小麦白粉病相关基因TaWIR1b及其应用

journal,2021,9(4):882-888.；he,h.,liu,r.,ma,p.etal.characterizationofpm68,anewpowderymildewresistancegeneonchromosome2bsofgreekdurumwheattri1796.theorapplgenet134,53–62(2021).)。但已经克隆到的仅有12个(司冠,赵智勇,包海柱等.小麦抗白粉病种质资源现状及抗性基因研究进展[j].宁夏农林科技,2022,63(06):14-20.)，且大多数为核酸结合、富含亮氨酸重复序列(nlr)编码的抗病(r)基因。而r基因经常作为专化性抗性基因来针对特定的病原体(dangljl,horvathdm,staskawiczbj.pivotingtheplantimmunesystemfromdissectiontodeployment.science.2013aug16；341(6147):746-51.)，其直接或间接地识别致病效应子并触发植物免疫(dangljl,jonesjd.plantpathogensandintegrateddefenceresponsestoinfection.nature.2001jun14；411(6839):826-33.)。但由于白粉菌具有易变异进化快等特点，使得专化性抗性基因功能丧失较快，一经广泛推广使用，其抗病性便很快会受到新的变异毒株的破坏。目前我国小麦主推品种中有效或在部分地区有效的抗白粉病基因主要以pm2、pm4、pm21和pm52等少数几个主效基因为主，并且pm2和pm4的一些等位基因在部分地区的抗病性已经逐渐丧失。因此，操纵和破坏感病(s)基因来介导植物免疫，是目前更为有吸引力的选择(olivar,jic,atienza-grandeg,huguet-tapiajc,perez-quinteroa,lit,eomjs,lic,nguyenh,liub,auguyf,sciallanoc,luuvt,dossags,cunnacs,schmidtsm,slamet-loedinih,veracruzc,szurekb,frommerwb,whiteff,yangb.broad-spectrumresistancetobacterialblightinriceusinggenomeediting.natbiotechnol.2019nov；37(11):1344-1350.)。2014年，我国科学家首次运用基因组编辑技术对小麦中的3个mlo同源基因同时进行了突变，获得了对白粉菌极为显著的广谱抗性小麦材料(wang,y.,cheng,x.,shan,q.etal.simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.natbiotechnol32,947–951(2014).)。2022年，高彩霞/邱金龙团队用双重“基因剪刀”创制出tamlo-r32突变体，解决了常规mlo突变体对小麦生长的负面影响，获得了既高抗白粉病又高产的新材料(li,s.,lin,d.,zhang,y.etal.genome-editedpowderymildewresistanceinwheatwithoutgrowthpenalties.nature602,455–460(2022).)。[0004]因此，运用基因组编辑技术实现对易感基因的精准操控，创制出广谱抗病且高产的种质资源，实现更方便、更快捷、超精准的作物育种和改良方案是现阶段更为有吸引力，更有意义的选择。技术实现要素：[0005]本发明的目的在于提供一种小麦白粉病相关基因tawir1b、其表达产物、沉默载体等，并将其应用到小麦白粉病的抗病育种中，以期为培育多抗病基因聚合的小麦品种提供更多选择。[0006]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：[0007]本发明挖掘并得到一种小麦白粉病相关基因tawir1b，其所在小麦基因组核苷酸序列如seqidno:1所示，或其全长cds核苷酸序列为：[0008]a：如seqidno:2所示的核苷酸序列；或[0009]b：由seqidno:2所示的核苷酸序列衍生的具有同等功能的核苷酸序列。