一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置及其制备方法、应用

1.本发明涉及生物芯片技术领域，尤其涉及一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置及其制备方法、在抗肿瘤药物或生物疗法中的应用。


背景技术：

2.微流控芯片是一种在微米尺度空间对流体进行操控的试验技术，通常由微腔室、微通道和功能化微结构构成，能将生物、化学等实验室基本功能微缩到几平方厘米的芯片上。器官芯片技术作为微流控芯片的一个分支，器官芯片可以根据细胞类型准确地调整与其生长和功能相关的环境条件，流动的培养基可以控制营养物质的供应，从细胞周围去除积累的细胞废物或次生代谢产物。此外，它还能调节氧合水平，提供剪应力，保证细胞层的屏障完整性，并能控制细胞在体外的迁移，能够更加仿生地模拟机体器官的生理、病理的功能和结构。因此，器官芯片在肿瘤研究领域中有着巨大潜能。研究表明，肿瘤血管在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着极为重要的作用，不仅为肿瘤组织生长提供了充足的氧气和营养物质，同时也为肿瘤的发展和转移提供了渠道。研究肿瘤血管对于了解肿瘤发生、发展、侵袭和转移的生物学行为和机制，以及抗肿瘤药物开发具有重要的应用价值。
3.另一方面，目前关于肿瘤的研究模型一般有三类，分别是二维肿瘤细胞培养、动物肿瘤模型和肿瘤类器官。传统的2d细胞培养无法重现肿瘤微环境，也缺乏细胞-细胞间、细胞-细胞外基质之间的相互作用。肿瘤动物模型可以弥补细胞模型的缺陷，模拟肿瘤的体内环境，但存在培养周期较长，成本高的缺点，无法进行高通量筛选药物和涉及实验伦理等一系列问题。肿瘤类器官保持了肿瘤的3d生长特性，对比2d细胞培养更能重现母体肿瘤特征，且药物筛选周期短、操作相对简单，经济实用。但肿瘤类器官往往来自肿瘤组织或细胞株等单一细胞类群，特别是缺乏实体瘤中的血管内皮细胞和免疫细胞等组成的肿瘤微环境，以及无法提供体内的流体剪切力。
4.此外，传统的肿瘤血管形成研究主要依赖孔板实验和血管形成实验。通过血管内皮细胞的条件培养基观察其对血管内皮管腔样结构形成的影响。该方法虽然操作简便，但这种基于二维细胞培养的方式与体内的血管形成过程差异较大。另外现有的器官芯片多是实现二维平面细胞培养，只能模拟器官的单一模式功能，不能模拟完整血管屏障功能，无法针对性研究肿瘤微环境中肿瘤细胞和外周血管的相互作用。因此亟需一种更加仿生的肿瘤-血管体外研究模型。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其结构简单，可对人体和动物的肿瘤细胞和血管细胞进行共培养，为抗肿瘤药物筛选和肿瘤生物治疗方法的开发提供良好的基础。
6.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养
的装置的制备方法。
7.本发明还要解决的技术问题在于，提供上述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置在制备、筛选、评价用于治疗肿瘤的药物或在筛选、评价用于治疗肿瘤的生物治疗方法中的应用。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其包括上层芯片、下层芯片和多孔膜，所述多孔膜封接于所述上层芯片和所述下层芯片之间；
9.所述上层芯片设有用于构建肿瘤组织或血管组织的上流体通道，所述下层芯片设有用于构建血管组织或肿瘤组织的下流体通道；所述多孔膜上设有多个通孔，所述上流体通道、下流体通道通过所述多孔膜上的通孔实现流体交换。
10.作为上述技术方案的改进，所述上流体通道的体积与所述下流体通道的体积之比为(1.1～2):1；
11.所述上流体通道的高度与所述下流体通道的高度之比为(1～1.5):1；
12.所述上流体通道的高度与所述多孔膜的厚度之比为(3.5～5):1。
13.作为上述技术方案的改进，所述上流体通道的高度为100～150μm，长度为8～15mm，宽度为0.5～2mm；
14.所述下流体通道的高度为80～110μm，长度为8～15mm，宽度为0.5～2mm；
15.所述多孔膜的厚度为25～35μm，所述通孔的孔径为5～10μm。
16.作为上述技术方案的改进，所述上层芯片由聚二甲基硅氧烷、氢化苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚乙烯中的一种或多种制成；
17.所述下层芯片由聚二甲基硅氧烷、氢化苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚乙烯中的一种或多种制成；
18.所述多孔膜由聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚乙烯、海藻酸、壳聚糖或明胶中的一种或多种制成。
19.作为上述技术方案的改进，所述上层芯片、下层芯片、多孔膜均由聚二甲基硅氧烷制成。
20.作为上述技术方案的改进，所述肿瘤组织为人或动物的实体瘤组织。
21.作为上述技术方案的改进，所述肿瘤组织选自结肠癌、直肠癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌或肥大细胞瘤的组织或相应细胞株中的一种或多种。
22.作为上述技术方案的改进，所述肿瘤组织选自结肠癌，其由小鼠结肠癌细胞系ct26培养而得；
23.所述血管组织由小鼠血管内皮细胞系c166培养而得。
