肌肽(decarboxy carnosine)
[0090]
对照组1：
[0091]
在1l 100mm ph 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)溶液中加入16.6克组胺(150mm)，16克β-丙氨酸(180mm)，87.5克三磷酸腺苷单钠盐(atp，165mm)，然后通过naoh水溶液将反应体系ph值到7.5后，加入野生连接酶b0btg0 2000u启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系ph在6.5～8.5之间，3小时后通过hplc检测到组胺原料还剩下60％，反应非常不完全。
[0092]
对照组2：
[0093]
在1l 100mm ph 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris.hcl)溶液中加入16.6克组胺(150mm)，16克β-丙氨酸(180mm)，87.5克三磷酸腺苷单钠盐(atp，165mm)，然后通过naoh水溶液将反应体系ph值到7.5后，加入野生连接酶b0btg0-130 2000u启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系ph在6.5～8.5之间，3小时后通过hplc检测到组胺原料还剩下30％，hplc见图4。
[0094]
表4：突变体b0btg0-130和本发明突变体的对比总结
[0095][0096]
突变体ligase adh2和突变体b0btg0-130对比，转化率提高了21％。
[0097]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.uniprot id为b0btg0的氨基酸连接酶的突变体，其特征在于，突变位点包括：第13位氨基酸残基突变为苏氨酸；和/或第14位氨基酸残基突变为苯丙氨酸；和/或第87位氨基酸残基突变为谷氨酰胺；和/或第91位氨基酸残基突变为丙氨酸；和/或第239位氨基酸残基突变为天冬酰胺；和/或第287位氨基酸残基突变为缬氨酸；和/或第291位氨基酸残基突变为色氨酸；和/或第317位氨基酸残基突变为甲硫氨酸。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，突变位点还包括：第107位氨基酸残基突变为天冬酰胺；和/或第170位氨基酸残基突变为半胱氨酸；和/或第192位氨基酸残基突变为脯氨酸；和/或第243位氨基酸残基突变为异亮氨酸。3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，具有：(1)、如seq id no:2所示的氨基酸序列；或(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；所述多个为2个至60个。4.编码如权利要求2或3所述的突变体的核酸分子，其特征在于，具有：(4)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至200个。5.表达载体，其特征在于，包括如权利要求4所述的核酸分子，以及可接受的基因元件。6.宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求5所述的表达载体。7.组合物，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的突变体和三磷酸腺苷。8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，还包括多聚磷酸激酶和多聚磷酸；所述多聚磷酸包括偏六磷酸。9.如下任意项在脱羧肌肽合成中的应用：(i)、如权利要求1至3任一项所述的突变体；(ii)、如权利要求4所述的核酸分子；(iii)、如权利要求5所述的表达载体；(iv)、如权利要求6所述的宿主细胞；(v)、如权利要求7或8所述的组合物。10.脱羧肌肽的制备方法，其特征在于，包括：
(a)、取原料与如权利要求1至3任一项所述的突变体混合，获得所述脱羧肌肽；或(b)、表达如权利要求4所述的核酸分子，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述脱羧肌肽；或(c)、表达如权利要求5所述的表达载体，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述脱羧肌肽；或(d)、培养如权利要求6所述的宿主细胞，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述脱羧肌肽；或(e)、取原料与如权利要求7或8所述的组合物混合，获得所述脱羧肌肽；所述原料包括β-丙氨酸和组胺。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及β-丙氨酸连接酶突变体及其应用。本发明提供了连接酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明利用放线杆菌体内的一个L-氨基酸连接酶能催化连接β-丙氨酸与其他氨基酸的特点，通过对其催化活性口袋以及其他相关部位氨基酸残基进行突变，最终获得高催化活性生产脱羧肌肽。该方法大大优于化学合成制备工艺，在生产成本、能耗、产品品质以及绿色指数方面都表现出突出的优势。因此该方法的规模化生产将是脱羧肌肽生产的优先选项。羧肌肽生产的优先选项。


技术研发人员：赵弘 丁颖 段晓伟 丁小妹 陈淋转 于铁妹 潘俊锋 刘建
受保护的技术使用者：珠海瑞德林生物有限公司
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/20