[0010]包括在严格条件下与seqidno:2的dna序列杂交且编码控制小麦白粉病相关性状蛋白的dna分子；或与seqidno:2的dna序列具有90％以上同源性及编码控制小麦白粉病相关性状蛋白的dna分子。[0011]本发明提供一种小麦白粉病相关基因tawir1b编码的蛋白，其氨基酸序列为：[0012](1)如seqidno:3所示的氨基酸序列；或[0013](2)在seqidno:3所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除或替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。[0014]本发明还提供鉴定上述小麦白粉病相关基因tawir1b的产品，所述产品包括：[0015]核苷酸序列如seqidno:4所示的上游引物，和[0016]核苷酸序列如seqidno:5所示的下游引物。以及所述引物的试剂或者试剂盒。[0017]本发明又提供了利用上述特异性引物检测小麦白粉病等位基因型的方法，包括如下步骤：[0018]步骤1：ctab法提取待测小麦的基因组dna；[0019]步骤2：以待测小麦的基因组dna为模板，用核苷酸序列如seqidno:4所示的上游引物和seqidno:5所示的下游引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物如seqidno:6所示，然后进行如下判断：[0020]以pcr产物如seqidno:6所示的核苷酸序列为标准，判断从5’端自第一个atg开始的第245位核苷酸是g还是a以确定待测小麦编码的蛋白；其中，g到a类型的碱基变化，即内含子和第二外显子起始位置交接处的碱基突变，造成如seqidno:1核苷酸序列的内含子无法剪切，从而产生内含子保留类型的可变剪接突变，内含子的保留翻译最终导致如seqidno:1核苷酸序列中2000bp之后、从5'端自atg开始在178～180位编码tga而提前终止，其对应等位基因型命名为tawir1b.1；g基因型对应核苷酸序列正常剪切翻译，其对应等位基因型命名为tawir1b.2。[0021]大量表型鉴定结果显示，等位基因型是tawir1b.1的植株对小麦白粉病有良好的抗病能力；而等位基因型是tawir1b.2的植株则表现出对小麦白粉病的易感性；因此，tawir1b.1基因不同等位基因功能的发现将对利用基因工程技术鉴定不同小麦品种白粉病的抗性具有十分重要的作用，同时也有助于小麦抗病育种的遗传和分子生物学的更深入研究。[0022]本发明提供一种鉴定tawir1b等位基因差异位点的组合物，该组合物包括：[0023]核苷酸序列如seqidno:4所示的上游引物，和核苷酸序列如seqidno:5所示的下游引物，以及所使用的限制性内切酶ecorii。并进行如下(ⅰ)或(ⅱ)中所述的判断：[0024](ⅰ)扩增出的核苷酸片段经ecorii酶切后仍为408bp的小麦种质资源(种/系)为tawir1b.1等位基因型，在统计学上其对小麦白粉病的抗病程度显著高于酶切后片段仍263bp的小麦品种质资源(种/系)；[0025](ⅱ)扩增出的核苷酸片段经ecorii酶切后为263bp的小麦种质资源(种/系)为tawir1b.2等位基因型，在统计学上其对小麦白粉病的抗病程度显著低于酶切后片段仍为408bp的小麦种质资源(种/系)。[0026]上述的小麦白粉病病相关基因tawir1b、tawir1b蛋白、鉴定上述小麦白粉病相关基因tawir1b的产品或鉴定tawir1b等位基因差异位点的组合物可以应用于：[0027](1)鉴定或者辅助鉴定小麦抗白粉病性状；[0028](2)小麦抗病育种；[0029](3)小麦遗传图谱构建；[0030](4)小麦种质资源遗传多样性分析；[0031](5)小麦种质资源鉴定。[0032]本发明设计一种由所述基因构建的病毒诱导基因沉默重组(如bsmv-vigs)载体。[0033]扩增沉默片段的引物序列为：[0034]核苷酸序列如seqidno:7所示的上游引物，和核苷酸序列如seqidno:8所示的下游引物，所述重组沉默载体具体可在γ载体(bsmv病毒载体的γ部分)的酶切位点paci和noti之间插入seqidno:9所示的核苷酸序列，得到重组质粒。