24.作为上述技术方案的改进，所述上流体通道用于构建肿瘤组织的培养环境，所述下流体通道用于构建血管组织的培养环境。
25.相应的，本发明还公开了一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法，用于制备上述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其包括：
26.分别制备上层芯片、下层芯片和多孔膜，并将所述多孔膜封接于所述上层芯片和下层芯片之间，得到微流控芯片；其中，所述上层芯片设有上流体通道，所述下层芯片设有下流体通道；
dap的lb琼脂平板或含25μg/ml氯霉素、50μg/mldap的lb肉汤培养，yb1-td tomato(卡那霉素抗性)采用含25μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素、50μg/ml dap的lb琼脂平板或含50μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素、25μg/ml dap的lb肉汤培养。
50.工程细菌治疗疗效的测试方法如下：
51.(1)利用孔板实验cck8方法检测溶瘤菌yb1对肿瘤/血管内皮细胞毒性实验：提前一天制备细胞悬液铺96孔板，细胞密度为20000个/孔。12h后将96孔板细胞培养液更换为无抗生素的dmem培养基。第二天将过夜摇菌的yb1菌液用含dap的dmem培养基稀释到目的浓度，将96孔板分组、标记，依次加入不同moi(moi值＝菌：细胞)的菌液，加菌后沉淀2h。吸去菌液，用pbs清洗一遍，再加入含50μg/ml庆大霉素的dmem培养基作用0.5-1h，杀灭未侵入细胞胞内的yb1。之后将培养基更换为含20μg/ml庆大霉素的dmem培养基持续培养。期间根据实验设计定时加入含10％ cck8的新鲜培养基反应1-2h，最后在酶标仪下检测吸光度a450，记录并分析数据。
52.(2)利用live/dead
tm
细胞成像试剂盒(488/570)检测细胞凋亡，购自美国赛默飞公司。通过将工作液混匀注入芯片，避光孵育15min，洗去反应液，在共聚焦显微镜下观察拍照。
53.(3)在肿瘤血管内皮细胞体外共培养的装置上使用cck8方法检测细胞毒性：细菌在肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置上共培养30h后，停止灌流培养。将芯片的上流体通道、下流体通道的进口端软管拔掉，加入30μl稀释十倍的cck8试剂，等待反应2h，移液器吸取溶液检测吸光度。
54.(4)厌氧肿瘤细胞-血管内皮细胞共培养的装置的工程沙门菌yb1侵染模型表征：肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置在yb1侵染后细胞受到一定的损伤，因此不宜使用live/dead染色。首先采用均表达gfp(绿色荧光)的ct26和c166构建厌氧肿瘤-血管共培养芯片。将表达td tomato(红色荧光)的yb1稀释后加入芯片，沉降2h后打开注射泵开始灌流共培养30h。下泵后经4％多聚甲醛固定后在工具聚焦显微镜的fitc通道和cy3通道下观察记录。
55.实施本发明，具有如下有益效果：
56.本发明的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，包括上层芯片、下层芯片和多孔膜，多孔膜封接于上层芯片和下层芯片之间；上层芯片设有用于构建肿瘤组织或血管组织的上流体通道，下层芯片设有用于构建血管组织或肿瘤组织的下流体通道；多孔膜上设有多个通孔，上流体通道、下流体通道通过所述多孔膜上的通孔实现流体交换。基于该肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，可对肿瘤细胞和血管细胞进行共培养，并可给予外界的不同干预措施进行多种观察。该肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置可用于人体和动物肿瘤细胞的生物学研究和相互作用研究，还可以用于评价研发抗肿瘤药物、溶瘤细菌、溶瘤病毒和免疫细胞治疗肿瘤等新型生物疗法的效果等，为研究人体和动物肿瘤组织中肿瘤细胞与血管内皮细胞的相互作用和机制、干预治疗的策略和效应等，提供了仿生、周期短、制备简单和经济实用的模型，在人体和动物医学领域的基础研究、药物研发和肿瘤生物治疗的应用中具有巨大应用潜力。
附图说明
57.图1是本发明一实施例中肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的结构示意图；
58.图2是本发明另一实施例中小鼠厌氧结肠癌-血管细胞体外共培养的装置的模型示意图；
59.图3本发明又一实施例中小鼠结肠癌-血管细胞体外共培养的装置的剖面模型示意图；
60.图4是本发明一实施例中肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法流程图；
61.图5是本发明实施例2中构建得到的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的共聚焦显微镜检测结果图；
62.图6是本发明实施例3中血管屏障功能表征图；
63.图7是本发明实施例4中光学显微镜下观察yb1侵染肿瘤细胞孔板模型的结果图(moi 1000)，其中，a为加菌前，b为yb1侵染12h后，c为yb1侵染24h后；