[0035]进一步将病毒载体和重组质粒进行线性化和体外转录得到不同组分的rna病毒，随后将不同组分rna病毒配置成侵染预混液，分别设置对应处理组和对照组接种小麦幼苗叶片沉默tawir1b基因，以验证此基因功能。[0036]通过运用tawir1b基因沉默重组载体沉默小麦植株中tawir1b基因后，针对沉默后植株表型进行如下判断：[0037]与wt植株相比，沉默植株中小麦白粉病的抗病能力显著增强，表明tawir1b基因在材料中起负向调控作用，此类材料多为小麦白粉病感病材料；[0038]本发明还提供了所述小麦白粉病基因tawir1b在小麦抗病育种中的应用。[0039]与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：[0040]1.本发明首次公开、并确认了一种新的小麦白粉病相关基因，命名为tawir1b，该基因位于小麦5d染色体短臂，其表达的蛋白可调控小麦对白粉病的抗性。[0041]2.本发明明确了小麦白粉病相关基因tawir1b的dna序列、cds序列和编码蛋白序列，为小麦抗病育种的应用实践奠定了技术基础。[0042]3.本发明中的特异性引物和所用限制性内切酶可直接用于小麦白粉病相关基因tawir1b等位基因型的检测，有利于小麦白粉病优异抗源材料的筛选；小麦抗病品种的培育和优异种质资源的创制，能实现在分子水平上早期筛选，节省时间和成本。[0043]4.本发明利用vigs技术首次对小麦白粉病相关基因tawir1b进行沉默，验证了tawir1b基因在小麦白粉病抗病育种中的作用。[0044]5.本发明有助于揭示小麦白粉病的分子遗传基础，同时对利用基因工程技术检测和改良小麦品种起到重要作用，为抗病、安全的小麦新品种选育提供了新途径。附图说明[0045]图1为本发明小麦白粉病全基因组关联分析的manhattan和q-qplots图。a：gwasmanhattan图；b：gwasq-qplots图；c：gwas单倍型分析图。注：chr.5d为小麦5d染色体。[0046]图2为本发明小麦白粉病qtl定位图。注：chr.5d为小麦5d染色体。[0047]图3为定位区段内抗感混池不同接菌处理差异表达基因叶部本底表达水平柱形图。[0048]图4为vigs沉默试验(受体材料为感病亲本中国春)中三个候选基因的相对表达量柱形图及其对小麦白粉病的抗性反应照片。图中左为vigs沉默qrt-pcr图，右为沉默后小麦白粉病的抗性表型图。bsmv:γ0表示接种空载bsmv病毒的对照植株，bsmv:tawir1a/tawir1b/tawir1c表示接种重组载体bmsv-tawir1a、bmsv-tawir1b、bmsv-tawir1c病毒的沉默植株，wt表示不接种bsmv病毒的对照植株。[0049]图5为感病亲本中国春在e09接种处理后基因tawir1b不同时空的表达模式。[0050]图6为据tawir1b等位基因类型开发的dcaps标记酶切结果电泳图。1～4：感病系；5～8：抗病系；9：阴性对照(水)；10：markerd2000；11：marker50bp。[0051]图7为tawir1b基因的单倍型分析结果图。r表示抗病，s表示感病。[0052]图8为tawir1b在不同受体材料(zhou18、xn18、wm208)的vigs沉默试验中基因的相对表达量柱形图。图中zhou18：周麦18；xn18：西农18；wm208：未民208。γ0-zhou18、γ0-xn18、γ0-wm208表示分别以周麦18、西农18、未民208为受体材料的接种空载bsmv病毒的植株。tawir1b-zhou18、tawir1b-xn18、tawir1b-wm208则分别表示以周麦18、西农18、未民208为受体材料接种重组载体bmsv-tawir1b病毒的沉默植株。[0053]图9为tawir1b的vigs沉默试验中不同受体材料(zhou18、xn18、wm208)对小麦白粉病的抗性对比照片。图中左：zhou18：周麦18；xn18：西农18；wm208：未民208。