64.图8是本发明实施例4中yb1侵染肿瘤细胞孔板试验检测24h后的细胞死亡情况图(moi 500)；
65.图9是本发明实施例4中不同moi剂量yb1侵染肿瘤不同时间后细胞活力变化情况图；其中，a为高moi，b为低moi；
66.图10是本发明实施例5中光学显微镜下观察yb1侵染内皮孔板模型的结果图(moi 1000)，其中，a为加菌前，b为yb1侵染12h后，c为yb1侵染24h后；
67.图11是本发明实施例5中yb1侵染内皮24h后细胞死亡情况图(moi 500)
68.图12是本发明实施例5中不同moi剂量yb1侵染内皮不同时间后细胞活力变化情况图，其中，a为高moi，b为低moi；
69.图13是本发明实施例6中厌氧肿瘤-血管芯片30h后在共聚焦荧光显微镜下表征图，其中，绿色荧光中红色虚线以上表示内皮层，红色虚线以下表示肿瘤层；
70.图14是本发明实施例6中yb1侵袭厌氧肿瘤-血管芯片30h后在共聚焦荧光显微镜下表征图，其中，绿色荧光中红色虚线以上表示内皮层，红色虚线以下表示肿瘤层，橙色荧光表示的是表达tdtomato的yb1；
71.图15是本发明实施例6中yb1侵袭厌氧肿瘤-血管芯片中肿瘤细胞的表征图；其中，绿色荧光指示肿瘤，红色荧光指示yb1-tdtomato；
72.图16是本发明实施例6中cck8检测yb1对于肿瘤-血管的细胞毒性试验结果图。
具体实施方式
73.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
74.参考图3，作为本发明的第一个方面，本发明提供了一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，包括上层芯片1、下层芯片2和多孔膜3，多孔膜3封接于上层芯片1和下层芯片2之间；上层芯片1设有用于构建肿瘤组织或血管组织的上流体通道11，下层芯片2设有用于构建血管组织或肿瘤组织的下流体通道21；多孔膜3上设有多个通孔31，上流体通道
11、下流体通道21通过多孔膜3上的通孔31实现流体交换。这种结构的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置无需传统的玻璃基底，结构简单。且可对肿瘤细胞和血管细胞进行共培养，可以实时、直观地观察肿瘤与基质、血管细胞间的相互作用，构建难度低、组成简单。
75.优选的，在本发明的一个实施例中，上流体通道11用于构建肿瘤组织的培养环境，下流体通道21用于构建血管组织的培养环境。
76.其中，上流体通道11的体积与下流体通道21的体积之比为(1.1～2):1，上流体通道11的高度与下流体通道21的高度之比为(1～1.5):1。示例性的，上流体通道11的体积与下流体通道21的体积之比为1.2:1、1.4:1、1.6:1或1.8:1，但不限于此。上流体通道11的高度与下流体通道21的高度之比为1.1:1、1.2:1、1.3:1或1.4:1，但不限于此。上流体通道11的高度与多孔膜3的厚度之比为(3.5～5):1。示例性的为3.6:1、4:1、4.3:1、4.6:1或4.8:1，但不限于此。
77.具体的，在本发明的一个实施例之中，上流体通道的高度为100～150μm，长度为8～15mm，宽度为0.5～2mm；下流体通道的高度为80～110μm，长度为8～15mm，宽度为0.5～2mm；多孔膜的厚度为25～35μm，通孔的孔径为5～10μm。
78.其中，上层芯片1由聚二甲基硅氧烷、氢化苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚乙烯中的一种或多种制成，但不限于此。下层芯片2由聚二甲基硅氧烷、氢化苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚乙烯中的一种或多种制成，但不限于此。多孔膜由聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚乙烯、海藻酸、壳聚糖或明胶中的一种或多种制成，但不限于此。优选的，在本发明的一个实施例之中，上层芯片1、下层芯片2、多孔膜3均由聚二甲基硅氧烷制成。
79.其中，肿瘤组织由肿瘤细胞培养而得，肿瘤细胞可来源于人或其他动物，优选的为上皮细胞，肿瘤组织为人或动物实体瘤组织或相应的细胞株，具体的肿瘤组织选自结肠癌、直肠癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、肝癌或胰腺癌或肥大细胞瘤的组织或相应细胞株中的一种或多种，但不限于此。优选的，在本发明的一个实施例之中，肿瘤组织选自动物的结肠癌，其由小鼠结肠癌细胞系ct26培养而得。
80.其中，血管组织由血管细胞(血管内皮细胞)培养而得，血管细胞可源于人或其他动物。优选的，在本发明的一个实施例之中，血管组织由小鼠血管内皮细胞系c166培养而得。
81.参考图4，作为本发明的第二个方面，本发明提供了一种上述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法，其包括以下步骤：
82.s1：分别制备上层芯片、下层芯片和多孔膜，并将多孔膜封接于上层芯片和下层芯片之间，得到微流控芯片；
83.具体的，上层芯片、下层芯片、多孔膜通过热压成型法、注射成型法、模塑成型法、激光烧蚀法或光刻成型法制备而得，但不限于此。
84.优选的，在本发明的一个实施例之中，s1包括：
85.s11：提供硅衬底，在硅衬底上光刻形成上流体通道模板，将芯片材料浇注至上流体通道模板，固化后得到上层芯片；