bsmv:γ0表示接种空载bsmv病毒植株，bsmv:tawir1b表示接种重组载体bmsv-tawir1b病毒的沉默植株，图中右：γ0：zhou18、γ0：xn18；γ0：wm208表示分别以周麦18、西农18、未民208为受体材料的接种空载bsmv病毒的植株。tawir1b：zhou18、tawir1b：xn18、tawir1b：wm208则分别表示以周麦18、西农18、未民208为受体材料接种重组载体bmsv-tawir1b病毒的沉默植株。具体实施方式[0054]下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。[0055]在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。[0056]以下实施例中的表型鉴定试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。引物合成及测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。[0057]以下所涉及的小麦材料为：[0058]由163份黄淮麦区小麦品种(系)(表1)组成的自然群体，采用覆盖全基因组的90ksnp芯片(北京康普森生物技术有限公司)进行基因分型，此群体用于全基因组关联分析(gwas)。[0059]表1：163份黄淮麦区小麦材料清单[0060][0061][0062]由中国春和l19杂交产生的包含237个家系的f2：3群体(简称cl群体)用于qtl定位。[0063]中国春：白粉病感病亲本，用于vigs试验筛选候选基因及验证tawir1b基因效应。[0064]周麦18(zhou18)、西农18(xn18)、未民208(wm208)：基因型与表型属高感小麦白粉病材料，用于vigs试验验证tawir1b基因效应。[0065]京双16：小麦幼苗期及成株期均高感白粉病的材料，用于室内白粉菌的扩繁及室内鉴定实验的对照。[0066]实施例一：不同小麦品种白粉病抗性的鉴定[0067]1.供试菌株选择、实验土壤准备[0068]试验所用菌株为布氏白粉菌e09(由中国农业科学院作物科学研究所李洪杰团队赠予)，是当前华北地区白粉病流行高毒生理小种，其显著特点为侵染范围广和致病力强等特点。[0069]试验所用土壤为室内园艺级营养土:蛭石:珍珠岩＝30:1:1，土壤使用前先于121℃、0.1mpa灭菌锅中灭菌1h备用。[0070]2.材料种植及抗性鉴定[0071]病原菌扩繁：采用室内易感宿主寄生的方式进行扩繁，首先将感病对照京双16在光照培养箱中培养至一叶一心期，随后将携带布氏白粉菌e09菌株的小麦叶片摩擦接种至感病对照京双16叶片上，最后在封闭的无其他病原菌的温室中进行培养扩繁。[0072]材料种植及培养：在8cm*8cm方型培养盒中放入180g无菌土，腹沟朝下，按3*4排列均匀摆放12粒小麦，覆土30g，每个处理三次重复，依次放入托盘，每托盘至少保证1盒易感对照(京双16)，底部浇水浸透，置于16h/8h光暗交替，温度25℃/15℃，湿度60～80％环境条件中培养。出苗后3天，观察材料长势，剔除弱势苗，待培养至一叶一心期进行苗期白粉菌接种。[0073]材料调查及评价：接菌后7～10天调查植株叶片表型，按照反应型it：0～4级标准进行鉴定，it＝0(免疫)；it＝0(近免疫)；it＝1(高抗)；it＝2(中抗)；it＝3(中感)；it＝4(高感)。[0074]实施例二：小麦白粉病抗性位点qpm.cl的定位[0075]通过苗期表型鉴定，区分163份小麦品种对小麦白粉病的不同反应型，进一步结合群体90ksnp芯片信息(北京康普森生物技术有限公司)，质控后进行小麦白粉病抗性的全基因组关联分析(gwas)，在小麦5d染色体上鉴定出与小麦白粉病显著相关的snp位点(图1)。进一步利用上述snp位点，对小麦基因组数据库(http://202.194.139.32/)的中国春参考基因组信息进行blast，发现这些snp位点锁定区段位于小麦5d染色体的44,698,893bp至49,019,751bp(≈4.3mb)间。[0076]同时鉴定cl群体及其双亲的苗期小麦白粉病抗性，通过统计分析可知，群体抗性分离符合单基因控制的分离比(f2＝3:1；f2:3＝1:2:1)，具体如表2所示。