86.具体的，可通过软光刻工艺在硅衬底上光刻形成上流体通道模板，其具体的可包
括：清洗、干燥硅衬底——旋涂光刻胶(su-8)——干燥——掩膜光刻——曝光、干燥——冷却——清洗去除光刻胶——坚膜。
87.在得到上流体通道模板后，将芯片材料浇注到上流体通道模板，经脱气、固化、脱模、清洗、打孔后得到上层芯片。
88.s12：提供硅衬底，在硅衬底上光刻形成下流体通道模板，将芯片材料浇注至下流体通道模板，固化后得到下层芯片；
89.具体的，可通过软光刻工艺在硅衬底上光刻形成下流体通道模板，其具体的可包括：清洗、干燥硅衬底——旋涂光刻胶(su-8)——干燥——掩膜光刻——曝光、干燥——冷却——清洗去除光刻胶——坚膜。
90.在得到上流体通道模板后，将芯片材料浇注到上流体通道模板，经脱气、固化、脱模、清洗、打孔后得到下层芯片。
91.s13：提供硅衬底，在硅衬底上光刻形成多孔膜模板，将多孔膜材料浇注至多孔膜模板，固化后得到多孔膜；
92.具体的，可通过软光刻工艺在硅衬底上光刻形成多孔膜模板，其具体的可包括：清洗、干燥硅衬底——旋涂光刻胶(su-8)——干燥——掩膜光刻——曝光、干燥——冷却——清洗去除光刻胶——坚膜。
93.在得到上流体通道模板后，将多孔膜材料浇注到多孔膜模板，经脱气、固化、脱模、清洗后得到多孔膜。
94.需要说明的是，步骤s11、s12、s13不分先后，可依次执行，也可同时执行，还可先执行任意一个或两个步骤，再执行剩余的步骤。
95.s14：将下层芯片与多孔膜封接，然后与上层芯片封接，得到微流控芯片。
96.具体的，可通过热处理键合、溶剂键合、等离子键合、激光键合、胶粘键合、微波键合等工艺实现封接，但不限于此。优选的，在本发明的一个实施例之中，先将下层芯片、多孔膜、上层芯片进行等离子活化处理，然后封接。
97.s2：将肿瘤细胞接种于上流体通道或下流体通道，将血管细胞接种于下流体通道或上流体通道，向上流体通道、下流体通道注入培养液，培养预设时间，即得肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置。
98.具体的，s2包括：
99.s21：分别采用细胞外基质对上流体通道、下流体通道进行预处理，灌注培养液；
100.其中，所采用的细胞外基质可为纤粘连蛋白(fibronetin，fn)、i型胶原蛋白(collagen-i)、基质胶(matrigel)、v型胶原蛋白(collagen-v)、明胶(gelatin)、层粘连蛋白(laminin)等，但不限于此。细胞外基质预处理可创造良好的接种条件，使贴壁细胞在芯片材料上更易贴附并呈现良好的生长状态。其中，所采用的培养液可根据具体的细胞类型选取。在本发明的一个实施例之中，培养液为含有8～20v％胎牛血清、0.5～1.5v％青链霉素的dmem完全培养基。
101.优选的，在本发明的一个实施例之中，s21包括：
102.s211：将纤粘连蛋白用pbs稀释至预设浓度，得到第一稀释液；
103.其中，第一稀释液中纤粘连蛋白(fibronetin，fn)的浓度为40～70mg/ml，示例性的为43mg/ml、52mg/ml、58mg/ml、61mg/ml、63mg/ml或67mg/ml，但不限于此。优选的，纤粘连
蛋白的浓度为45～60mg/ml，更优选的为50mg/ml。
104.s212：将i型胶原蛋白和基质胶用dmem基础培养基稀释至预设浓度，得到第二稀释液；
105.其中，第二稀释液中i型胶原蛋白(collagen-i)的浓度为10～40mg/ml，示例性的为15mg/ml、22mg/ml、25mg/ml、34mg/ml或38mg/ml，但不限于此。优选的，i型胶原蛋白的浓度为20～35mg/ml，更优选的为30mg/ml。
106.其中，第二稀释液中基质胶(matrigel)的浓度为80～120mg/ml，示例性的为85mg/ml、91mg/ml、95mg/ml、103mg/ml或115mg/ml，但不限于此。优选的基质胶的浓度为95～110mg/ml，更优选的为100mg/ml。
107.s213：将第一稀释液注入下流体通道，将第二稀释液注入上流体通道，在30～40℃下静置1.5～3h；
108.s214：在上流体通道、下流体通道中同时注入培养液；
109.具体的，可通过微量注射泵向上流体通道、下流体通道注入培养液。注入流速为20～50μl/h，示例性的为25μl/h、30μl/h、35μl/h、40μl/h或45μl/h，但不限于此。优选的，注入流速为20～40μl/h；更优选为30μl/h。在接种前，持续注入8～16h。
110.其中，培养液为含有8～20v％胎牛血清、0.5～1.5v％青链霉素的dmem完全培养基，但不限于此。
111.s22：在下流体通道接种血管细胞，静置预设时间；
112.具体的，将预先复苏的血管细胞消化、重悬后接种到下流体通道，然后封闭下流体通道的出口、入口。在培养箱(30～45℃)中倒扣静置2～5h。
113.s23：在上流体通道接种肿瘤细胞，静置预设时间；
114.具体的，将预先复苏的肿瘤细胞消化、重悬后接种到上流体通道，然后封闭上流体通道的出口、入口。在培养箱(30～45℃)中正置静置2～5h。
115.s24：以预设速度向上流体通道、下流体通道注入培养液，灌流培养2～5天，得到肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置。
116.具体的，可通过微量注射泵向上流体通道、下流体通道注入培养液。注入流速为20～50μl/h，示例性的为25μl/h、30μl/h、35μl/h、40μl/h或45μl/h，但不限于此。优选的，注入流速为20～40μl/h；更优选为30μl/h。