随后根据clf2:3群体温室的表型数据，挑选极端抗、感家系构建抗感池，利用小麦660ksnp芯片(sunc,dongz,zhaol,reny,zhangn,chenf.thewheat660ksnparraydemonstratesgreatpotentialformarker-assistedselectioninpolyploidwheat.plantbiotechnolj.2020jun；18(6):1354-1360.)对双亲及抗、感混池进行检测，双亲和混池的bsa-seq分析的结果表明：差异snp主要集中在小麦5d染色体上。进而在5d染色体开发10个kasp标记(表3)，对clf2:3群体进行检测，结合该群体的表型数据，利用完备区间作图法在该群体的5d染色体上定位到一个影响白粉病抗性的主效qtl，介于标记cfd81-a010610之间(表4；图2)。对应chinesespringv1.0数据库(http://202.194.139.32/)中44,567,002bp～55,049,899bp约10.5mb的区间。[0077]qtl定位和gwas分析共定位的结果显示，在小麦5ds染色体的44.70mb～49.02mb(约4.32mb)的区间内存在一个抗白粉病主效qtl，命名为qpm.cl。[0078]表2：中国春、l19及其后代群体的白粉病抗性遗传鉴定[0079][0080][0081]表3：kasp标记开发[0082][0083]表4：cl群体qtl[0084][0085]实施例三：小麦白粉病相关基因tawir1b的定位和克隆[0086]参考中国春参考基因组v1.0版本数据库(http://202.194.139.32/)，qpm.cl的共定位区段共有139个注释基因，结合抗、感混池的转录组结果，在共定位区段内筛选到13个差异表达基因，同时结合中国春rna-seq数据库(http://202.194.139.32/)，调取13个差异表达基因的叶部rna-seq数据，以差异表达基因叶部表达水平transcriptpermillion(tpm)值》3且至少在两个对比处理中均有差异表达为筛选标准，进一步筛选到traescs5d02g049200(命名为tawir1a)，traescs5d02g050100(命名为tawir1c)和traescs5d02g050200(命名为tawir1b)三个候选基因并进行下一步的功能验证(图3)。[0087]选用感病亲本中国春作为受体材料，利用vigs技术(表达载体构建及实验操作方法参考实施例五)沉默小麦基因tawir1a、tawir1b和tawir1c，并接种布氏白粉菌e09。结果显示，相较于对照植株wt(未接种病毒的对照植株)和bsmv-γ0(接种空载bsmv病毒的植株)，tawir1a和tawir1c沉默植株白粉病表型并无明显变化，而tawir1b沉默植株的白粉菌侵染程度显著降低(图4)。vigs瞬时沉默试验结果表明tawir1b基因负调控小麦白粉病抗性。[0088]此外在不同时间点对感病亲本中国春接菌(布氏白粉菌e09)处理后，中国春的tawir1b基因的qrt-pcr结果表明：接种布氏白粉菌e0924h后，tawir1b在感病亲本中国春中受诱导上调表达(图5)。因此认为tawir1b是小麦白粉病性状相关基因。[0089]参考ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和ensemblplants(https://plants.ensembl.org)数据库中国春材料基因组，运用primer5软件设计引物扩增此基因的部分序列。pcr扩增引物对的正向引物为核苷酸序列如seqidno:4所示的上游引物，如：5’‑gtaccagattacgctcatatggcgtcccacagtgct-3’，引物对的反向引物为核苷酸序列如seqidno:5所示的下游引物，如：5’‑cagctcgagctcgatggatccttagggctggctacccgc-3’。[0090]利用seqidno:4和seqidno:5所示的引物对小麦中国春的基因组dna进行扩增。结果发现，所得序列与ensemblplants(https://plants.ensembl.org)数据库中的中国春的相应序列一致。pcr扩增体系见表5，pcr扩增程序见表6。[0091]表5：引物对对tawir1b基因部分序列的pcr扩增体系[0092]组分体积2×phantabuffer12.5μldntp0.5μlphantaenzyme0.5μlprimerf0.5μlprimerr0.5μldna1μlddh2oto25μl[0093]表6：引物对对tawir1b基因部分序列的pcr扩增程序[0094]温度(℃)时间循环数95℃5min195℃30s58℃30s3772℃15s72℃5min112℃保温[0095]经测序验证，seqidno:4和seqidno:5所示的引物扩增得到的tawir1b基因的部分序列——seqidno:6序列在抗感材料之间有多态性，其抗病材料从5’端自第一个atg开始的第245个碱基(即seqidno:6的第263个碱基)由g突变为a，形成一个可变剪接突变，抗感材料对应白粉病表型差异明显。因此，seqidno:6所在的全长基因组dna(seqidno:1所示的基因)为小麦白粉病性状相关基因。[0096]实施例四：tawir1b等位基因标记开发及应用[0097]根据seqidno:6所示序列从5’端自第一个atg开始的第245个碱基在不同材料间的g/a分离，开发一个dcaps标记来检测此突变位点，扩增突变位点的特异性引物对包括：[0098]核苷酸序列如seqidno:4所示的上游引物序列5’‑gtaccagattacgctcatatggcgtcccacagtgct-3’和核苷酸序列如seqidno:5所示的下游引物序列5’‑cagctcgagctcgatggatccttagggctggctacccgc-3’。[0099]利用特异限制性内切酶ecorii对扩增产物进行酶切消化，其中，扩增产物中差异位点为a的序列经ecorii酶切后仍为408bp的小麦品种/系命名为tawir1b.1等位基因型，扩增产物中差异位点为g的序列经ecorii酶切后为263bp的小麦品种/系命名为tawir1b.2等位基因型(见图6)，两种基因型对应植株的抗病能力差异明显。[0100]进一步将开发的tawir1b基因的dcaps标记引物对(seqidno:4和seqidno:5所示的引物对)在clf2:3群体中进行检测和验证，结果如表7所示，即群体中tawir1b.1和tawir1b.2两种等位基因分离明显，呈现约3:1的单基因控制的分离比。其对应的小麦白粉病抗病能力差异显著，此标记可作为小麦白粉病tawir1b基因的检测标记和植株抗病能力的辅助选择标记。[0101]表7：cl群体tawir1b等位基因型检测及表型差异[0102]材料等位基因类型数量白粉病反应型l19tawir1b.110中国春tawir1b.214抗病系tawir1b.11731感病系tawir1b.2614[0103]同时对tawir1b基因在480份品种/品系材料(表8)中进行测序，获得357份tawir1b基因的多态性信息，进行基因的单倍型分析，结果显示有14份材料为hapa也即tawir1b.1等位基因型；苗期抗性鉴定显示：hapa也即tawir1b.1等位基因型材料对小麦白粉病有良好抗性，hapb(142份)、hapc(43份)、hapd(158份)为tawir1b.2等位基因型材料，苗期抗性鉴定显示：hapb(142份)、hapc(43份)、hapd(158份)也即tawir1b.2等位基因型材料表现出对小麦白粉菌的易感性，如图7所示，图中hapa、hapb、hapc、hapd是指这个基因在不同材料上的等位基因型，其中第一种基因型(hapa，含有可变剪切位点)和后三种基因型(hapb、hapc和hapd，均不含有可变剪切位点)的白粉病抗性存在显著差异。[0104]表8：480份品种/品系材料清单[0105][0106][0107][0108][0109][0110]实施例五：tawir1b基因在不同受体材料的vigs沉默试验及其表型鉴定[0111]vigs沉默用bsmv病毒载体是由α、β、γ三部分构成，本实施例的γ-wir1b载体指构建的沉默tawir1b序列的γ载体，γ载体指无沉默功能的野生型载体。