117.下面以具体实施例对本发明进行进一步说明：
118.实施例1微流控芯片及其制备方法
119.本实施例提供一种微流控芯片，参见图1～图3，其包括上层芯片1、下层芯片2和多孔膜3，多孔膜3封接于上层芯片1和下层芯片2之间；上层芯片1设有用于构建肿瘤组织的上流体通道11，下层芯片2设有用于构建血管组织的下流体通道21；多孔膜3上设有多个通孔31，上流体通道11、下流体通道21通过多孔膜3上的通孔31实现流体交换。其中，上流体通道11的体积与下流体通道21的体积之比为1.19:1。上流体通道11的高度为125μm，长度为10mm，宽度为1mm；下流体通道的高度为105μm，长度为10mm，宽度为1mm；多孔膜的厚度为32.5μm，通孔的孔径为5μm。上层芯片1、下层芯片2、多孔膜3均由聚二甲基硅氧烷制成。
120.上述微流控芯片的制备方法为：
121.(1)提供硅衬底，以su-8为光刻胶，采用软光刻工艺分别形成上流体通道模板、下
流体通道模板和多孔膜模板；
122.(2)将pdms聚二甲基硅氧烷预聚物分别浇注到上流体通道模板、下流体通道模板和多孔膜模板中，固化得到上层芯片、下层芯片和多孔膜；
123.(3)将上层芯片、下层芯片和多孔膜进行等离子体活化处理，然后先将多孔膜与下层芯片封接，撕去出入口部位的多孔膜；然后与上层芯片封接，封接后，撕去上流体通道入口、出口处的多孔膜。
124.实施例2肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法
125.本实施例提供一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法，包括以下步骤：
126.(1)将复苏后的结肠癌细胞系ct26和血管内皮细胞系c166细胞分别接种于培养瓶中培养，待细胞生长至细胞对数生长期；
127.(2)将纤粘连蛋白(fibronetin，fn)用磷酸盐缓冲液pbs稀释(浓度为50mg/ml)，得到第一稀释液；将i型胶原蛋白(collagen
‑ⅰ
)和基质胶(matrigel)用dmem基础培养基稀释(浓度分别为30mg/ml和100mg/ml)，得到第二稀释液；将第一稀释液注入实施例1所得的微流控芯片的下流体通道，将第二稀释液注入其上流体通道，置于37℃co2培养箱静置2h。紧接着，采用软管与微流控芯片各入口连接，设置微量注射泵流速为30μl/h，过夜灌注含10％胎牛血清、1％青链霉素混合液的dmem完全培养基。
128.(3)将步骤(1)获得的c166消化处理，消化后培养基重悬、计数，细胞接种密度为1
×
107个/ml。移液枪吸取20μl c166细胞悬液，注入下流体通道，接着夹闭流体出入口，夹闭出入口，在37℃co2培养箱中倒扣静置3.5h。
129.(4)将步骤(1)获得的ct26消化处理，消化后培养基重悬、计数，细胞接种密度为1
×
107个/ml。移液枪吸取20μl ct26细胞悬液，注入上流体通道，接着夹闭流体出入口，夹闭出入口，在37℃co2培养箱中倒扣静置2.5h；
130.(5)打开所有流体出口、入口，正置于37℃co2培养箱中，设置微量注射泵流速为30μl/h，芯片灌流培养2-4天，即得。
131.选用ct26-gfp和c166-mcherry重复以上步骤制备小鼠常氧结肠癌-血管内皮细胞体外共培养的装置，在共聚焦荧光显微镜下观察芯片三维立体结构。如图5所示，从图中可以看出，实施例1构建的微流控芯片中能够实现小鼠结肠癌细胞和小鼠血管细胞共培养并保持较好的活力。
132.实施例3利用细胞免疫荧光技术评价小鼠常氧结肠癌-血管内皮细胞体外共培养的装置的血管屏障功能
133.取实施例2制得的小鼠常氧结肠癌-血管内皮细胞体外共培养的装置，将下流体通道用pbs冲洗3次，向下流体通道内注入4％多聚甲醛固定15分钟，pbs冲洗3次，加入0.1％triton x-100通透细胞5分钟，pbs冲洗3次，注入5％ bsa封闭液，室温下孵育细胞1h。pbs冲洗3次后加入1％ bsa溶液稀释后的anti-ve cadherin抗体4℃孵育过夜。次日复温后pbs冲洗5次，加入dapi染色液，室温下复染5min，用pbs洗去染色液，避光于激光共聚焦显微镜下观察。蓝色荧光为内皮细胞核，紫色荧光为ve钙粘蛋白cadherin，荧光结果显示芯片上内皮细胞的ve钙粘蛋白表达完整，细胞排列紧密，已形成较完整的血管屏障。如图6所示。
134.实施例4工程沙门氏菌yb1侵染小鼠结肠癌细胞孔板实验(图7)
135.所用的细胞：小鼠结肠癌细胞系ct26(购自浙江美森细胞科技有限公司，编号ctcc-001-0321)、血管内皮细胞系c166(购自atcc，编号是crl-2581)
136.所用的细菌：工程沙门氏菌yb1(由香港大学黄建东教授课题组惠赠)
137.所用的试剂与耗材：lb细菌培养基lb(广东环凯微生物科技有限公司,no.028324)，lb细菌培养琼脂板(广东环凯微生物科技有限公司,no.028334)，fibronectin(sigma-aldrich,no.86088-83-7)，pbs，i型胶原蛋白(bd,no.354236)，基质胶(matrigel)(corning,no.356231)，dmem(no.c11995500bt，gibco)，dap(二氨基庚二酸，sigma-aldrich,no.583-93-7)培养皿，离心管，细胞计数板，比色皿等。
138.所用的实验设备：离心机，培养箱，酶标仪等。
139.本实施例操作步骤如下：
140.(1)铺板：第一天根据细胞的标准曲线，收集处于对数生长期的细胞后稀释细胞悬液，在细胞自动计数仪下检测细胞密度，调整细胞悬液至每孔20000个细胞，每孔100ul接种到96孔板；
141.(2)加菌前处理：加菌前一天，把96孔板的培养液更换为无抗生素dmem培养基；
142.(3)yb1活化：将冻存的yb1菌种从-80℃冰箱取出置于冰上，于超净工作台内使用无菌枪头蘸取菌种，并在带有氯霉素和dap的lb琼脂平板上划线，然后将其置于37℃培养箱内过夜培养。第二日取出平板观察菌落生长情况，挑取平板上生长旺盛且单独生长的单菌落，接种于新鲜无菌的氯霉素抗性和dap肉汤培养基内，200r/min摇菌培养(培养温度为37℃)；
143.(4)加菌侵染：根据实验设计，用含氯霉素和dap的dmem培养基梯度稀释菌液至相应的moi浓度，弃去孔板中旧培养基，加入yb1稀释液沉淀2小时；(5)侵染后处理：弃去孔板内液体，加入pbs水洗后吸去，加入含50μg/ml庆大霉素dmem培养基处理2小时，此后更换培养基为含20μg/ml庆大霉素dmem维持；
144.(6)光学显微镜下观察yb1侵染细胞孔板模型，拍照记录并分析；
145.(7)死/活细胞染色：按操作方法先用pbs水洗孔板细胞2遍，接着加入预先混好的工作液孵育15min，随后pbs缓慢冲洗3遍，避光在共聚焦显微镜下观察细胞的死亡情况；
146.(8)cck8检测：固定在某个时间点取样，在孔板中加入10ul cck-8溶液反应2小时，在酶标仪下检测吸光度a450，检测孔板细胞生长活力，记录并统计分析数据、绘制细胞毒性曲线。
147.常规光学显微镜观察结合细胞死活染色结果可以得到，在ct26中加入yb1后细胞出现大量的死亡现象，且随yb1侵袭时间延长，细胞死亡增加，如图7，图8所示。在对比不同moi剂量yb1侵染肿瘤不同时间后细胞活力变化时，发现发现在高浓度组中，yb1对肿瘤ct26的毒性作用没有明显的剂量关系。对照组和yb1各组相比，在0-72小时内，yb1组的细胞活力均低于对照组，表明yb1的侵袭显著抑制ct26；yb1作用效果与yb1剂量没有明显的相关性；在0-24小时内，yb1组的细胞仍能缓慢增长，在24-48小时内细胞活力显著下降，在48小时左右生长活力达到最低，48-72小时细胞缓慢增长，进入了平台期。提示了高moi剂量过高而导致没能观察到yb1作用效果与yb1剂量没有明显的相关性。接着设计低moi剂量梯度，moi值分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001，发现moi＝100组、moi＝10组、moi＝1组对肿瘤有显著抑制作用，综合分析moi＝1为yb1抑制肿瘤ct26的最低有效剂量，如图9所示。
148.实施例5工程沙门氏菌yb1侵染小鼠血管内皮细胞孔板实验
149.所用实验耗材与设备同上，采用c166重复实施例4的步骤1-9。
150.常规光学显微镜观察结合死/活细胞染色结果可以得到，在c166中加入yb1后，死亡细胞也增多了，但死亡、凋亡情况不及ct26中的严重，如图10，图11所示。在对比不同moi剂量yb1侵染内皮不同时间后细胞活力变化时，而在高moi剂量yb1侵染内皮c166细胞,对内皮有显著抑制作用，但yb1作用效果与yb1剂量没有明显的相关性，总的来说，在整个过程中呈现出了相似的现象：在0-24小时内细胞活力下降，在24-48小时上升达到峰值，甚至高于对照，48-72小时又显著下降，提示可能是细胞本身在抵御yb1的毒性作用。
151.为模拟血管运输肿瘤治疗药物等试剂，我们测试了不损伤内皮的剂量，测试了低moi剂量yb1对内皮c166的毒性作用效果。综合分析moi＝1时yb1对内皮没有明显的毒性作用。值得注意的是，yb1低moi可能会促进内皮的生长。
152.实施例6应用微流控芯片研究工程沙门氏菌yb1对小鼠厌氧结肠癌-血管内皮细胞体外共培养的装置的干预
153.利用实施例1的微流控芯片制备一种小鼠厌氧结肠癌细胞-血管内皮细胞共培养装置的方法，包括如下步骤：
154.(1)将复苏后的结肠癌细胞系ct26和血管内皮细胞系c166细胞分别接种于培养瓶中培养，待细胞生长至细胞对数生长期；
155.(2)将i型胶原蛋白(collagen
‑ⅰ
)和基质胶(matrigel)用dmem基础培养基稀释(浓度分别为30mg/ml和100mg/ml)，将纤粘连蛋白(fibronetin，fn)用磷酸盐缓冲液pbs稀释(浓度为50mg/ml)，先在芯片的制备装置下通道的入口注入胶原稀释液，在芯片的制备装置上通道的入口注入纤粘连蛋白溶液，将装置至于37℃培养箱静置2h，紧接着，将软管与芯片各入口连接，设置微量注射泵流速为30μl/h，过夜灌注含10％胎牛血清、1％青链霉素混合液的dmem完全培养基；
156.(3)将步骤(1)获得的ct26消化处理，消化后培养基重悬，取制备的ct26细胞液加到芯片的下通道中，夹闭出入口，在37培养箱中倒置2-3h；
157.(4)将步骤(1)获得的c166消化处理，消化后培养基重悬，备用；取制备的c166细胞液加到制备装置的芯片上层通道中，夹闭出入口，在37培养箱中正置2-3h；打开上、下通道的进出口，通过注射器持续通入流动新鲜培养液，灌流培养1天；
158.(5)提前将10％胎牛血清的dmem培养基置于厌氧培养箱中除氧2h，用注射器分装除氧后完全培养基，同时用注射器分装未除氧的10％胎牛血清的dmem培养基；
159.(6)将步骤(4)获得的小鼠结肠癌-血管芯片先转移至密闭厌氧盒中，注射器由输液管经厌氧盒的孔洞与芯片相连。