[0112](1)受体材料的选择[0113]对黄淮麦区的主栽品种进行小麦白粉病苗期表型鉴定，挑选出三个苗期高感小麦白粉病的材料周麦18(zhou18)、西农18(xn18)、未民208(wm208)作为vigs实验的受体材料，进一步验证tawir1b基因的功能。[0114](2)tawir1b基因的vigs载体构建[0115]根据seqidno:2所示的tawir1b基因的cds序列设计引物，分别在正、反向引物的5’端加上保护碱基和酶切位点，形成seqidno:7序列所示的上游引物：5’‑tttttttagctagctgattaattaatcgctctcttcgtcgcca-3’和seqidno:8序列所示的下游引物：5’‑cttccgttgctagctgagcggccgccgtcggaacagcaggga-3’。[0116]利用此引物对扩增tawir1b基因的vigs沉默片段(seqidno:9)并回收备用。[0117]然后将γ载体用paci和noti双酶切，回收γ线性化载体片段，利用同源重组方法完成重组载体构建得到重组载体γ-wir1b(即bmsv-tawir1b)。[0118](3)tawir1b基因在不同材料中的vigs沉默试验[0119]将bsmv病毒载体(α、β、γ)和tawir1b基因沉默重组载体(γ-wir1b)质粒分别酶切线性化，所用内切酶分别为：mlui(α、γ)、spei(β)、bsshii(γ-wir1b)进一步用ribomaxtmlargescalernaproductionsystems-t7试剂盒将线性化的质粒体外转录，获得不同组分的病毒体外转录产物。取体外转录产物α、β、γ/γ-wir1b各2.5μl，按照1:1:1的比例混合并用depc水等体积稀释，取5μl稀释好的混合液加入到90μlfes缓冲液中充分吸打混匀。每次试验设置3组不同处理，分别为：完全空白对照组(wt)、病毒空白对照组(α+β+γ)、和基因沉默组(α+β+γ-wir1b)。[0120]病毒侵染时，在要侵染的植株表面先喷上少量depc水，取8～10μlfes混合液点于干净手套上，从叶片基部到叶尖处摩擦幼苗第二叶叶片3次，摩擦时控制好力度，摩擦完后从上往下喷少许depc水保持湿度，每个处理均需换干净手套操作。病毒接种完后置于23±2℃培养箱中保温保湿避光培养24h，后调为16h/8h光暗周期培养，定期观察并记录表型变化。[0121](4)tawir1b基因在不同受体材料中vigs沉默后表型鉴定[0122]vigs沉默2周后，用qrt-pcr技术检测tawir1b基因在沉默植株(bsmv-tawir1b)和病毒空载植株(bsmv-γ0)中的相对表达情况，结果如图8所示，结果表明在不同的受体材料的沉默植株中tawir1b基因的相对表达量显著下调，基因在不同的受体材料的沉默植株(bsmv:zhou18、bsmv:xn18、bsmv:wm208)中被有效沉默。[0123]进一步对不同受体材料的沉默植株进行白粉病抗性调查，结果显示，tawir1b基因沉默植株叶片表面白粉菌孢子附着明显减少，且菌丝微观图亦显示tawir1b基因沉默植株植株的菌丝发育迟滞及菌丝定殖数量显著减少，抗病能力显著增强(见图9)。[0124]综合来看，tawir1b基因在不同的受体材料中沉默后植株抗病能力显著增强，说明该基因是小麦白粉病响应过程中的一个负向调控基因，且在不同的小麦品种中沉默均能提高植株的抗小麦白粉病的能力，说明了对tawir1b基因功能操纵的广适性。[0125]以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种小麦白粉病相关基因tawir1b，其特征在于，基因tawir1b的全长cds核苷酸序列为如下所示的dna序列：a：序列seq id no:2所示的核苷酸序列；b：与seq id no:2限定的核苷酸序列衍生的具有同等功能的核苷酸序列。2.一种小麦白粉病相关基因tawir1b，其特征在于，基因tawir1b所在小麦品种基因组的核苷酸序列如seq id no:1所示。3.权利要求1或权利要求2所述的基因tawir1b编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为如下（1）或（2）所表示：（1）氨基酸序列如seq id no:3所示；（2）将seq id no:3限定的氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基的替代和/或缺失和/或添加，且与小麦白粉病相关的由seq id no:3衍生的蛋白质。4.鉴定权利要求2所述小麦白粉病相关基因tawir1b的产品，其特征在于，所述产品包括：（1）核苷酸序列如seq id no:4所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no:5所示的下游引物；（2）包含（1）中所述引物的试剂或者试剂盒。5.鉴定权利要求2所述小麦白粉病相关基因tawir1b等位基因差异位点的组合物，其特征在于，包括：核苷酸序列如seq id no:4所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no:5所示的下游引物；以及差异位点特异性核酸内切酶ecorii。6.权利要求1或2所述小麦白粉病病相关基因tawir1b、权利要求3所述的蛋白、权利要求4所述的产品或权利要求5所述的组合物在以下任意一项中的应用：（1）鉴定或者辅助鉴定小麦抗白粉病性状；（2）小麦抗病育种；（3）小麦遗传图谱构建；（4）小麦种质资源遗传多样性分析；（5）小麦种质资源鉴定。7.检测小麦白粉病相关基因tawir1b等位基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取需检测的小麦基因组dna作为模板，用核苷酸序列如seq id no:4所示的上游引物，和核苷酸序列如seq id no:5所示的下游引物进行pcr扩增，随后用特异性核酸内切酶ecorii对扩增出的核苷酸片段进行单酶切，并进行如下ⅰ或ⅱ中所述的判断：ⅰ：扩增出的核苷酸片段经ecorii酶切后为408bp的小麦为tawir1b.1等位基因型，在统计学上其对小麦白粉病的抗病程度显著高于酶切后片段为263 bp的小麦；ⅱ：扩增出的核苷酸片段经ecorii酶切后为263 bp的小麦为tawir1b.2等位基因型，在统计学上其对小麦白粉病的抗病程度显著低于酶切后片段仍为408bp的小麦。8.一种基因tawir1b的病毒诱导沉默重组载体，其特征在于，该病毒诱导沉默重组载体中含有权利要求1或2所述基因tawir1b的病毒诱导沉默的核苷酸片段。9.根据权利要求8所述的一种基因tawir1b的病毒诱导沉默重组载体，其特征在于，所述的沉默重组载体的构建方法，包括如下步骤：
（1）以seq id no:7所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no:8所示的下游引物扩增tawir1b基因的病毒诱导沉默的核苷酸片段并回收：（2）将病毒载体进行双酶切，将回收的tawir1b基因的病毒诱导沉默的核苷酸片段和对应线性化病毒载体片段，利用同源重组方法完成重组载体构建。10.权利要求8所述tawir1b基因病毒诱导沉默重组载体在小麦抗白粉病品种的选育和/或小麦白粉病防治中的应用。

技术总结
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种小麦白粉病相关基因TaWIR1b及其应用。基因TaWIR1b的序列如SEQ ID NO:1所示，以基因TaWIR1b的部分序列SEQ ID NO:6为准，其5'端自第一个ATG开始的第245个碱基是G或A，其中A类型引起内含子保留类型的可变剪接体造成氨基酸翻译的提前终止；本发明提供了小麦白粉病基因TaWIR1b序列、该基因编码的蛋白序列，以及鉴定TaWIR1b基因的特异性引物对，同时开发出了dCAPS标记用于鉴定TaWIR1b不同等位基因类型；本发明还基于上述基因构建了VIGS沉默载体，应用于基因的功能验证。本发明小麦白粉病相关基因的发现、确认及应用不但有助于揭示小麦白粉病的遗传基础，同时对利用基因工程技术改良小麦抗性起到十分重要的作用。麦抗性起到十分重要的作用。麦抗性起到十分重要的作用。


技术研发人员：陈锋 任妍 侯玮秀 刘倜 裴丹 余晓东
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/7/20