160.(7)整理输液管和注射器，将厌氧盒转移至厌氧培养箱中，接着将芯片的各进出口端软管夹闭，用分装除氧培养基的注射器替换原本连接芯片下通道的注射器，用分装未除氧培养基的注射器替换原本连接芯片上通道的注射器，同时排出残留在输液管的旧培养基，最后打开所有进出口，用凡士林封闭厌氧盒孔洞，放进产气袋和氧气指示剂，关闭厌氧盒。
161.(8)从厌氧箱中取出厌氧盒，通入流动新鲜培养液，灌流培养1天以上。在共聚焦显微镜下拍照记录。
162.(9)工程沙门氏菌的培养：将冻存的yb1菌种从-80℃冰箱取出置于冰上，于超净工作台内使用无菌枪头蘸取菌种，并在带有氯霉素抗性和dap的lb琼脂平板上划线，然后将其置于37℃培养箱内过夜培养。第二日取出平板观察菌落生长情况，挑取平板上生长旺盛且单独生长的单菌落，接种于新鲜无菌的氯霉素抗性和dap肉汤培养基内，200r/min摇菌培养(培养温度为37℃)。
163.(10)在加入细菌前将已培养好的肿瘤芯片上流体通道、下流体通道使用的含10％胎牛血清、1％青链霉素混合液的dmem完全培养基更换为不带抗生素的dmem完全培养基。
164.(11)制备菌液：将处于对数期的细菌菌液在室温下以10000r/min离心1min。去除上清后，使用含dap的dmem完全培养基将细菌重悬到光密度为0.1。然后，使用一次性1ml无菌注射器吸取细菌悬液，由下流体通道出口处注入实施例2得到的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置内。待细菌沉降1h后，重复步骤(7)(8)
165.(12)cck8方法检测细菌作用下对于细胞的毒性：细菌在肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置上共培养30h后，停止灌流培养。将芯片的上流体通道、下流体通道的进口端软管拔掉，加入30ul稀释十倍的cck8试剂，等待反应2h，移液器吸取溶液检测吸光度。
166.在共聚焦显微镜下观察厌氧肿瘤血管芯片，可以看到两层细胞生长较好，形成紧密的细胞单层，其中绿色荧光中红色虚线以上表示内皮层，红色虚线以下表示肿瘤层，如图13所示。在共聚焦显微镜下观察yb1侵染厌氧肿瘤血管芯片，可以看到内皮层(红色虚线以上)的橙色荧光较少，主要聚集在肿瘤层(红色虚线以下)，提示yb1在厌氧条件穿过血管层靶向聚集在肿瘤层中，如图14所示。图15中可以看出，在moi＝1时沙门菌yb1侵染肿瘤血管芯片导致小鼠结肠癌细胞存活率显著下降，与孔板实验结果一致，表明小鼠结肠癌-血管芯片能够作为评估溶瘤菌疗效的有效体外模型。应用graphpad8.0软件进行数据处理及统计，采用t检验。所计算的p值为0.0308，提示有统计学意义(重复样本为三块小鼠厌氧结肠癌-血管内皮细胞体外共培养的装置)。
167.以上所述仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

技术特征：
1.一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，包括上层芯片、下层芯片和多孔膜，所述多孔膜封接于所述上层芯片和所述下层芯片之间；所述上层芯片设有用于构建肿瘤组织或血管组织的上流体通道，所述下层芯片设有用于构建血管组织或肿瘤组织的下流体通道；所述多孔膜上设有多个通孔，所述上流体通道、下流体通道通过所述多孔膜上的通孔实现流体交换。2.如权利要求1所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，所述上流体通道的体积与所述下流体通道的体积之比为(1.1～2):1；所述上流体通道的高度与所述下流体通道的高度之比为(1～1.5):1；所述上流体通道的高度与所述多孔膜的厚度之比为(3.5～5):1。3.如权利要求1或2所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，所述上流体通道的高度为100～150μm，长度为8～15mm，宽度为0.5～2mm；所述下流体通道的高度为80～110μm，长度为8～15mm，宽度为0.5～2mm；所述多孔膜的厚度为25～35μm，所述通孔的孔径为5～10μm。4.如权利要求1所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，所述上层芯片由聚二甲基硅氧烷、氢化苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚乙烯中的一种或多种制成；所述下层芯片由聚二甲基硅氧烷、氢化苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚乙烯中的一种或多种制成；所述多孔膜由聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚乙烯、海藻酸、壳聚糖或明胶中的一种或多种制成。5.如权利要求1或4所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，所述上层芯片、下层芯片、多孔膜均由聚二甲基硅氧烷制成。6.如权利要求1所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，所述肿瘤组织为人或动物的实体瘤组织。7.如权利要求1或6所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，所述肿瘤组织选自结肠癌、直肠癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌或肥大细胞瘤的组织或相应细胞株中的一种或多种。8.如权利要求1所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，所述肿瘤组织选自结肠癌，其由小鼠结肠癌细胞系ct26培养而得；所述血管组织由小鼠血管内皮细胞系c166培养而得。9.如权利要求1所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，所述上流体通道用于构建肿瘤组织的培养环境，所述下流体通道用于构建血管组织的培养环境。10.一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法，用于制备如权利要求1～9任一项所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置，其特征在于，包括：分别制备上层芯片、下层芯片和多孔膜，并将所述多孔膜封接于所述上层芯片和下层芯片之间，得到微流控芯片；其中，所述上层芯片设有上流体通道，所述下层芯片设有下流体通道；将肿瘤细胞接种于所述上流体通道或所述下流体通道，将血管细胞接种于所述下流体
通道或所述上流体通道，向所述上流体通道、下流体通道注入培养液，培养预设时间，即得肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置。11.如权利要求10所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法，其特征在于，所述上层芯片、下层芯片、多孔膜通过热压成型法、注射成型法、模塑成型法、激光烧蚀法或光刻成型法制备而得。12.如权利要求10所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法，其特征在于，所述分别制备上层芯片、下层芯片和多孔膜，并将所述多孔膜封接于所述上层芯片和下层芯片之间，得到微流控芯片的步骤包括：提供硅衬底，在所述硅衬底上光刻形成上流体通道模板，将芯片材料浇注至所述上流体通道模板，固化后得到上层芯片；提供硅衬底，在所述硅衬底上光刻形成下流体通道模板，将芯片材料浇注至所述下流体通道模板，固化后得到下层芯片；提供硅衬底，在所述硅衬底上光刻形成多孔膜模板，将多孔膜材料浇注至所述多孔膜模板，固化后得到多孔膜；将所述下层芯片与所述多孔膜封接，然后与所述上层芯片封接，即得到微流控芯片。13.如权利要求10所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法，其特征在于，所述将肿瘤细胞接种于所述上流体通道或下流体通道，将血管细胞接种于所述下流体通道或所述上流体通道，向所述上流体通道、下流体通道注入培养液，培养预设时间的步骤包括：分别采用细胞外基质对所述上流体通道、下流体通道进行预处理，灌注培养液；在所述下流体通道接种血管细胞，静置预设时间；在所述上流体通道接种肿瘤细胞，静置预设时间；以预设速度向所述上流体通道、下流体通道注入培养液，灌流培养2～5天，得到肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置。14.如权利要求13所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置的制备方法，其特征在于，所述分别采用细胞外基质对所述上流体通道、下流体通道进行预处理，灌注培养液的步骤包括：将纤粘连蛋白用pbs稀释至预设浓度，得到第一稀释液；将i型胶原蛋白和基质胶用dmem基础培养基稀释至预设浓度，得到第二稀释液；将所述第一稀释液注入所述下流体通道，将第二稀释液注入所述上流体通道，在30～40℃下静置1.5～3h；在所述上流体通道、下流体通道中同时注入培养液；其中，所述培养液为含有8～20v％胎牛血清、0.5～1.5v％青链霉素的dmem完全培养基。15.如权利要求1～9任一项所述的肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置在以下(1)或(2)中的应用：(1)制备、筛选、评价用于治疗肿瘤的药物；(2)筛选、评价用于治疗肿瘤的生物治疗方法。16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述生物治疗方法包括工程细菌治疗法、
溶瘤病毒治疗法或免疫细胞治疗法。

技术总结
本发明公开了一种肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置及其制备方法、应用，涉及生物芯片技术领域。其中，肿瘤细胞-血管内皮细胞体外共培养的装置包括上层芯片、下层芯片和多孔膜，所述多孔膜封接于所述上层芯片和所述下层芯片之间；所述上层芯片设有用于构建肿瘤组织或血管组织的上流体通道，所述下层芯片设有用于构建血管组织或肿瘤组织的下流体通道；所述多孔膜上设有多个通孔，所述上流体通道、下流体通道通过所述多孔膜上的通孔实现流体交换。实施本发明，不仅可对肿瘤细胞和血管细胞进行共培养，且可为抗肿瘤药物的筛选、肿瘤生物治疗方法的开发测试提供良好的基础。物治疗方法的开发测试提供良好的基础。物治疗方法的开发测试提供良好的基础。


技术研发人员：李心怡 温慧 黄术强 刘芳
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/7/20